重组酶聚合酶快速扩增法测定瓶(桶)装水中铜绿假单胞菌

目的建立重组酶聚合酶扩增法(recombinasepolymeraseamplification,RPA)检测瓶(桶)装水中铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的分析方法。方法通过基因组DNA提取、RPA扩增反应方法对样品进行检测。结果该方法能够在20 min内特异地检测出铜绿假单胞菌,方法检出限为10 pg/μL铜绿假单胞菌基因组模板,对人工污染的水样最低检出限为36 CFU/mL,且重复性良好。结论本研究建立的RPA检测方法能特异、准确、高效地检测出铜绿假单胞菌,而且操作简单、耗时短,为瓶(桶)装水中铜绿假单胞菌的快速诊断提供技术参考。     

纺织品中铜绿假单胞菌快速检测方法研究

探讨纺织品中铜绿假单胞菌的快速检测方法。将免疫磁珠富集技术和环介导等温扩增技术结合起来,利用免疫磁珠富集技术富集样品中铜绿假单胞菌,富集液提取DNA,进行环介导等温扩增技术特异扩增。以49株铜绿假单胞菌菌株和21株非铜绿假单胞菌菌株测定特异性,以49株铜绿假单胞菌阳性菌液稀释成不同梯度测试灵敏度。结果表明:该方法特异性、灵敏度符合要求,检测限可达4.5CFU/mL,且简化了测试流程,使检测时间显著缩短。认为:所建立的纺织品中铜绿假单胞菌快速检测方法鉴别准确、快速,尤其适用于基层检验、检疫机构。     

环介导等温扩增技术快速检测椰毒假单胞菌的研究

建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测椰毒假单胞菌的方法.根据公布的椰毒假单胞菌16S～23SrRNA基因序列设计引物,建立了LAMP反应体系,在此基础上检测了蜡样芽孢杆菌菌液和人工污染蜡样芽孢杆菌的银耳样品,并将LAMP法与PCR法进行比较.结果表明,LAMP检测方法具有较高的特异性和敏感性,椰毒假单胞菌的检出限为5.4CFU/mL,是PCR方法检测灵敏度的1000倍,人工污染银耳样品中的椰毒假单胞菌的检出限为76CFU/g,样品中椰毒假单胞菌的检测过程(包括DNA提取、LAMP和电泳)可在2h内完成,因此LAMP可以简便快速有效地检测食品中的椰毒假单胞菌.     

冷却猪肉不同前处理对细菌DNA提取及PCR-DGGE的影响

比较研究冷却猪肉不同前处理对细菌DNA 提取及PCR- 变性梯度凝胶电泳(DGGE)的影响。冷却猪肉4℃贮藏至第5 天时,分别采用冻融、超声、摇床和匀浆前处理后,提取细菌DNA,进行Dilution-PCR 和DGGE 分析。结果表明,不同前处理方法所制备的DNA 量稍有差别,但对PCR-DGGE 结果无显著影响,故可根据实际情况选择上述不同前处理方法。同时对16S rDNA V3 区的DGGE 图谱进行割胶测序,检测到腐败菌主要是假单胞菌属,其他还有不动杆菌属、环丝菌属和沙雷氏菌属。     

重组酶介导等温扩增法检测食品中铜绿假单胞菌

目的 建立重组酶介导等温扩增（Recombinase-aided amplification,RAA）法,快速、灵敏、特异检测食品中铜绿假单胞菌的分析方法。方法 针对铜绿假单胞菌lasB基因的特异性保守区域,设计RAA特异性引物和exo探针,筛选出最优组合;对提取的目标基因组DNA进行检测,确定方法的特异性和灵敏度,并通过人工污染实验,比对不同检测方法对食品样品的检出限。结果 建立的铜绿假单胞菌lasB基因RAA检测方法特异性良好,仅对铜绿假单胞菌有扩增曲线,对其他致病菌无交叉反应;方法对纯菌液的灵敏度为1.7 pg/μL。人工污染实验表明,方法对肉类样品中铜绿假单胞菌的检出限与传统方法一致,达1.0×103 CFU/mL;RAA方法检测时间仅需20min。结论 本研究建立的铜绿假单胞菌实时荧光RAA检测方法特异性强、灵敏度高、反应时间短,可用于食品中铜绿假单胞菌的快速检测。     

苯乳酸对荧光假单胞菌基于细胞膜损伤和DNA破坏的双靶位抑菌机制

荧光假单胞菌是导致冷藏食品腐败变质常见的嗜冷菌,抑制荧光假单胞菌的生长繁殖对延长冷藏食品货架期和提高食品安全性具有重要意义。本实验通过测定最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）和时间-抑菌曲线考察苯乳酸对荧光假单胞菌的抑菌活性,从细胞膜电势、细胞膜渗透性和完整性、细胞超微结构、蛋白质表达和DNA结构等方面研究苯乳酸对荧光假单胞菌的抑菌机制。结果表明：苯乳酸对荧光假单胞菌的MIC为1.25 mg/mL;苯乳酸可导致细胞膜电势消散,且消散程度呈剂量依赖性;苯乳酸可导致细胞内钾离子显著泄漏（P＜0.05）,增加细胞膜的渗透性;MIC苯乳酸处理菌体0.5 h后,流式细胞术分析结果显示,碘化丙啶沾染率为57.6%,扫描电子显微镜结果显示,部分菌体破裂,表明苯乳酸可以破坏细胞膜完整性;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明苯乳酸对蛋白质表达无明显影响;凝胶阻滞电泳与荧光光谱结果显示苯乳酸可以破坏DNA结构。结论：苯乳酸可以通过损伤细胞膜和破坏DNA发挥双靶位抑菌作用,苯乳酸对荧光假单胞菌抑菌机制的阐释结果可为冷藏食品中嗜冷菌的控制以及苯乳酸在食品中的应用提供理论依据。     

基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测包装饮用水中铜绿假单胞菌

目的 建立一种基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测方法。方法 针对选择铜绿假单胞菌gyrB基因设计特异性引物和探针。250mL水样经膜过滤后经过短时培养(36℃、4 h),优化提取菌体DNA流程,预冻干聚合酶链式反应预混液,采用实时荧光聚合酶链式反应进行检测。结果 样品中铜绿假单胞菌量为≥1 CFU/250 mL时,检测结果均呈阳性,整个检测用时6 h左右。该方法检测结果与国家标准方法(GB8538—2022)检测结果一致。结论 该方法特异性强、灵敏度高、用时短,可为预包装饮用水中铜绿假单胞菌监管和生产企业质控提供更为快速、精准的技术手段。     

铜绿假单胞菌实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增方法建立及应用

目的建立一种快速检测铜绿假单胞菌的实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增(real-time RAA)方法。方法基于铜绿假单胞菌ecfX基因设计特异性引物和exo探针,通过灵敏性、特异性和疑似菌株检测评估所建立方法的有效性。结果 Real-time RAA方法在39℃等温条件下反应20 min即可实现对铜绿假单胞菌的有效检测;特异性强,仅对铜绿假单胞菌出现特异性扩增;灵敏性高,对铜绿假单胞菌基因组DNA的检出限为3.0×10~3 fg/反应,对纯培养铜绿假单胞菌的检出限为1.0×10~3 CFU/反应。应用所建立的real-time RAA方法对分离的36株疑似铜绿假单胞菌进行检测,结果均为铜绿假单胞菌,同VITEK 2 Compact生化鉴定方法和real-time PCR方法结果一致。结论本试验所建立的real-time RAA方法反应快速、操作简单、可靠性高,可用于不同来源的铜绿假单胞菌的快速检测和鉴定。     

水体中基因组提取方法的比较及水体中铜绿假单胞菌检测技术的研究

以河水为研究对象,采用沸水浴法、SDS法、CTAB法、酚氯仿法和改良法提取河水中的基因组,对提取效果进行比较,确定出最佳提取方法;并利用传统培养法和分子生物学方法对人工污染样品中的铜绿假单胞菌进行检测,对两种方法检测结果进行比较;最后实验利用4种自然界水体验证了分子生物学方法的准确性。结果表明加入溶菌酶的酚氯仿法对河水中的DNA提取效果最好;传统培养法和分子生物学方法检测结果一致,且分子生物学方法比传统培养法节省一半左右的时间;用分子生物学方法可以检测出自然界水体中的铜绿假单胞菌。     

食品中铜绿假单胞菌实时荧光PCR检测的研究

根据铜绿假单胞菌外毒素A基因片段序列,用Primer express 3.0设计一对特异性引物和一个Taq Man探针,建立铜绿假单胞菌实时荧光PCR检测方法。通过对梯度含量的铜绿假单胞菌标准菌液样品DNA和多种细菌的DNA进行实时荧光PCR检测,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。试验结果表明,只有铜绿假单胞菌产生扩增曲线,其他细菌无扩增,说明引物及Taq Man探针特异性较好,检测灵敏度为1×10~3 CFU/m L。该方法具有很好的研究价值和应用前景。     

Qualitative and quantitative identification of adulteration of milk powder using DNA extracted with a novel method

The extraction of high-quality DNA from processed dairy products is often the crucial step in an authentication process by PCR-based methods. In this study, we optimized a novel DNA extraction method for milk powder and used the extracted DNA for identification of milk powder based on PCR analysis. The DNA quality was assessed by amplifying target sequences from mitochondrial genes, as well as by monitoring the yield, purity, and integrity of the extracted DNA. In addition, a laboratory adulteration model of milk powder was detected by PCR-based methods (PCR and real-time PCR) using primers targeting the mitochondrial 12S rRNA gene. Results showed that a sufficient amount and quality of DNA could be isolated from milk powder with this method. Both PCR and real-time PCR detection of cow milk compositions in goat milk powder further confirmed the DNA extracted with this extraction method could be widely used in addressing milk powder adulterant by a PCR-based method.     

微波提取苹果汁中脂环酸芽孢杆菌DNA的PCR检测方法研究

根据Genbank公布的酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T)鲨烯环化酶序列自行设计一对引物,利用微波技术直接从果汁样品中提取目标菌DNA,对引物特异性、微波法提取DNA的扩增效果及检测灵敏度进行探讨。结果表明：微波功率1000W、处理时间30s、经5000r/min离心2min即可获得酸土脂环酸芽孢杆菌基因组DNA,所得模板质量符合聚合酶链式反应检测要求,目的条带清晰,检测时间仅为2h,检测限为200CFU/mL,有望真正应用于苹果汁生产的在线检测。     

鱼翅类食品中鲨鱼成分PCR鉴定方法研究

本文针对鱼翅中的鲨鱼成分进行检测鉴定开发了一种快速灵敏的PCR检测方法,可检测鱼翅类食品中是否存在鲨鱼成分。根据鲨鱼线粒体的细胞色素亚基I基因序列设计了鲨鱼特异性引物,扩增长度为228 bp;为了评价方法的特异性,将设计的引物分别针对22份鱼翅样品DNA和37种其它种类DNA进行PCR检测,结果显示,只在鲨鱼鱼翅中能检测出特异的228 bp条带,其它37种物种中均无条带检出。为了评价方法的灵敏度,将鱼翅DNA中掺入了不同比例土豆DNA的样品采用本方法进行了PCR分析,显示方法可检测灵敏度为0.1%(m/m)。随机抽取45份不同类型的鱼翅样品,检测出22份鲨鱼翅均含鲨鱼成分,而21份仿鱼翅均不含鲨鱼成分而含有植物成分。该样品前处理方法、DNA提取方法以及PCR检测方法可广泛应用于食品中鲨鱼成分检测鉴定。     

甜菜叶片组织快速制备DNA的方法

通过试验，获得用叶片组织制备甜菜DNA的方法。利用液氮或冷冻研磨直接捣碎叶片组织，提取DNA，该方法简单，易操作，所获DNA纯度较高，可直接用于PCR扩增分析，实验效果较好。     

腊肠中的植物成份的PCR检测方法研究

本文建立了应用PCR技术鉴别腊肠中植物成分的方法.通过前处理与酚仿抽提DNA的方法相结合,建立了一种快速简便的从腊肠中提取DNA的方法,整个DNA提取的过程时间为2 h左右,提取的DNA浓度和A260/A280均达到了PCR的要求.通过PCR分析,发现从腊肠中提取DNA完全可以进行PCR检测,并且该方法可定性检测腊肠中的植物成分.     

氨基化二氧化硅颗粒应用于大豆油DNA提取研究

建立了以氨基化二氧化硅为载体提取大豆油DNA并进行转基因成分检测的方法。结果表明：利用氨基化二氧化硅法富集提取大豆毛油中的DNA质量浓度高于国标法;以氨基化二氧化硅法提取的大豆毛油DNA为模板成功扩增出了大豆内源基因、外源基因片段和转基因调控元件,而精炼油DNA未扩增出。氨基化二氧化硅法只适用于大豆毛油DNA的提取,而不适用于精炼油。     

PCR 检测牛乳中大肠杆菌基因组DNA 的提取方法

为获得一种适于牛乳样品大肠杆菌PCR 检测的基因组DNA 提取方法,对饱和酚法、CTAB 法、试剂盒法及溶剂裂解法等4 种提取方法加以比较,通过考察DNA 的纯度、定量分析以及PCR 分析,确定一套有效、快速、适合牛乳中提取大肠杆菌的基因组DNA 方法--溶剂热裂解法。结果显示该方法提取的DNA 模板,适于PCR扩增大肠杆菌DNA,可以用于牛乳中的大肠杆菌检测。     

基于磁性纳米粒子的粮油制品真伪鉴别技术研究

通过PCR检测食用油中内源性DNA是鉴定食用植物油品种真实属性,检测食用油掺假的一种有效方法。然而由于精炼的食用油中DNA含量极低,如何有效富集食用油中的DNA是实现PCR鉴别粮油的关键。因此,作者研究了磁珠法富集食用油中的DNA并通过实时荧光PCR检测芝麻油、菜籽油、稻米油的内源基因。结果表明经过5次乳化后和磁珠进一步富集水相中的DNA,实时荧光PCR成功检测到了食用油中的内源性基因,琼脂糖凝胶电泳分析进一步证明实现了上述3种食用植物油的定性鉴定。     

PCR法检测大豆加工食品中的转基因成分

通过分子生物学手段,以聚合酶链式反应(PCR)技术为基础,建立了检测大豆加工食品中转基因成分的方法。实验分别采用CTAB法和试剂盒(Kit)法对大豆锅巴、豆浆、豆奶粉、豆腐、豆腐丝等五种大豆加工食品中的DNA进行了提取,用内标基因Lectin对此两种方法的提取效果进行了比较,并以提取的DNA为模板,利用不同的引物分别对目标基因35S和NOS进行了PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明:Kit法的DNA提取效果优于改良CTAB法,上述五种大豆加工食品中均检测出35S启动子和NOS终止子,且均含有转基因成分。     

动物源性食品鸭血、猪血DNA提取及多重PCR鉴别研究

目的:研究从鸭血、猪血中提取DNA的快速简便方法并建立多重PCR鉴别方法。方法:用KI提取法从固体块状鸭血、猪血中提取DNA,经PCR扩增检测提取效果。建立多重PCR方法鉴别动物源性食品中的鸭血、猪血成分,并对市售动物源性血制品进行检测。结果:这种方法提取到的DNA纯度较高,凝胶电泳条带整齐,背景清晰;PCR反应能扩增出目的条带。多重PCR能同时扩增出鸭和猪的条带。结论:这种改进的DNA抽提方法能获得高纯度DNA,比传统方法安全、简便、节省试剂,PCR扩增结果很好,应用多重PCR方法能同时检测出血样制品中的鸭、猪成分。