副溶血性弧菌实时荧光定量PCR标准模板的构建和检测方法的建立

目的:构建肉制品副溶血性弧菌实时荧光定量PCR的标准阳性模板和检测方法.方法:以副溶血性弧菌toxR基因上特异性片段为目标,设计并合成引物及Taqman探针,将目标片段连接到PGM-T载体上构建重组质粒,建立实时荧光定量检测体系,并考察方法的灵敏性、特异性、重复性和准确性.结果:构建出副溶血性弧菌荧光定量PCR检测方法的标准模板并建立了相应的检测方法,获得的标准曲线方程为:Y=-3.151 lgX+42.86,灵敏度40copies/反应体系,对副溶血性弧菌具有特异性,同时,该方法具有良好的重复性,变异系数小于5％.结论:使用基于Taqman探针技术的荧光定量PCR检测方法能够对食品中致病性副溶血性弧菌进行快速、简便、准确、高效的定量检测.     

沙门氏菌invA基因重组质粒标准的构建

目的 研制沙门氏菌invA基因重组质粒,为分子生物学方法快速检测沙门氏菌提供质粒标准。方法 通过PCR扩增目的片段,连接至pMD 18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,测序方法证实目的片段已成功重组,荧光定量PCR方法定性检测分析,采用PicoGreen DNA分子荧光定量方法对标准质粒分子进行定值。结果 invA基因目的片段成功重组至pMD 18-T载体上,荧光定量PCR结果显示制备重组质粒标准为沙门氏菌核酸标准,重组质粒标准的浓度为2.9 μg/mL。结论 成功构建沙门氏菌invA基因重组质粒,为快速检测沙门氏菌奠定了基础。     

2种食源性致病菌多重荧光PCR检测方法的建立

文章旨在建立一种可同时快速检测食品中沙门氏菌和副溶血弧菌的TaqMan双重荧光定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)检测方法。分别针对沙门氏菌的inv A基因和副溶血弧菌的tlh基因序列的保守片段,设计了特异性检测引物和探针,并优化其使用浓度及反应退火温度,建立双重荧光定量PCR检测体系,并对方法的灵敏度、特异性及稳定性进行评估。结果显示：建立的双重荧光定量PCR检测法可特异性扩增沙门氏菌和副溶血弧菌,其他菌株无扩增。沙门氏菌检测灵敏度最低检测值可达1 copies/μL,副溶血弧菌检测灵敏度为10 copies/μL。批内批间变异系数均<2%,重复性和稳定性较好,与传统方法检测结果一致,检测时长大幅度缩短。综上表明,建立的双重荧光PCR检测方法能够快速、准确地检测出食品中沙门氏菌和副溶血弧菌,为食品中食源性致病菌的快速检测提供技术支持。     

磁分离结合qPCR快速检测酱卤肉中的沙门氏菌

验证噬菌体磁分离结合实时荧光定量聚合酶链式反应,快速检测方法对食品中沙门氏菌的检测效果。以一株鼠伤寒沙门氏菌的特异性噬菌体T102为分子识别元件,首先将其与羧基化磁珠偶联,制备获得噬菌体磁性颗粒（Phage T102 Magnetic Beads）复合物,利用噬菌体磁性颗粒复合物从食品中特异性分离富集沙门氏菌,然后利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测富集后的沙门氏菌。该沙门氏菌快检方法检出限为100 CFU/mL（0.1 CFU/PCR）,线性范围为1×102~1×109 CFU/mL,变异系数2.1%,特异性强,检测时间为6 h。实验选取300批食品安全抽检样品与GB 4789.4-2016标准《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》进行比对,均未检出阳性样品,结果一致。该方法可为噬菌体偶联纳米磁珠在食源性致病菌检测领域的应用提供参考依据。     

定量检测食品中榛果过敏原成分

定量检测食品中过敏原榛果过敏蛋白,构建目的基因的标准品及标准曲线。以榛果的DNA为模板,针对油体蛋白基因设计引物进行PCR扩增,构建质粒,经鉴定测序,用荧光定量PCR制作标准曲线。成功克隆油体蛋白目的基因片段,并以此为标准制作出荧光定量PCR标准曲线,线性关系良好,灵敏度高,检测限低于10个拷贝,特异性强,准确可靠。成功建立荧光PCR方法定量检测食品中过敏原榛果成分,构建油体蛋白基因的标准品及标准曲线。     

多重荧光定量PCR检测食品污染菌

目的:建立食品中多种细菌同时检测的方法。方法:以肠杆菌科细菌16S RNA、金黄色葡萄球菌FemB基因以及和沙门氏菌的invA基因为目标,设计相应的引物和Taqman探针;分别构建重组质粒作为模板,并建立3种菌属各自荧光定量PCR检测方法和多重荧光PCR体系,考察各方法的灵敏性,并比较多重荧光PCR与单重体系下检测结果的一致性。结果:多重荧光PCR体系与单重体系具有很好的一致性。结论:多重荧光定量PCR能够实现在同一反应体系下同时对食品中多种污染菌进行准确快速的检测。     

实时荧光定量PCR技术快速检测志贺氏菌

目的 建立实时荧光定量PCR法快速检测志贺氏菌。方法 提取志贺氏菌基因组为模板扩增virA基因片段, 将目的片段连接至pMD19-T载体得到重组质粒, 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 验证所得到的重组质粒, 以紫外分光光度计测量重组质粒吸光度值A260, 并换算为质粒拷贝数后作梯度稀释得到不同浓度的质粒标准品; 进行荧光定量PCR分析并通过特异性、灵敏性实验以验证该方法的可行性。结果 重组质粒标准品浓度在103~108 copies/μL范围内线性关系良好(r2>0.99), 实时荧光定量PCR检测志贺氏菌时出现良好的扩增曲线, 鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均未出现扩增曲线。志贺氏菌的检出限为100 CFU/mL。 结论 本方法便捷、高效、可靠, 可用于志贺氏菌的快速定性定量检测。     

水质中大肠杆菌荧光定量PCR检测方法的建立及应用

[目的]建立迅速、特异的水质中大肠杆菌群荧光定量PCR检测方法。[方法]根据Genbank中大肠杆菌保守的uida基因序列,设计特异性引物,扩增并构建重组质粒作为标准品。同时设计荧光定量PCR引物,优化荧光定量PCR定量反应体系,建立水质中大肠杆菌的绝对定量方法。[结果]成功地构建了含uida基因的重组质粒,利用标准质粒为参照,分别对不同来源的水质进行检测,成功检出每微升水质中大肠杆菌的基因拷贝数,且方法具有特异性好、重复性高的特点。[结论]初步建立水质中大肠杆菌的荧光定量PCR检测方法,可为饮用水中大肠杆菌迅速检测,包括污染源头诊断的标准方法的确立提供依据。     

荧光定量PCR检测家蚕核型多角体病毒的研究初探

本文选用家蚕核型多角体病毒的单拷贝基因DNA聚合酶作为检测靶标,构建含有DNA聚合酶基因片段的质粒载体,作为标准品,试图运用荧光定量PCR技术对该病毒进行定量检测,以便于以后深入对病毒感染机制进行研究。试验结果初步证实,所构建的重组质粒可作为标准品用于荧光定量PCR试验,实时检测病毒在宿主中的数量。     

肉制品中沙门氏菌invA基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

针对沙门氏菌invA基因设计一对特异引物,建立SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性检测。结果表明,所建立的沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法,特异性良好,组间组内重复性良好,沙门氏菌检测下线为101CFU/mL。本研究建立了沙门氏菌特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR检测方法,为沙门氏菌的快速诊断奠定了基础。      

牛乳中沙门氏菌的荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种牛乳中沙门氏菌的荧光定量PCR快速检测方法,根据沙门氏菌invA基因序列和荧光定量PCR要求设计了合适的特异性引物,然后提取菌体DNA,对目的基因进行克隆,以重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,绘制标准曲线,以沙门氏菌DNA为模板进行荧光定量PCR扩增,确定其扩增条件。结果表明,建立的方法特异性强,与志贺氏菌等致病菌无交叉反应,且方法的灵敏度高(为0.1 ng/L)。以掺入沙门氏菌的牛乳为样品,可检测到牛乳中44.2 mL~(-1)的沙门氏菌。该方法适用于快速、准确检测牛乳中的沙门氏菌,为实验室快速检测致病菌提供参考。     

肉制品中牛源性成分荧光定量聚合酶链式反应方法的建立与应用

为了能够快速准确检测出市场中掺假牛肉制品,采用Taq Man探针法,建立一种用于快速有效检测牛肉制品中牛源性成分的荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。选择Gen Bank中牛β-actin基因的保守序列,设计并合成特异性引物及Taq Man探针,以构建的p MD-18T-96-beef质粒为标准品,优化反应条件。结果表明:重组质粒标准品经PCR、测序和酶切鉴定正确,建立的标准曲线Ct值与模板拷贝数对数值之间呈良好的线性关系,相关系数为0.98,斜率为-3.345,敏感度为46.1 copies/μL。特异性实验表明,用该方法检测猪肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等非牛肉制品结果均为阴性。批内重复实验变异系数均小于0.98%,批间重复实验变异系数均小于0.33%,表明该方法重复性良好。用建立的荧光定量PCR方法与SN/T 2051—2008《食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法》同时对市场上40份牛肉加工品进行检测,结果显示,本方法检测有3份样品为牛源成分阴性,与SN/T 2051—2008方法检测结果相同。可见,本实验建立的荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于检测市场中肉类掺假的行为。     

TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测克罗诺杆菌MMS基因方法的建立

建立克罗诺杆菌的特异、灵敏的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法。方法 根据GenBank公布的克罗诺杆菌MMS基因高保守序列,设计特异引物和TaqMan-MGB探针,建立和优化反应体系,用25种其他常见致病菌评价反应体系的特异性,用克罗诺杆菌MMS基因重组质粒构建实时荧光定量PCR标准曲线,对重组质粒、纯菌和人工模拟污染样本进行灵敏度试验,并与FDA推荐的TaqMan探针实时荧光PCR比较,配对t检验分析两种方法对Ct值和荧光强度的差异。结果 采用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测克罗诺杆菌MMS基因仅需40min,与25种非目标菌无交叉反应,仅对克罗诺杆菌有特异性扩增;所构建方法线性关系良好,相关系数r²=0.999,扩增效率为99.972%,对重组质粒、纯菌、人工模拟污染样品标本的灵敏度分别达10拷贝/反应、3.8和38cfu/ml;与FDA推荐的TaqMan探针实时荧光PCR相比,TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR的Ct值更小、△Rn值更高,灵敏度和分辨率差异均有统计学意义(Ct:t=-14.406,P﹤0.01;△Rn:t=14.230,P﹤0.01)。结论 本研究建立的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR反应体系能够快速、特异、灵敏地检测克罗诺杆菌MMS基因,可用于婴幼儿奶粉中克罗诺杆菌的快速筛查和鉴定,具有较大的的应用价值和推广价值。     

微滴式数字聚合酶链式反应定量检测食品中金黄色葡萄球菌方法的研究

目的 建立微滴数字聚合酶链式反应(ddPCR)快速定量检测食品中金黄色葡萄球菌的方法.方法 以金黄色葡萄球菌nu基因为靶序列,筛选出同时适用于实时荧光定量PCR(qPCR)和微滴数字PCR(ddPCR)的引物探针,建立食品中金黄色葡萄球菌ddPCR快速定量检测方法,并对该方法进行特异性、灵敏度、准确性和重复性实验.结果...     

鼠伤寒沙门氏菌ompc基因PCR的检测方法

建立一种鼠伤寒沙门氏菌的聚合酶链式反应检测方法。根据GenBank中已发表的鼠伤寒沙门氏菌的ompc的基因序列,设计和合成了一对特异性引物,并优化了反应条件,检测了该方法的敏感性和特异性。结果成功扩增出了鼠伤寒沙门氏菌470 bp的ompc特异性基因片段,而对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和志贺氏菌4 种食品中常见的病原菌均未扩增出相应片段。敏感性实验结果表明本方法可检测到最低1 pg/μL的鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA。     

多重实时荧光定量PCR检测肴肉中的特定腐败菌

本试验以真空包装水晶肴肉中的3株特定腐败菌屎肠球菌(Enterococcus faecium)、中间耶尔森菌(Yersinia intermedia)和清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)为研究对象,通过克隆3株菌的特异性DNA片段,构建重组质粒作为阳性模板,建立一种多重实时荧光定量PCR方法同时检测这3株特定腐败菌,结果表明:建立的多重实时荧光定量PCR具有较高的特异性和灵敏度,同时还具有很好的稳定性,可用于真空包装水晶肴肉贮藏期间特定腐败菌数量的检测,从而可以间接评价产品的货架期。     

绿色魏斯氏菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法的建立

以rpoA基因为靶基因,建立绿色魏斯氏菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）快速检测方法。针对rpoA基因设计特异性引物,建立绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR检测体系,通过特异性、灵敏度和重复性实验评价体系的检测效果,同时与常规PCR方法进行比较。结果表明：实时荧光定量PCR方法能够特异性检出绿色魏斯氏菌,对基因组DNA的检测灵敏度达到2.667×10－3 pg/μL,对纯培养物和模拟污染牛肉样品直接检测的灵敏度分别为30 CFU/mL和0.8 CFU/g;与常规PCR相比,实时荧光定量PCR检测的灵敏度是其1 000 倍;不同浓度样品独立重复实验循环阈值的标准差均小于1,变异系数在0.02%～1.28%之间。本研究所建立的绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能够进行准确的定量检测,是快速检测绿色魏斯氏菌的有效手段。     

散装即食食品中3种食源性致病菌多重荧光定量PCR检测方法的建立

该研究旨在建立散装即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3种食源性致病菌的多重荧光定量PCR检测方法，根据沙门氏菌侵染上皮细胞表面蛋白的invA基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶(nuc)基因、蜡样芽孢杆菌的cer A基因分别设计3对特异性引物与探针，并对体系中引物探针的浓度以及退火温度等反应条件进行优化筛选，建立多重荧光定量PCR检测方法，同时评估其特异性、灵敏性及重复性，并应用该方法检测散装即食食品样本中致病菌，同时与国标法比对。结果表明，建立的多重荧光定量PCR检测方法能特异性地扩增沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3种目标菌，其他菌株均不扩增，灵敏度分别为4×10²、3×10²、2×10² cfu/mL，且批内和批间变异系数均小于2%，重复性和稳定性良好。同时用国标法和多重荧光定量PCR法对100份散装即食食品样本进行检测比对，多重荧光定量PCR法的阳性检出率略高于传统国标法，且检测时间大幅缩短。综上所述，建立的多重荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、快速准确，在食源性致病菌快速筛查方面具有良好...     

食品接触材料中3种致病菌的多重荧光PCR检测

建立并优化食品接触材料中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血性弧菌3种致病菌的多重实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法,评价此方法的特异性和灵敏度,并模拟阳性样品进行检测。结果显示,该方法特异性良好,检测灵敏度均能达到10~3 CFU/mL,为食品接触材料的微生物检测提供技术保障。     

食品中热损伤沙门氏菌选择性增菌及实时荧光聚合酶链式反应检测

为了能够高效检测食品中的亚致死损伤沙门氏菌,首先采用热激胁迫的方法得到亚致死损伤沙门氏菌细胞,进而基于选择性增菌培养液SEL建立一种实时荧光聚合酶链式反应检测技术。结果表明：在SEL中经过20h增菌培养后,无论是否经过修复培养,1～2CFU/5mL SEL的亚致死损伤细胞都能得到完全修复并增菌至109CFU/mL水平;依此建立的实时荧光聚合酶链式反应检测技术的纯菌扩增效率为95.41%,检测限为4CFU/反应体系,在人工污染碎食品样品中的检测限为3CFU/10g碎牛肉,而且与传统培养检测方法的结果相吻合。本方法在24h内即可完成食品中热损伤沙门氏菌的修复、选择性增菌以及实时荧光聚合酶链式反应检测,可应用于食品中沙门氏菌污染状况调查及高效检测。