烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶类似基因的克隆及其功能研究

利用同源克隆法从普通烟草(Nicotiana tabacum)红花大金元的cDNA 中克隆到一个新基因NtGGPPSL(Geranylgeranylpyrophosphate synthase-like),其编码区全长为813 bp。Blast 结果显示该基因与林烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)和番茄(Solanum lycopersicum)的GGPPS 小亚基基因的相似度分别达到了99%、91% 和82%,但其编码的蛋白质序列缺失了GGPPS小亚基的关键功能域“DDXXXXD”,这表明NtGGPPSL 基因的功能可能与GGPPS 小亚基基因不同。为了深入研究NtGGPPSL 基因的功能,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析NtGGPPSL 基因在普通烟草不同时期和器官中的表达差异。利用TRV 病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中NtGGPPSL基因的表达,在成功沉默该基因之后,检测烟草中质体色素(新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素)含量的变化。结果显示,NtGGPPSL 基因在茎和根中的表达量明显高于其他器官。与对照组相比,在NtGGPPSL 基因沉默后,烟草叶片发生明显的褪绿现象,质体色素含量显著降低,表明该基因参与了叶绿素的合成,这为VIGS 体系提供了一个可参考的指示基因,也为烟草的遗传改良和基因功能研究提供了理论依据。      

烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆和功能分析

为揭示烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因的功能,采用同源克隆的方法从普通烟草(Nicotiana tabacum)中克隆了NtZDS基因,并进行了遗传进化分析。同时通过荧光定量PCR技术分析NtZDS的时空表达模式、利用烟草脆裂病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草中ZDS基因的表达,在该基因沉默后再通过定量PCR技术分析NtZDS上下游基因的表达量变化,并检测了烟株色素含量的变化。结果显示:NtZDS基因在普通烟草中至少存在两个同源拷贝,其编码序列与番茄、马铃薯的ZDS基因相似度高于90%。NtZDS在烟草盛花期的叶和花中表达量最高。与对照比较,该基因沉默后,烟株新生叶片出现严重白化现象,能够为VIGS体系提供一个良好的候选报告基因;同时类胡萝卜素合成通路其他基因的表达量和烟株类胡萝卜素、叶绿素含量都显著降低,表明ZDS基因在烟草生长发育及类胡萝卜素合成过程中发挥着重要作用。      

TMV侵染后烤烟叶片色素含量高光谱估算模型研究

人工诱发不同病级烟草普通花叶病,接种后第3d采用ASD Field spec FR 2500光谱仪对叶片进行光谱分析和相应色素含量测定.运用单变量线性或非线性拟合分析技术,选取部分样本建立色素含最估测模型,并利用其余样本对模型进行精度检验.结果表明,以蓝边面积(SDb)为自变量的线性模型是估测叶绿素a含量的最佳模型;以蓝边面积(SDb)为白变量的指数模型是估测叶绿素b和叶绿素a+b含量的最佳模型;以绿峰幅值(Rg)为自变量的线性模型足估测类胡萝卜素含量的最佳模型,其估测叶绿素a,叶绿素b,叶绿素a+b和类胡萝卜索含量的相对误差为-9.131%,-22.975%,-11.408%,-5.855%.     

烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的转录表达模式及功能分析

为了明确烟草β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase,β-OHase)基因的转录表达模式和功能,进而调控烟草类胡萝卜素的代谢,通过Real-time PCR分析了普通烟草(Nicotiana tabacum)品种红花大金元盛花期的β-OHase基因在不同器官中的表达量。利用烟草脆裂病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中β-OHase基因的表达,在该基因成功沉默后,通过Real-time PCR检测其下游基因表达量,同时检测烟草中β-胡萝卜素、紫黄质和新黄质含量(质量分数)。结果显示,β-OHase基因在叶片中的表达量明显高于其他器官(P0.05)。与对照相比,在该基因沉默后,下游的紫黄质脱环氧化酶基因(VDE)和玉米黄质环氧化酶基因(ZE)的表达量明显降低,同时β-胡萝卜素含量显著升高,而紫黄质和新黄质含量则显著降低(P0.05)。     

利用VIGS技术研究NtbHLH93基因在烟草甾醇代谢中的功能

为进一步研究烟草NtbHLH93基因的功能,利用病毒诱导基因沉默(Virus induced gene silence,VIGS)技术降低烟草中NtbHLH93基因的表达。通过测定pTRV2-NtbHLH93烟株中的甾醇含量,发现NtbHLH93基因表达下调后,总甾醇、豆甾醇、胆固醇和β-谷甾醇的含量显著降低。转录组测序发现NtbHLH93基因下调后,共有259个基因差异表达。对这些差异表达基因进行KEGG表达通路分析,发现质体萜类代谢2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate, MEP)途径中有两个基因(Niben101Scf00063g13014.1和Niben101Scf06249g03002.1)上调表达,这两个基因与MEP途径中的牻牛儿基牻牛儿基还原酶(Geranylgeranyl diphosphate synthases, GGPPS)基因序列高度相似,推测当甾醇合成代谢通路受阻后导致Niben101Scf00063g13014.1和Niben101Scf06249g03002.1基因上调表达。     

RP-HPLC法测定烟草中的质体色素

为了快速测定烟草及其制品中的质体色素,考察了萃取溶剂、萃取方式、萃取时间、流动相、柱温和柱流速对测定结果的影响,建立了同时测定烟草样品中6种质体色素的方法,并采用该法测定了10种烟草样品中的质体色素.结果表明:①烟草样品中的色素用90%丙酮溶液超声提取20 min效果较好;②用Waters Nova-Pak-C18作色谱柱,异丙醇和乙腈-水(体积比80:20)为流动相,梯度洗脱,流速0.5mL/min,6种色素均能完全分离;③该法的回收率为96.7%-110.7%,RSD均小于5%;④2种新鲜的冻干烟叶样品中均检测出了新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素b、叶绿素a、B-胡萝卜素等色素,且其含量较高,而原烟及卷烟烟丝中仅检测出了叶黄素和β-胡萝卜素,且其含量也较新鲜烟叶低得多.该方法适合批量烟草样品中这6种质体色素的快速分析.     

烟草NtGGPPS4基因的克隆和功能初步分析

为明确烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因Nt GGPPS4的功能,从普通烟草中克隆到该基因,构建了超量表达载体p CAMBIA1300-Nt GGPPS4,并通过农杆菌介导法转化烟草。进一步测定了转基因烟株中西柏烷二萜醇和质体色素的含量。结果表明:共鉴定出4株Nt GGPPS4表达量明显升高的转基因植株,且转基因植株中α-西柏三烯二醇(α-cembrenediol,α-CBD)和β-西柏三烯二醇(β-cembrenediol,β-CBD),以及新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素等6种质体色素含量都有显著提高。表明Nt GGPPS4参与了烟草西柏烷二萜醇和类胡萝卜素的生物合成。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的克隆和功能分析

为进一步明确烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的功能,根据已公布的普通烟草(Nicotiana tabacum)GGPPS1基因编码区序列设计特异性引物,从普通烟草K326中克隆到NtGGPPS1基因。构建荧光表达载体PFF19-Nt GGPPS1-GFP,对NtGGPPS1基因进行亚细胞定位研究。通过荧光定量PCR分析了普通烟草K326在不同激素处理下NtGGPPS1基因的表达量变化。构建NtGGPPS1基因的RNAi载体pHellsgate2-Nt GGPPS1,通过农杆菌浸染烟草K326后获得NtGGPPS1基因显著下调的烟株,检测了烟株中质体色素含量的变化情况。结果表明:Nt GGPPS1融合蛋白基因的绿色荧光分布在烟草BY-2细胞的质体上,表明该基因定位于质体。用茉莉酸甲酯(MeJA)处理烟草后,NtGGPPS1基因的表达量显著升高,而用生长素(IAA)处理后,该基因的表达量下降。与对照相比,在NtGGPPS1基因下调的烟株中其质体色素含量均显著降低,预示NtGGPPS1参与了烟草β-胡萝卜素的生物合成。     

LYC-B基因沉默对紫色番茄果实主要色素及挥发性物质的影响

利用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术,抑制紫色番茄果实成熟过程中番茄红素β-环化酶（LYC-B）基因的表达,并分析番茄果实中主要色素及挥发性物质的种类与含量变化。结果表明：LYC-B基因沉默可提高紫色番茄果实中番茄红素的含量;顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术检测到6-甲基-5-庚烯-2-酮等类胡萝卜素相关的挥发性物质的含量增加,反-2-辛烯醛、己醇、反-2-庚烯醛、水杨酸甲酯和顺-3-己烯醇等主要挥发性物质的释放量增加。因此,LYC-B基因沉默可以增加番茄红素及部分主要挥发性物质的含量,影响番茄果实的营养品质和风味品质。     

VIGS诱导GS同工酶基因沉默对烤烟氮代谢的影响

【背景和目的】谷氨酰胺合成酶（GS）是烤烟氮代谢的关键酶,为探究沉默GS同工酶基因对烤烟氮代谢的影响。【方法】采用病毒诱导基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）技术构建GS同工酶基因（NtGS1、NtGS2）瞬时沉默表达载体,测定了烤烟品种中烟100叶片经VIGS处理10 d,20 d和30 d的NtGS1-1、NtGS1-2、NtGS2相对基因表达量和谷氨酰胺合成酶（GS）、硝酸还原酶（NR）活性以及叶片可溶性蛋白、总氮、烟碱含量和烟株生物量。【结果】沉默NtGS1基因的处理对NtGS1-1沉默效率最高为50.4%,对NtGS1-2沉默效率最高为56%,沉默NtGS1和NtGS2基因的处理对NtGS2沉默效率最高为54.9%;沉默NtGS1和NtGS2的烟株叶片重、GS、NR活性、可溶性蛋白、总氮、烟碱含量都显著低于对照。【结论】本研究建立的VIGS体系有效下调了GS同工酶基因的表达,同时沉默NtGS1和NtGS2(TRV::GS1::GS2)可抑制叶片氮素同化利用,降低氮代谢关键酶活性与含氮化合物含量。     

转TaW基因提高烟草的耐盐性

TaW基因是从小麦的cDNA文库中克隆获得的ERF类转录因子,含有一个AP2/ERF保守域。将TaW基因构建在由组成型CaMV35S强启动子控制的双子叶转化载体pBI121上,通过农杆菌介导法将其转入烟草W38。以转TaW基因烟草为材料,研究TaW基因对烟草耐盐性的影响,测定盐胁迫下转基因烟草离体叶片的叶绿素含量,并观察转基因烟草T2代植株在盐胁迫培养基上的生长情况。结果显示,转基因烟草叶片的叶绿素含量明显高于对照,转基因烟草在盐胁迫培养基上的生长情况明显好于野生型植株,从而说明TaW基因的过表达提高了烟草的耐盐性,为烟草抗逆性育种的分子改良提供了依据。     

烤烟叶绿素含量遗传分析

应用主基因+多基因6个世代联合分析方法对烤烟丸叶×Coker319组合的总叶绿素含量性状进行了分析。结果表明:丸叶×Coker319组合的总叶绿素含量受1对加性-显性主基因+加性-显性-上位性多基因控制,主基因加性效应为-5.89,主基因显性效应为-3.47;B1、B2和F2世代总叶绿素含量的主基因遗传率分别为3.61%、46.11%和48.94%;多基因遗传率分别为52.04%、8.25%和0.00%,说明F2世代总叶绿素含量表现出较高的主基因遗传率,并受环境影响。对烤烟总叶绿素含量的改良要以主基因为主,同时注意环境的影响。     

过表达三七PnSS基因对烟草萜类物质含量及生长发育的影响

为明确PnSS基因在调节烟草萜类物质含量中的作用,构建了PnSS基因过表达载体,并通过叶盘法转化烟草品种巴斯玛14号,获得了PnSS基因过表达烟草植株,最后利用HS-SPME-GC/MS分析转化烟草叶片中的香味物质含量（质量分数）。结果表明：(1)PnSS的氨基酸序列与其在烟草中同源物NtSS具有81.9%的一致性,并含有角鲨烯和植烯合成酶结构域。(2)PnSS基因的过表达导致烟草植株变矮、叶片变小;与根和茎相比,叶片中PnSS基因表达量最高。(3)PnSS基因的过表达使烟叶中乙酸、糠醇、4,6-二甲基嘧啶、苯乙醛、3,5-二甲基苯甲醛、二烯烟碱、二氢猕猴桃内酯、2-甲基吡嗪、壬酸、异戊醛、2-甲基丁醛、西松烯和烟碱13种香味物质含量增加,2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、2,3-联吡啶、植醇、苯乙醇、新植二烯、苯甲醛和麦斯明7种香味物质含量降低。因此,过表达PnSS基因会抑制烟草植株的生长发育并改变烟叶中萜类物质等香味物质的含量。     

基于CRISPR/Cas9技术的烟草NtDXR基因敲除及功能分析

为研究烟草5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)基因的表达模式和功能,从普通烟草(Nicotiana tabacum)品种红花大金元中克隆了NtDXR基因,并通过荧光定量PCR技术分析了NtDXR在红花大金元不同发育时期、不同组织中的表达模式。同时利用CRISPR/Cas9技术构建了NtDXR敲除载体,获得了DXR基因突变的植株。结果表明:NtDXR基因在花中的表达量最高,在雌蕊和叶中次之;利用CRISPR/Cas9系统定点敲除NtDXR基因后,检测目的基因靶位点序列发现有碱基的插入、缺失与置换,并且部分T_0代转基因阳性植株呈现白化表型,暗示NtDXR基因在烟草叶绿素等色素合成过程中起重要作用,推测NtDXR基因的突变能阻断烟草质体色素的合成。     

烟草类胡萝卜素异构酶基因的克隆及功能研究

为了进一步研究烟草类胡萝卜素异构酶（Carotenoid isomerase,CRTISO）基因的功能,从普通烟草（Nicotiana tabacum）的cDNA中成功克隆出CRTISO基因编码区（CDS）全长,长度为1716 bp,Blast结果显示与马铃薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersicum）的前番茄红素异构酶（Prolycopene isomerase）基因的相似度达93%。将CRTISO基因的部分序列插入烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）载体中,构建重组载体pTRV2-CRTISO。通过TRV病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）系统抑制本氏烟草（Nicotiana benthamiana）CRTISO基因的表达,同时利用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测CRTISO下游基因的表达量变化。结果表明,与对照组相比,TRV-CRTISO载体侵染的烟草叶片出现黄色斑点;CRTISO基因的沉默导致下游番茄红素ε环化酶（ε-LCY）、番茄红素β环化酶（β-LCY）和胡萝卜素β-环羟化酶（β-OHase）基因表达量降低。对烟草CRTISO基因功能的研究有助于揭示烟草中类胡萝卜素合成代谢途径的调节机制,为选育优质烟草品种奠定理论基础。      

黑暗诱导烟草单个叶片衰老的研究

采用铝箔纸包裹的方法,对生长中的烟草单个叶片进行黑暗处理(DIS)。发现在处理第5d叶片明显变黄,叶片衰老标记基因CP1表达量开始明显增高;与黑暗诱导的离体叶片相比,黑暗诱导的生长叶片在叶绿素、可溶性蛋白、MDA含量以及SOD、POD酶活等指标上,呈现相似但较为平缓的变化趋势。该结果可为进行烟草叶片衰老研究提供理想的实验体系。     

烟草查尔酮异构酶基因2(NtCHI2)功能分析

烟草查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是黄酮类代谢的一个关键酶,烟草中有两个基因拷贝(NtCHI1、NtCHI2),相关研究多集中在NtCHI1基因,对NtCHI2的研究较少。为研究烟草NtCHI2的功能,主要以NtCHI2的过表达和干扰植株叶片为材料,进行了实时定量PCR和CHI活性分析以及芸香苷含量检测,同时进行了NtCHI2体外表达蛋白的酶活分析。结果表明:NtCHI2体外表达蛋白具有查尔酮异构酶活性;过表达株系中NtCHI2的表达量升高5～75倍,但CHI酶活性和芸香苷含量基本没有变化;干扰株系中NtCHI2的表达量降至70%,CHI酶活性和芸香苷含量分别降低50%和90%。烟草NtCHI2参与芸香苷的合成代谢调控,在一定程度上NtCHI2基因的表达量和芸香苷的含量正相关。     

高温介导N基因对TMV免疫丧失的代谢轮廓分析

高温(28℃)可引起含N基因的免疫寄主对TMV抗性丧失,导致TMV系统侵染。本研究以枯斑三生(Nicotianatabacum var.Samsun NN)烟草为研究材料,采用代谢组学方法,系统研究25℃和31℃条件下,TMV未侵染和TMV侵染12 h、24 h和48 h枯斑三生烟草的代谢差异。应用气相色谱与质谱联用(GC-MS)技术,结合主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘-判别分析法(OPLS-DA)对不同温度下代谢产物的差异性进行分析。结果表明:GC-MS技术共检测到49种代谢物包括氨基酸类、糖类、有机酸类、脂肪酸类、醇类以及多胺类等。在25℃常温条件下,TMV侵染枯斑三生烟引起苹果酸、水杨酸、γ-氨基丁酸、脯氨酸和乙醇胺等代谢物含量上调,而在31℃高温处理N基因失活后,TMV侵染导致组织蔗糖和肌醇含量下调、葡萄糖和果糖含量上调以及伴随氨基酸类含量普遍上调。     

甲霜灵与镉复合污染对烟草生长发育及光合性能的影响

为明确农药和重金属复合污染对烟草生长和光合性能的影响,通过盆栽试验模拟烟田在农药甲霜灵和重金属镉单一及复合污染条件下烟草生长发育及光合性能对污染胁迫的响应。研究结果表明,20 mg/kg甲霜灵单一污染对烟草根生物量、叶绿素和类胡萝卜素等光合色素含量和净光合速率、气孔导度及蒸腾速率等光合参数均有不同程度抑制作用,但在生长前期对株高有显著促进作用;20 mg/kg镉单一污染对烟草主要植物学性状、总生物量、光合色素含量及光合参数指标均具有不同程度抑制作用;在甲霜灵和镉复合污染条件下,两种污染物对烟草总生物量及光合参数的抑制,在整个生育期均表现为协同作用,其对烟草光合色素含量的抑制则在烟草生育前期表现为协同、后期表现为拮抗作用。此外,等浓度镉污染对烟草生物量、光合色素及光合作用的抑制作用强于甲霜灵。研究结果显示,甲霜灵与镉复合污染对烟草生长发育及光合性能均产生一定生态毒性效应,且毒性效应会随着烟草发育进程而改变。     

阿维菌素类和烟碱类杀虫剂对烟草幼苗叶绿素含量的影响

为合理评价杀虫剂及烟草生态安全性提供理论参考依据,以烟草生产中常用的4种杀虫剂处理烟草幼苗,并对其叶绿素含量进行了测定.结果表明,阿维菌素、吡虫啉和啶虫脒导致烟草幼苗叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量和类胡萝卜素含量上升,叶绿素a/b下降;甲维盐则导致烟草幼苗叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量和类胡萝卜素含量下降,叶绿素a/b上升.从叶绿素含量的变化来看,阿维菌素、吡虫啉和啶虫脒对烟草幼苗相对是安全的,而甲维盐则会对其造成不利的影响.