烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的克隆和功能分析

为进一步明确烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的功能,根据已公布的普通烟草(Nicotiana tabacum)GGPPS1基因编码区序列设计特异性引物,从普通烟草K326中克隆到NtGGPPS1基因。构建荧光表达载体PFF19-Nt GGPPS1-GFP,对NtGGPPS1基因进行亚细胞定位研究。通过荧光定量PCR分析了普通烟草K326在不同激素处理下NtGGPPS1基因的表达量变化。构建NtGGPPS1基因的RNAi载体pHellsgate2-Nt GGPPS1,通过农杆菌浸染烟草K326后获得NtGGPPS1基因显著下调的烟株,检测了烟株中质体色素含量的变化情况。结果表明:Nt GGPPS1融合蛋白基因的绿色荧光分布在烟草BY-2细胞的质体上,表明该基因定位于质体。用茉莉酸甲酯(MeJA)处理烟草后,NtGGPPS1基因的表达量显著升高,而用生长素(IAA)处理后,该基因的表达量下降。与对照相比,在NtGGPPS1基因下调的烟株中其质体色素含量均显著降低,预示NtGGPPS1参与了烟草β-胡萝卜素的生物合成。     

烟草NtGGPPS4基因的克隆和功能初步分析

为明确烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因Nt GGPPS4的功能,从普通烟草中克隆到该基因,构建了超量表达载体p CAMBIA1300-Nt GGPPS4,并通过农杆菌介导法转化烟草。进一步测定了转基因烟株中西柏烷二萜醇和质体色素的含量。结果表明:共鉴定出4株Nt GGPPS4表达量明显升高的转基因植株,且转基因植株中α-西柏三烯二醇(α-cembrenediol,α-CBD)和β-西柏三烯二醇(β-cembrenediol,β-CBD),以及新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素等6种质体色素含量都有显著提高。表明Nt GGPPS4参与了烟草西柏烷二萜醇和类胡萝卜素的生物合成。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶小亚基基因的克隆及组织表达谱

为揭示牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)小亚基在烟草(Nicotiana tabacum)中的生理功能,采用电子克隆的方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术,从烟草中克隆到1个牛儿基牛儿基焦磷酸合成酶小亚基基因的cDNA序列,命名为NtGGPPS5(GenBank登陆号:KF316932)。该基因全长1320 bp,编码332个氨基酸,与番茄(Solanum lycopersicum,XP_004246572)及其野生种(Solanum pennellii,ADZ24721)的GGPPS小亚基的氨基酸序列一致性均为92%,具有一个特征性的异戊二烯合成酶保守的天门冬氨酸富集区。进化分析表明,植物GGPPS分为大亚基和小亚基两个分支,而且NtGGPPS5属于小亚基。实时荧光定量PCR试验表明,NtGGPPS5基因在烟草根、茎、叶和芽中均有表达,表达量为芽叶茎根。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因家族的全基因组鉴定

为了揭示烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)基因家族的特征和功能,利用生物信息学方法对烟草GGPPS家族进行了全基因组查找、鉴定及相关分析。在普通烟草中共鉴定出9个成员(大亚基7个、小亚基2个),林烟草、绒毛状烟草中分别鉴定出5个成员(大亚基4个、小亚基1个)。GGPPS的开放阅读框长度为999~1 119 bp,编码332~372个氨基酸,蛋白质分子量为36.2~40.7 kD,等电点为5.41~8.32。大亚基和小亚基基因分别含有1个和2个外显子;大亚基与小亚基均具有DD(XX)_1-2D和CXXXC保守性基序,但存在一定的差异。在进化过程中,烟草GGPPS家族可能发生了串联重复复制和片断复制;普通烟草GGPPS家族可能发生了基因丢失,NtabGGPPS1-1和NtabGGPPS1-2较其他成员进化速率快,同时可能受到了净化选择。      

橄榄苦苷改善db/db小鼠糖尿病的肝脏转录组学及生物信息学分析

通过转录组学及其生物信息学分析,研究了橄榄苦苷缓解db/db小鼠糖尿病的肝脏差异表达基因及相关信号通路。结果发现与db/db对照组相比,橄榄苦苷处理组的539个基因发生显著变化,其中450个基因显著上调,89个基因显著下调。将上调和下调的差异表达基因在基因本体论数据库中注释,这些差异表达基因主要在细胞过程、细胞部分和结合中分布。京都基因与基因组百科全书通路富集分析结果显示上调的差异表达基因主要富集在磷酸肌醇3-激酶-蛋白激酶B信号通路途径,该通路共涉及27个差异表达基因;下调的差异表达基因主要富集在花生四烯酸代谢和真核生物中核糖体的生物发生信号通路途径,分别涉及4个差异表达基因。本研究为进一步阐明橄榄苦苷缓解2型糖尿病的分子机制奠定了基础。     

烟草叶片在二氯喹啉酸胁迫下的蛋白组学分析

为明确二氯喹啉酸对烟草药害的机理,采用同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)技术分析了二氯喹啉酸处理7 d后烟草畸形叶片较正常叶片的蛋白组学变化。本研究共鉴定出65个差异蛋白,其中表达量上调的23个,下调的42个,它们具有结合、催化和转运等分子功能。分别参与光合作用、防御/抗胁迫、代谢等细胞过程,荧光定量PCR验证结果与蛋白组学数据一致。ABA合成通路中的ABA2及NCED基因能够响应二氯喹啉酸胁迫信号,分别在处理后48和24 h达到表达高峰,处理后72 h下调至较低水平。根据这种上调表达后又迅速下调的基因表达模式,推测烟草体内存在一种应激机制抵抗二氯喹啉酸胁迫。本研究首次在烟草中采用蛋白组学的方法分析二氯喹啉酸胁迫下基因的表达变化,并获得重要候选基因。     

外源质粒DNA对小鼠肝脏基因表达谱的影响

研究了外源质粒DNA经胃肠道吸收可能对肝脏产生的作用机制。给Balb／c小鼠灌胃质粒pcDNA3 200μg，在灌胃后4h分离肝脏，提取肝脏的总RNA。利用寡核苷酸芯片对灌胃质粒pcDNA3后的Balb／c小鼠肝脏进行基因表达谱研究。结果发现17664个基因中，表达上调100条，表达下调41条。按基因功能分类，表达上调的基因可分为免疫应答基因、转录因子基因、信号转导基因、转运相关基因及代谢相关基因等；表达下调的基因主要为脂质代谢基因。灌胃外源质粒DNA后，肝脏组织主要表现为急性时相反应的加强、免疫反应的活化、细胞信号通路的活化以及脂质代谢途径的抑制。表明外源质粒DNA通过胃肠道途径可广泛调控肝脏的基因表达。     

番茄红素合成基因组合优化和产物测定

番茄红素(lycopene)是一种抗氧化性较强的天然色素,已广泛应用于食品、保健品及化妆品等领域。该研究首先在酿酒酵母YPH499△gal80中分别整合3个拷贝数的3种不同的外源牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPS)编码基因CrtE。然后分别选取不同来源的4种八氢番茄红素合酶(phytoene synthase,CrtB)编码基因CrtB和4种八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,CrtI)编码基因CrtI进行组合,得到16个不同的番茄红素游离表达质粒,转化上述突变株。此外对番茄红素测定方法也进行了探索和优化:分析在5种不同溶剂中番茄红素和β-胡萝卜素的吸收情况,确定合适的溶剂、波长、检测限和线性范围。通过肉眼观察菌落色泽深浅和酶标仪测定,最终筛选得到1株最优组合,即表达来源于曼地亚红豆杉(Taxus x media,Tm)的TmCrtE、成团泛菌(Pantoea agglomerans,Pa)的PaCrtB和三孢布拉霉氏菌(Blakeslea trispora,Bt)的BtCrtI的...     

烟草转录因子bHLH93基因的克隆及表达分析

碱性/螺旋-环-螺旋(basic/helix-loop-helix,b HLH)转录因子是一类广泛存在于真核生物体内的重要转录因子,能够参与调控植物体多种生理途径。为了明确b HLH转录因子在烟草中的功能和调控机制,通过同源克隆技术从烟草中克隆到一个b HLH转录因子基因(Ntb HLH93),并结合生物信息学和基因表达模式分析进一步预测其生物学功能。结果表明:Ntb HLH93 c DNA序列长1 254 bp,包含一个长度为1 047 bp的开放阅读框,编码349个氨基酸。Ntb HLH93属于疏水性蛋白,其二级结构中的主要结构元件是α-螺旋和无规则卷曲,三级结构中具有b HLH家族典型的螺旋-环-螺旋结构特征。Ntb HLH93基因表达具有明显的组织特异性,主要在烟草不同生育期侧根和盛花期子房组织中高表达,这与植物甾醇集中在生长分裂旺盛组织中合成的特征相吻合。     

烟叶落黄过程中烟碱代谢规律及相关基因表达分析

为探究烟草叶片落黄衰老过程中生物碱组分变化及代谢相关基因表达情况,以红花大金元为材料,气相色谱-质谱联用法测定中部烟叶生物碱含量,利用已有的烟草叶片衰老转录组数据(RNA-seq),分析叶片衰老成熟期烟碱代谢相关基因的表达水平,同时实时荧光定量PCR验证基因表达。结果显示,烟草进入成熟衰老期,叶片中烟碱、去甲基烟碱、新烟草碱、麦斯明等生物碱含量逐渐升高,烟碱转运蛋白基因JAT1、NUP1,烟碱转化基因CYP82E2、CYP82E4,烟碱合成基因ADC1、ODC2、BBL2以及烟碱代谢调控基因COI1、JAZ1、MYC2、MYC3呈现上调表达,而调控基因MTHFR1下调表达。差异表达基因协同调控烟碱代谢过程,影响衰老叶片中的烟碱合成与积累。     

山楂、甾醇酯及功能红曲复配物的降血脂活性

目的:研究山楂、甾醇酯及功能红曲复配物的降血脂效果及机制。方法:将6周龄体重为(100±10)g的SPF级雄性仓鼠随机分为正常组N、模型组C、单纯山楂干预组A,山楂+低剂量甾醇酯组B,山楂+高剂量甾醇酯组D,山楂+甾醇酯+低剂量功能红曲组E,山楂+甾醇酯+高剂量功能红曲组F。每2周称重并检测其血脂指标,8周后处死。测定其血脂指标(总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-c);计算脏器及脂重指数、非高密度脂蛋白(non-HDL-c)含量、动脉硬化指数(AI);观察肝脏及主动脉病理切片,胆固醇代谢调控相关基因的mRNA表达水平。结果:F组与高脂对照组相比,小鼠体重、肝脏指数、脂重指数及TC、TG、non-HDL-c、AI极显著下降(P<0.01),HDL-c显著上升(P<0.05);粪便中胆酸含量极显著上升(P<0.01);肝脏组织脂肪变性程度和主动脉粥样硬化症状有所改善;CYP7A1mRNA表达水平显著上调(P<0.05),LXRα、PPARα及FXR极显著上调(P<0.01),LIMA1、NPC1L1的mRNA表达水平显著下调(P<0.05),HMG-CoA-R、SREBP2极显著下调(P<0.01)。结论:F组降脂效果最佳,即3种天然物质的复配从增加体内胆固醇排出体外、减少机体对胆固醇的吸收以及减少胆固醇的自身合成3个途径有效预防因长期高脂饮食导致的高脂血症。     

烟草HD-ZIP Ⅳ转录因子NtPDF2基因的克隆及表达分析

为了明确NtPDF2在烟草中的生物学功能及其调控腺毛分化发育的作用机制,同源克隆了烟草NtPDF2基因,并对其序列、基因结构、进化关系以及表达模式进行分析。结果表明:NtPDF2 CDS全长为2 199 bp,编码732个氨基酸残基。烟草PDF2蛋白质序列高度保守,尤其是C端序列,均含有3个保守结构域(Homeobox domain,START domain和SAD domain)和1个保守LZ(Leucine zipper)元件。烟草PDF2基因结构高度保守,均由10个外显子和9个内含子组成。进化分析表明,普通烟草NtPDF2基因是由林烟草ML1基因进化而来。表达分析显示,烟草PDF2基因表达具有明显的时空特异性。干旱、黑暗和磷饥饿胁迫可显著下调NtPDF2基因的表达,而盐胁迫对其没有明显影响;NtPDF2基因的表达在赤霉素(GA)、茉莉酸甲酯(Me JA)、脱落酸(ABA)和打顶处理条件下均显著上调,这暗示烟草NtPDF2基因参与了调控多种非生物胁迫和激素应答过程。     

裂殖壶菌诱变株高产DHA机理的转录组学分析

利用RNA-seq技术对裂殖壶菌SR21的原始菌株和ARTP诱变所获取的DHA高产菌株NA2进行转录组分析。对基因进行功能注释和代谢通路的分类,寻找差异表达基因,并将这些基因归类到相关的代谢途径中,揭示诱变菌NA2中DHA产量提高的分子机理。结果表明:与原始菌株比较,诱变菌NA2中有314个基因上调,3个基因下调;上调的基因主要参与氨基酸代谢和能量代谢,为多不饱和脂肪酸的积累供应更多的乙酰辅酶A(乙酰-CoA)和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)。利用荧光定量PCR验证基因的差异表达情况,结果与转录组分析一致。     

基于转录组学分析日本沼虾原肌球蛋白对小鼠巨噬细胞极化的影响

为研究日本沼虾原肌球蛋白对巨噬细胞极化的影响,运用转录组学分析原肌球蛋白诱导的巨噬细胞极化过程中基因表达的差异性。结果表明：与磷酸盐缓冲溶液组(PBS组)相比,原肌球蛋白诱导组(TM组)有69个基因表达上调,154个基因表达下调,富集到180条通路;TM组相较于脂多糖和IFN-γ联合诱导M1型巨噬细胞组(LPSIFN组)有1 346个基因表达上调,1 360个基因下调,富集到308条通路;TM组与IL-4诱导M2型巨噬细胞组(IL4组)相比,有455个基因上调,446个基因下调,富集到269条通路。根据KEGG结果选择5条可能涉及巨噬细胞极化的信号通路,包括NOD样受体信号通路、Jak-STAT信号通路、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路和PI3K/Akt信号通路,对这5条通路中的NOD2、TLR2、AKT3、NLRP3、Caspase-1、CD14、Lat、Myd88、NFKBIA和STAT1基因的表达进行验证,检测到TM组NOD2、TLR2、NLRP3、STAT1这4个基因表达量相较于PBS组显著升高,与这4个基因相关的NOD样受体信号通路、Jak-STAT信号通路、Tol...     

秦巴不同生态区烤烟基因表达谱分析

为了揭示不同生态区烤烟风格特色形成的机理,采用Agilent 烟草寡聚芯片技术,对商洛市洛南县和宝鸡市陇县(对照)两个生态区烤烟打顶后15 d 同一品种(秦烟96)中部叶的基因表达谱进行了初步分析。结果表明:与陇县相比,在44 000 个基因中洛南烟区烟叶有2 058 个基因差异表达,其中上调基因962 个,占46.74%;下调基因1 096 个,占53.26%。按功能富集分类,这些差异基因主要富集在代谢、响应外界刺激及生理调控等生物学过程,大部分位于胞外区与细胞内膜系统。其中洛南烟区碳水化合物合成代谢较为活跃,陇县烟区萜类化合物代谢、苯丙烷代谢、芳香族化合物合成代谢较为活跃。基因代谢通路分析表明,细胞信号转导、转录因子及参与植物非生物胁迫相关基因在两个烟草种植区均为高表达。      

烟叶衰老过程中类胡萝卜素代谢及相关基因表达分析

成熟叶片中类胡萝卜素含量与烟叶品质密切相关。为探究烟草叶片衰老过程中类胡萝卜素组分变化及代谢相关基因表达情况,本研究以普通烟草红花大金元为材料,采用液相色谱法测定不同发育时期烟叶中新黄质、叶黄质和β-胡萝卜素的含量;通过转录组数据分析结合实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法,分析烟草叶片衰老成熟过程中类胡萝卜素代谢相关基因的表达变化。结果显示,烟草进入成熟衰老期叶片中新黄质、叶黄质、β-胡萝卜素含量逐渐降低;类胡萝卜素合成基因GGPS、PSY、PDS、ZDS、CRTISO、LYCB和LYCE呈现下调表达,类胡萝卜素降解基因LOX、POD和CCD1呈现上调表达,PAL和PPO呈现下调表达。类胡萝卜素转化基因ZEP、NXS、NCED呈上调表达。类胡萝卜素合成相关转录因子基因ORANGE、HY5、COP1、DET1呈现下调表达,而MYB5b、Cry-2呈现上调表达。随着烟叶成熟衰老,类胡萝卜素合成减弱,而降解增强。研究结果为烟叶成熟衰老过程中类胡萝卜素代谢的分子调控及针对类胡萝卜素含量定向改良烟草品种奠定了基础。     

基因表达谱技术分析棒曲霉毒素肾细胞毒性的机制

本文研究了食品污染物棒曲霉毒素诱导人胚肾细胞损伤过程中基因表达谱动态变化。5μM PAT作用HEK293细胞3、24h,应用数字基因表达谱(DGE)技术筛选差异表达基因,分析基因富集的GO功能,KEGG信号通路及Pathway信号途径分析,并通过定量PCR对部分差异表达基因进行验证。分析发现,在3 h和24 h受PAT诱导的差异表达基因分别为79个和261个,其中上调表达基因分别为71和192个,下调表达基因分别为8和69个。PAT主要诱导了细胞凋亡基因的差异表达,RNA降解差异基因全部表达上调,RNA合成差异基因表达下调,泛素介导的蛋白降解大部分差异基因上调,MAPK信号通路主要参与PAT毒性的下游进程,其相关差异基因大部分上调。DGE技术为我们在分子水平上提供了PAT胚肾细胞损伤机制的众多线索,为相关基因生物学效应研究奠定基础。     

过表达三七PnSS基因对烟草萜类物质含量及生长发育的影响

为明确PnSS基因在调节烟草萜类物质含量中的作用,构建了PnSS基因过表达载体,并通过叶盘法转化烟草品种巴斯玛14号,获得了PnSS基因过表达烟草植株,最后利用HS-SPME-GC/MS分析转化烟草叶片中的香味物质含量（质量分数）。结果表明：(1)PnSS的氨基酸序列与其在烟草中同源物NtSS具有81.9%的一致性,并含有角鲨烯和植烯合成酶结构域。(2)PnSS基因的过表达导致烟草植株变矮、叶片变小;与根和茎相比,叶片中PnSS基因表达量最高。(3)PnSS基因的过表达使烟叶中乙酸、糠醇、4,6-二甲基嘧啶、苯乙醛、3,5-二甲基苯甲醛、二烯烟碱、二氢猕猴桃内酯、2-甲基吡嗪、壬酸、异戊醛、2-甲基丁醛、西松烯和烟碱13种香味物质含量增加,2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、2,3-联吡啶、植醇、苯乙醇、新植二烯、苯甲醛和麦斯明7种香味物质含量降低。因此,过表达PnSS基因会抑制烟草植株的生长发育并改变烟叶中萜类物质等香味物质的含量。     

反油酸诱导人脐静脉内皮细胞转录组学及生物信息学分析

以反油酸诱导人脐静脉内皮细胞后,结合转录组学分析及其生物信息学分析,在转录水平上对相关差异表达基因进行研究。结果表明：共检测到95?条基因显著变化,其中31?条基因上调,64?条基因下调。并通过生物信息学分析,其中参与生物进程显著性差异表达基因共772?条,关于细胞组成的基因显著表达性差异基因共46?条,关于分子功能的基因显著表达性差异基因共122?条。共检测到93?条信号通路,其中显著变化的有11?条,其中包括萜类骨架生物合成通路、类固醇生物合成通路和脂肪酸代谢通路等。根据蛋白质基因互作通路图,重点分析了同时参与不同通路的靶基因,包括脂肪酸合成酶、STAT4转录因子及IL-23细胞因子等。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶类似基因的克隆及其功能研究

利用同源克隆法从普通烟草(Nicotiana tabacum)红花大金元的cDNA 中克隆到一个新基因NtGGPPSL(Geranylgeranylpyrophosphate synthase-like),其编码区全长为813 bp。Blast 结果显示该基因与林烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)和番茄(Solanum lycopersicum)的GGPPS 小亚基基因的相似度分别达到了99%、91% 和82%,但其编码的蛋白质序列缺失了GGPPS小亚基的关键功能域“DDXXXXD”,这表明NtGGPPSL 基因的功能可能与GGPPS 小亚基基因不同。为了深入研究NtGGPPSL 基因的功能,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析NtGGPPSL 基因在普通烟草不同时期和器官中的表达差异。利用TRV 病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中NtGGPPSL基因的表达,在成功沉默该基因之后,检测烟草中质体色素(新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素)含量的变化。结果显示,NtGGPPSL 基因在茎和根中的表达量明显高于其他器官。与对照组相比,在NtGGPPSL 基因沉默后,烟草叶片发生明显的褪绿现象,质体色素含量显著降低,表明该基因参与了叶绿素的合成,这为VIGS 体系提供了一个可参考的指示基因,也为烟草的遗传改良和基因功能研究提供了理论依据。