产细菌素屎肠球菌的筛选鉴定及其抑菌特性

从采自四川红原的传统发酵酸乳中分离得到308 株疑似乳酸菌,通过96 孔板法初筛和平板打孔法复筛,筛选出1 株具有明显抑菌作用的菌株SC-Y112。通过形态学观察、16S rDNA序列同源性分析和ropA管家基因序列同源性分析结合生理生化实验,鉴定该菌株为屎肠球菌（Enterococcus faecium）。通过排酸及排除H2O2影响后,该菌株的发酵上清液仍具有明显抑菌活性,经蛋白酶处理后,抑菌效果明显消失或下降,说明发酵上清液中的抑菌成分具有蛋白质性质。进一步探究该菌株所产细菌素的生物学特性、遗传稳定性及抑菌特性表明,该细菌素在菌株接种后6 h产生,12 h达到最高;菌株在连续传代86 代内,产细菌素能力较为稳定;细菌素在 pH 3.0～7.0的条件下稳定,在100 ℃处理30 min后仍具有抑菌活性;SC-Y112所产细菌素具有广谱抗菌性,对单核细胞性李斯特菌有明显的抑菌活性。     

产乳酸菌素菌株的筛选鉴定及其特性分析

本实验对广西巴马村天然发酵米粉中的乳酸菌进行分离鉴定,筛选出一株具有抑菌活性的植物乳杆菌M44,并研究了其所产乳酸菌素的基本性质。采用微生物形态学和16S r DNA序列分析法鉴定菌株M44为植物乳杆菌,其发酵上清液具有抑菌活性,抑菌物质确定为蛋白类。采用盐析法粗提所产乳酸菌素,确定最佳硫酸铵沉淀浓度为60%。由乳酸菌素产量与菌株生长的关系实验得出乳酸菌素的最佳收获时间为发酵培养12 h。管碟法抑菌实验表明,该乳酸菌素在p H范围2~8时有良好的抑菌活性;121℃处理15 min后仍具有抑菌活性;胃蛋白酶、胰蛋白酶处理后抑菌性消失;对单核增生李斯特细菌、大肠杆菌、沙门氏菌,金黄色葡萄球菌均有抑制作用。该乳酸菌素为天然生物防腐剂的开发与应用提供了研究基础。     

清酒乳杆菌ZJ220产细菌素的研究

从生鲜牛乳中分离获得1株能够产生抑菌活性物质的菌株,在排除有机酸、过氧化氢的干扰后,该菌发酵上清液仍有明显的抑菌活性。以蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶处理发胶上清液后其抑菌活性消失,试验表明该菌株产生的抑菌活性物质具有蛋白质性质,初步确定为一种细菌素。经生理生化和16S rDNA鉴定该菌为清酒乳杆菌,命名为Lactobacillus sakei ZJ220。细菌素经疏水洗脱、离子交换、凝胶过滤3步法得到纯化。经Tricine-SDS-PAGE分析该细菌素分子质量为6.0 ku。抑菌谱测定结果表明,该细菌素不仅能抑制革兰氏阳性菌,而且能抑制革兰氏阴性菌。经不同酸、热处理,该细茵素仍有较好的抑菌活性。     

新疆传统干酪中1株产广谱细菌素乳酸菌的筛选及其生物学特性

利用牛津杯法从新疆传统干酪中筛选出1株对大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均具有明显抑制作用的乳酸菌。经排除酸、过氧化氢干扰后,此菌株的发酵上清液仍然具有较强的抑菌性。经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后,抑菌活性明显降低,表明其发挥抑菌作用的物质是细菌素。通过对该菌株的生长特性研究和生理生化分析以及16S rRNA基因序列分析,该菌株被鉴定为肠球菌属（Enterococcus sp.）。在酸性条件下,对胃蛋白酶和胰蛋白酶敏感,发酵上清液经高温、尿素、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、吐温-80（Tween-80）处理下抑菌活性仍然保持稳定,为乳酸菌开发作为生物型防腐剂奠定基础。     

戊糖乳杆菌S1-4所产抑菌物质的生物学特性研究

以内蒙古东部地区酸菜中分离得到的具有产抑菌活性的戊糖乳杆菌S1-4为供试菌,以大肠杆菌(Escherichia coli)3301为指示菌,采用双层琼脂扩散法对其所产抑菌物质的生物学特性进行研究。结果表明,戊糖乳杆菌S1-4所产的抑菌物经木瓜蛋白酶处理后,其抑菌活性明显降低,但对胃蛋白酶和胰蛋白酶不敏感。该抑菌物质经热处理后,对大肠杆菌仍保持较强的抑菌活性,在p H3.5~5.5条件下,其抑菌活性较稳定。该菌株的发酵上清液分别经部分化学试剂和紫外线照射处理后,仍保持较好的抑菌活性。     

一株强抑菌活性植物乳杆菌的分离及益生性能研究

以健康黔北黑猪肠道黏膜内容物为原料,采用厌氧罐培养法分离出肠道细菌,结合抑菌试验筛选出其中具有强抑菌活性菌种进行分子生物学鉴定,并对其耐受性及抑菌物质的稳定性进行研究。结果表明,该菌株被鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）,对金黄色葡萄球菌ATCC6538、大肠埃希氏菌ATCC25922和鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028等指示菌具有强抑制作用,其发酵上清液对3种指示菌的最大抑菌圈直径分别约为44.7 mm、23.1 mm和31.8 mm;菌株发酵上清液抑菌物质耐高温,120 ℃处理30 min抑菌活性无显著变化（P＞0.05）;胰蛋白酶处理后,上清液的抑菌圈直径显著减小（P＜0.05）,而过氧化氢酶和胃蛋白酶处理后抑菌圈直径无显著变化（P＞0.05）,表明主要抑菌物质为有机酸和活性肽;菌株经pH 2、0.3%猪胆盐或人工胃肠液处理6 h后存活率分别为0.06%、0.61%、40.80%和25.65%,显示出良好的益生性能。     

1株分泌细菌素屎肠球菌ZJ19的筛选和鉴定

从浙江大学医学院附属妇产科医院的健康初生婴儿粪便中分离获得76株乳酸菌,通过琼脂平板扩散法筛选到1株乳酸菌菌株,该菌不仅对革兰氏阳性菌,如单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑菌活性,同时对大肠杆菌、沙门氏菌、副溶血性杆菌等阴性菌也有较好的抑菌活性。通过排除有机酸、过氧化氢等的干扰后,该菌发酵液离心后的上清液仍有较强的抑菌活性,用蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶分别处理后该上清液均失去抑菌活性,由此确定该乳酸菌产生的抑菌活性物质具有蛋白质属性,为1种细菌素。该细菌素具有热稳定性,在pH 3.75,121℃热处理30 min,抑菌活性仍保持在80%以上。经过生理生化试验和16S rDNA序列分析,鉴定菌株为屎肠球菌,命名为Enterococcus faecium ZJ19。     

产广谱细菌素乳酸菌的筛选

从四川传统发酵食品、市售酸奶、自制泡菜、香肠中分离出267株乳酸菌,采用平板挖井法从中筛选了64株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、铜绿假单胞杆菌、枯草芽孢杆菌有抑制作用的广谱抑菌性乳酸菌菌株,再对这些乳酸菌采用牛津杯抑菌实验,排除酸、过氧化氢干扰后,部分菌株的发酵上清液仍有很强的抑菌作用;进行胰蛋白酶、木瓜蛋白酶处理后,发酵上清液抑菌活性降低,因而确定产生的抑菌物质为蛋白质类细菌素。     

产抗菌肽肠球菌的筛选及其抗菌肽生物学性质

利用牛津杯琼脂扩散法从新生儿粪便中筛选到一株产广谱抗菌肽的乳酸菌菌株,经菌体形态观察、生理生化分析、全自动微生物基因指纹鉴定系统和16S r DNA序列分析确定该菌株为屎肠球菌(Enterococcus faecium)。经过氧化氢酶处理后,发酵上清液仍具有抑菌活性,而胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K处理后,抑菌活性基本消失,说明该抑菌物质为蛋白类似物,即抗菌肽。该菌株所产抗菌肽在p H2.0~5.0范围内保持活性,45~100℃处理1 h后抑菌活性基本不变。发酵液中的抗菌肽经液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)和数据库APD比对得出3条不同的抗菌肽氨基序列,具有重要的研究价值。     

1株产细菌素乳酸菌的鉴定及所产细菌素的诱导合成现象

从发酵大蒜中筛选到一株具有抑菌作用的菌株Br26,通过用不同蛋白酶处理判断该菌株是否为细菌素产生菌。随后,通过分析自身发酵上清液与其他乳酸菌对细菌素合成的影响,探讨该细菌素的诱导合成现象。结果表明：菌株Br26的发酵上清液经胃蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后抑菌活性降低,确定该菌为细菌素产生菌,经16S rDNA鉴定为Weissella sp. Br26。Weissella sp. Br26在42 ℃、1/4 MRS培养时,细菌素抑菌活性消失,而当添加不同生长时期的发酵上清液时,抑菌活性显著增加,表明该细菌素可进行自我诱导。另一方面,Weissella sp. Br26与卷曲乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌和肠膜明串珠菌的活菌共同培养后,发酵液pH值未有明显变化,但细菌素抑菌活性显著增加,表明细菌素的合成亦可受其他乳酸菌的诱导。综上,Weissella sp. Br26细菌素的合成是受自身发酵液及其他菌诱导调控的。     

泡菜中产细菌素菌株的分离及细菌素性质的初步研究

从四川泡菜中分离得到一株产细菌素的菌株,经形态学、生理生化鉴定等试验,初步鉴定此菌株为乳酸菌。对其所产细菌素做温度、pH、蛋白酶的敏感性试验,实验结果表明,发酵上清液中的抑菌物质对胃蛋白酶、木瓜蛋白酶较敏感,菌株所产细菌素在高温(121℃20min)和酸性条件(pH 3.0～5.0)下均有较强的抑菌活性,可以较好地抑制革兰氏阳性、阴性菌,筛选得到的菌株所产细菌素是一类具有广谱抑菌活性的细菌素。     

拮抗阪崎肠杆菌乳酸菌的筛选鉴定及抑菌特性

阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）是引起新生儿败血症、脑膜炎和坏死性小肠结肠炎的条件致病菌,感染后死亡率高达80%。实验采用双层琼脂扩散法从淡水鱼肠道（19 株）和泡菜（7 株）中筛选出1 株来源于鲤鱼肠道的对Enterobacter sakazakii（106 CFU/mL）具有较强拮抗作用的乳酸菌菌株LY-4。结果表明,抑菌活性物质存在于乳酸菌无细胞上清液（cell free supermatant,CFS）中,抑菌最佳培养时间为28 h。CFS经胃蛋白酶处理可完全丧失抑菌活性,中性蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后抑菌活性降至76.44%和54.38%,对α-淀粉酶不敏感;在pH 3.0～4.5范围内保持抗菌活性稳定;经40～80 ℃范围内处理2 h后其拮抗活性基本不变,100 ℃和121 ℃处理2 h后活性降至79.57%和75.71%。初步判定菌株LY-4产生的抑菌物质为非糖基化类细菌素,并筛选出初步纯化抑菌物质的最佳萃取剂为乙酸乙酯,粗提物的最小抑菌浓度为6.0 mg/mL。经生理生化和16S rDNA鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。     

产细菌素植物乳杆菌菌株的筛选及其细菌素生物学特征研究

从甘蓝泡菜中分离到６９株乳酸杆菌,通过琼脂点扩散交叉拮抗试验,筛选出３株有明显抑菌活性代谢产物的植物乳杆菌。排除酸、过氧化氢等干扰因素后,离心发酵液对指示菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ９６Ｄ仍有抑菌作用,用胰蛋白酶对其透析液处理后活性丧失,说明它们产生的抑菌物质是细菌素。以Ｇ８菌株为试材,对其细菌素类物质的产生及细菌素粗提物进一步研究,发现在对数末期其抑菌活性最高,对热相对稳定（１００℃,２０ｍｉｎ）,易被胰蛋白酶、蛋白酶Ｋ和胃蛋白酶失活,显示活性的ｐＨ值范围为４．０～５．５,粗提液表现为不仅抗明串株菌属、片球菌属、乳杆菌属的一些菌株,而且抗一些非乳酸菌的革兰氏阳性菌,但对大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等革兰氏阴性菌没有任何抑制作用。说明Ｇ８菌株产生的是一类抗广谱革兰氏阳性菌的细菌素     

Streptococcus thermophilus 580 produces a bacteriocin potentially suitable for inhibition of Clostridium tyrobutyricum in hard cheese

A strain of Streptococcus thermophilus that inhibits Clostridium tyrobutyricum has been isolated from raw milk. The active compound produced disappears after a treatment with protease. However, unlike most bacteriocins, it is not thermoresistant, and the activity is completely lost after 1 h at 60 degrees C. Its inhibitory spectrum is limited to other thermophilic streptococci, Brochothrix, and sporulated gram-positive rods. So this bacteriocin could be different from those already described. This bacteriocin-producing strain could be used in thermophilic starter for hard cheese making because the bacteriocin is not active against thermophilic lactobacilli. It is produced in M17 medium during the decreasing temperature phase of the hard cheese-making process temperature cycle and is also produced in milk. Moreover, when Streptococcus thermophilus was cocultured with a Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis starter strain, it seems to enhance the bacteriocin production. However the level of activity always decreases drastically during the stationary phase. But inhibition of Clostridium tyrobutyricum spores can be obtained in small-scale curds.     

浓香型窖泥中高产细菌素乳酸菌的鉴定及特性

以双层琼脂扩散法从浓香型窖泥中筛选出1株(LP16)具有高抑菌活性的菌株,研究其代谢产物在窖泥中的作用。结果表明:经形态观察、生理生化试验和16S rRNA鉴定出菌株LP16为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei);其发酵上清液在排除有机酸、过氧化氢干扰后仍有明显抑菌效果,而经胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶处理后残余抑菌率分别为40.43%、43.48%、47.83%和51.30%,抑菌活性部分丧失,说明抑菌成分包含蛋白属性的细菌素;菌株LP16所产细菌素分别经高温、低pH(pH<5)、紫外线照射、表面活性剂处理均能保持抑菌活性,且在pH2~10范围内具有pH耐受性;抑菌谱较广,对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及部分乳酸菌有明显的抑制作用,但对霉菌和酵母菌无抑制作用。因此在浓香型白酒生产中该菌产生的细菌素不仅能抑制病原菌的生长,也能控制乳酸的过多生成。     

肉源乳酸菌抑菌特性分析

为了筛选有抑菌活性的乳酸菌并分析其抑菌的物质基础,利用牛津杯琼脂扩散法,分析了19株从牧区风干肉制品中分离得到的肉源乳酸菌发酵上清液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力,同时从中分别选取对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制能力有显著差异的乳酸菌各3株,对其上清液中的抑菌物质基础和抑菌能力影响因素进行了分析。结果表明19株乳酸菌中菌株F19对大肠杆菌的抑菌活性最强,抑菌圈直径为(15.07±0.55) mm,而F11发酵上清液对大肠杆菌完全没有抑制效果,菌株F16对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强,抑菌圈直径为(14.47±0.38) mm,而F6、F2发酵上清液对金黄色葡萄球菌完全没有抑制效果;抑菌的物质基础分析表明,酸性环境在抑菌过程中占主导地位,细菌素与过氧化氢发挥协同作用;对其发酵上清液进行不同pH以及不同温度处理后发现,其抑菌活性在pH<5.0时随pH的降低而显著增强(P<0.05),当pH分别升高至5.0、6.0、7.0时试验乳酸菌发酵上清液均不具有抑菌能力,F18发酵上清液分别在60、80、100、121 ℃热处理一定时间后其抑菌能力与对照组相比仍然无明显差异(P>0.05),F11发酵上清液在100 ℃热处理30 min后抑菌能力显著减弱(P<0.05),其余实验菌株发酵上清液温度达到60 ℃以上,抑菌能力随热处理温度提高而显著(P<0.05)下降。本研究发现了乳酸菌发酵上清液的抑菌效果具有特异性,抑菌物质主要是酸性物质,其次是细菌素和过氧化氢;抑菌能力受pH和温度影响,同时具有特异性。研究结果可为优质菌种资源开发提供理论指导与技术支持。     

产细菌素苏云金芽孢杆菌的鉴定及其所产抗菌物质性质

从腌制蔬菜表面分离到一株产细菌素的菌株K2,其中和后的无细胞发酵液主要抑制革兰氏阳性细菌,特别是对芽孢杆菌有强烈的抑制作用。发酵上清液经硫酸铵盐析和透析后,仍然有很强的抗菌活性,并对多种蛋白酶敏感,表明抗菌活性物质为蛋白类物质。通过形态培养特征、生理生化特征、16S rDNA 序列比对及系统发育分析,鉴定菌株K2 是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。菌株K2 产生的抗菌物质在pH6～9 条件下80℃处理30min 仍保持稳定的抗菌活性,其对敏感菌的作用主要是杀菌,而且对芽孢萌发有很好的抑制作用。该抗菌物质在菌体生长对数中期产生,在稳定期中期抗菌活性达到最大。