酶解牛乳酪蛋白制备ACE抑制肽的研究

目的利用酶技术制备酪蛋白源ACE抑制肽.方法以ACE抑制活性为指标,筛选最佳用酶,优化酶解反应条件,并研究酶解过程中水解度和游离氨基酸含量的变化.结果通过对5种蛋白酶的筛选,最终确定AS1.398中性蛋白酶为水解用酶,制备酪蛋白源ACE抑制肽,其最佳反应条件为pH 7、温度45℃、底物质量分数7.5%、酶用量([E]/[S])5%,水解6 h.在酶解过程中,随着时间的延长,水解度略有增加,而游离氨基酸含量大幅度增加.酪蛋白ACE抑制肽的半抑制浓度(IC50值)为0.68mg/mL.结论牛乳酪蛋白用蛋白酶水解可制备高活性的ACE抑制肽,是获得ACE抑制肽的良好来源.     

酶法制备乳源ACE抑制肽

利用酶技术制备乳源ACE抑制肽。以ACE抑制活性为指标,筛选最佳水解酶。优化酶解反应条件,并研究酶解过程中水解度和游离氨基酸含量的变化。通过对4种蛋白酶的筛选,蛋白酶A是制备乳源ACE抑制肽的最佳酶,最佳反应条件为:pH7、温度52℃、底物质量分数4.5%、酶用量3%,水解9.5 h。在酶解过程中,随着时间的延长,水解度略有增加,而游离氨基酸含量大幅度增加。它的半抑制浓度(IC50值)为1.206 3 mg/mL。     

酶解豆类蛋白制备活性肽研究进展

豆类蛋白源活性肽具有抗氧化、血管紧张素转化酶（angiotensin I-converting enzyme,ACE）抑制、二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV）抑制和抗炎等活性,在防治高血压和糖尿病等慢性疾病中起积极作用,对维护人体健康具有重要意义。该文就目前国内外豆类蛋白源活性肽的酶法制备及其活性予以综述,并对其发展趋势进行展望,旨在为健康功能性食品的研究与开发提供参考。     

分步酶解法制备黄浆水活性肽

黄浆水是传统豆制品点脑成型过程压榨出的废弃物,富含低聚糖、蛋白质等营养成分。该研究通过比较酶种类及用量、酶解温度、酶解时间对黄浆水蛋白质水解度的影响,采用正交试验优化获得黄浆水短肽最佳分步酶解工艺：（1）酸性蛋白酶加酶量2 000 U/g,pH 4.0,温度55 ℃,水解2 h;（2）中性蛋白酶8 000 U/g,pH 6.0,温度50 ℃,水解6 h。在此条件下进行验证,水解度可达25.95%,血管紧张素转化酶体外抑制活性达92.0%。采用酸性蛋白酶和中性蛋白酶分步酶解黄浆水制备短肽,制备条件温和,水解度高,可为豆制品加工废弃物的高值化利用奠定基础。     

玉米大豆复合肽体内ACE抑制活性研究

为了考察玉米大豆复合肽的体内抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性,采用自发性高血压鼠(SHR)为模型,进行了一次性给药和长期给药动物试验,并以卡托普利(Captopril)作为阳性对照,采用尾袖法测定SHR的血压变化.结果表明:一次性给药后,中(50 mg/kg·bw)、高剂量(100 mg/kg·bw)玉米大豆复合肽(CSP)组的降血压作用可一直持续3 h,血压值降低达显著水平(P<0.05);长期试验中,每日给予CSP,12 d后开始,与模型组SHR比较,中剂量组(25 mg/kg·bw)和高剂量组(50 mg/kg·bw)的SHR血压值均明显降低(P<0.05～P<0.01);高剂量(50 mg/kg·bw)给肽组的降血压效果略好于Captopril组,并对正常大鼠的血压无影响;CSP对大鼠有增加体重的作用.因此CSP对SHR具有良好的短期和长期降血压作用,并对正常血压大鼠无影响;CSP同时是大鼠良好的营养剂.     

酶解鳙鱼鱼肉蛋白制备ACE抑制肽工艺参数优化

采用碱性蛋白酶Alcalase 2.4L对鳙鱼鱼肉蛋白进行水解,制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽。以酶解物ACE抑制率为指标,先进行单因素实验,确定底物浓度([S])、温度、pH、酶用量及水解时间5个因素的最适水平范围,再通过响应面分析法(RSM)对加酶量、温度和水解时间3个酶解工艺参数进行优化。结果表明:Alcalase水解鳙鱼鱼肉蛋白制备ACE抑制肽的最佳酶解条件为:[S]6%、加酶量2.2%、温度57℃,pH9.0及水解时间6.4h,此条件下酶解物ACE抑制率理论值为81.77%,验证实验结果ACE抑制率为81.52%,与理论值相符合。     

酶膜耦合制备高活性ACE抑制玉米肽及结构研究

为了充分提高酶解效率及获得高活性的ACE抑制玉米肽,采用酶解与膜分离耦合技术连续化制备高活性ACE抑制玉米肽,考察了该制备过程中产品的质量和稳定性,比较了不同分子质量级分玉米肽的ACE抑制活性,以及采用HPLC-MS/MS对几种玉米肽的结构进行了解析。结果显示:在连续制备5 h内,所得产品的ACE抑制活性及肽含量较稳定,ACE抑制率在84%左右(最高达到89.82%),其中Mw<3 ku级分玉米肽其ACE抑制活性最高(IC50=0.29 mg/mL);解析出了3种玉米肽的结构,其氨基酸序列分别为QQLLPF、QQFLPF和QFLPF。试验表明:连续化酶膜耦合技术制备的ACE抑制玉米肽产品质量高且稳定,其中Mw<3 ku的玉米肽级分的ACE抑制活性最高;解析出的3种玉米肽均具有ACE抑制肽的结构特点。     

乳源ACE抑制肽的开发与应用

血管紧张素转化酶(ACE)在血压调节方面起重要作用,目前已从乳蛋白中分离出多种ACE 抑制肽。本文对ACE 抑制肽的作用机理和来源进行介绍,并对乳源ACE 抑制肽的获得与开发及其应用进行综述。     

超滤法制备高ACE抑制活性玉米肽

为了获得高降血压活性的玉米肽,采用截留分子质量为5、3、1 ku超滤膜对玉米蛋白酶解液进行分级分离,比较了各级份及未分级玉米肽的肽含量及血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性;并采用正交试验对最佳膜分离条件进行了优化。结果显示:经截留分子质量3 ku的膜滤过肽液的ACE抑制活性最高,其最佳膜分离条件为:原液浓缩比3∶1,pH值为5.5,温度为35℃时,此玉米肽滤过液的ACE抑制率大于82.27%。截留分子质量为3 ku的超滤膜为分离玉米ACE抑制肽的最佳超滤膜。     

如何提高食源性ACE抑制肽活性的探讨

就如何提高食源性ACE抑制肽的活性，分别对原料、蛋白酶和分离纯化方法等几方面的选择作了探讨。     

具ACE抑制活性的大豆肽的制备及精制研究

采用酶解技术制备具ACE抑制活性的大豆肽混合物。选择了最佳水解用酶,优化了反应条件。确定碱性蛋白酶解最佳条件为:pH9.0,温度50℃,底物浓度6%,酶用量([E]/[S])3%,作用时间4h。选择D3520型大孔树脂对水解产物进行脱盐精制,脱盐率91.2%,肽回收率89.3%,ACE抑制活性提高了28.5%,大豆分离蛋白ACE抑制肽混合物分子质量主要分布为200-720,在pH3-10,溶解性达98.1%以上,且稳定性好。     

酶解条浒苔蛋白制备ACE 抑制肽

为了开发利用绿潮藻类条浒苔中含量丰富的蛋白质,采用可见分光光度法测定酶解物对ACE的抑制作用,考察碱性蛋白酶、Alcalase和胰蛋白酶对条浒苔蛋白的水解作用及其水解产物的ACE抑制活性,筛选出Alcalase作为酶解条浒苔蛋白制备具有降血压活性酶解物的适宜水解酶。在单因素试验的基础上,采用响应面分析法对该酶的酶解条件进行优化。结果表明,最佳酶解条件为：料液比1:50、加酶量2982U/g pro、温度47.9℃、pH7.53、酶解时间90min,在该条件下,酶解物的ACE抑制率IC50值为0.66mg/mL。不同截留分子质量的组分中,分子质量范围在1～5kD,平均肽链长度为16的组分ACE抑制活性最强,模拟体外消化实验结果表明,分子质量小于10kD的组分具有一定的对消化酶的抗性。     

酶法制备联合Plastein反应修饰牡蛎ACE抑制肽工艺优化

以牡蛎为原料,采用酶解联合Plastein反应修饰的方法,获得高活性血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽。以ACE抑制率和水解度为指标,对比胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶这5种蛋白酶对牡蛎肉的酶解效果,筛选出木瓜蛋白酶最佳。通过单因素试验和正交试验对酶解工艺进行优化,得到最佳酶解工艺为料液比1∶8(g/m L)、加酶量2.0%、温度65℃、时间1.0 h、pH6.0,此条件下酶解产物的ACE抑制率可达到63.30%,在此基础上采用Plastein反应对酶解产物进行修饰,以游离氨基酸减少量和ACE抑制率为指标,考察反应过程中酶种类、底物质量分数、加酶量、时间和温度对修饰结果产生的影响。通过该反应的修饰,得到选用中性蛋白酶、底物质量分数40%、加酶量1.0%、温度30℃、时间2.5h、pH7.0时,ACE抑制率最高可达82.31%,比修饰前提高了19%。     

酶解胶原蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽的研究

血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制剂是目前用于治疗高血压的重要药物.本实验采用胃蛋白酶(pepsin)和胰蛋白酶(trypsin)组合酶解胶原蛋白制备水解液.使用1kD超滤膜对水解液进行超滤,超滤液采用葡聚糖凝胶Sephadex G-15凝胶过滤层析得到多种组分.各组分经酶活力和蛋白浓度测定,筛选出有较高 ACE抑制率的两个样品.继续使用反相高效液相色谱进一步分离筛选出样品,对分离出的不同组分进行蛋白浓度和抑制率测定,通过分析实验数据,筛选出具有最高活性组分.最终样品经脱盐和冷冻干燥后进行高抑制活性的血管紧张素转化酶抑制肽的分子量的测定.     

胃蛋白酶水解酪蛋白制备ACE抑制肽的条件

研究胃蛋白酶水解酪蛋白制备ACE 抑制肽的工艺条件。采用胃蛋白酶水解酪蛋白制备ACE 抑制肽,检测其水解产物的ACE 抑制率,以ACE 抑制率为指标,通过正交试验设计法,确定最终水解条件为水解温度37℃、pH3.0、酶与底物质量比1:100、底物质量分数7%,水解产物ACE 抑制率为92.5%,其IC50 值为0.24mg/mL。酪蛋白的水解度与ACE 抑制率之间并非简单的相关性。     

酶解虾壳蛋白制备ACE 抑制剂的工艺优化

以虾壳粉为原料,以水解度和ACE抑制率为指标,利用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解,其中中性蛋白酶和碱性蛋白酶有较高的ACE抑制活性,因此对碱性蛋白酶和中性蛋白酶的工艺条件进一步优化。结果表明：碱性蛋白酶酶解工艺优化条件为：温度60℃、pH9.5、底物质量浓度2.5g/100mL、加酶量4000U/g、酶解时间2.5h,在此条件下ACE抑制率最高,为67.70%,水解度为69.79%;中性蛋白酶酶解工艺优化条件为：温度50℃、pH7.0、底物质量浓度2.5g/100mL、加酶量2000U/g、酶解时间2h,在此条件下ACE抑制率最高,为84.04%,水解度为26.76%。提示中性蛋白酶酶解能够产生更多的ACE抑制肽,是酶解虾壳蛋白制备ACE抑制肽的较优酶。     

酪蛋白水解物中ACE抑制肽分离及氨基酸序列分析

以牛乳酪蛋白为底物,先经胃蛋白酶水解,再经胰蛋白酶水解,从水解物中分离获得血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme,ACE）抑制肽并确定其氨基酸序列。酪蛋白的双酶水解物经超滤和葡聚糖凝胶色谱分离,分离得到3 个组分,收集高ACE活性抑制效果组分Ⅱ和Ⅲ。采用离子色谱法分析水解片段的氨基酸组成,液相色谱-质谱法分析水解片段的氨基酸序列,采用固相合成法制备获得的短肽片段,用分光光度法检测ACE活性抑制效果。结果表明,组分Ⅱ包含缬氨酸、丝氨酸、脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸,共8 种氨基酸,组分Ⅲ包含痕量的丝氨酸和酪氨酸;将组分Ⅱ和Ⅲ经液相色谱-质谱分析,获得8 个片段,其中,αs2-f（56～57）∶YS、αs2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY和κ-f（52～61）∶INNQFLPYPY具有ACE活性抑制作用,其IC50值分别为11.89、11.75 μg/mL和421 μg/mL。     

瑞士乳杆菌蛋白酶水解酪蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽的条件优化

本研究以酪蛋白为原料,对瑞士乳杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生血管紧张素转化酶(angiotensin I-convertingenzyme,ACE)抑制肽工艺条件进行研究。通过单因素分析和响应面试验设计,确定酪蛋白酶解制备ACE 抑制肽的最佳工艺条件为：底物浓度6%(W/W), 酶解温度39.64℃、pH 8.94、酶与底物的比0.92%(W/W),底物预处理温度90℃、酶解时间8h,其对ACE 抑制率可达92.67%。     

响应面法优化猪血红蛋白制备ACE抑制肽的酶解工艺条件

以猪血红蛋白为原料,采用胃蛋白酶水解猪血红蛋白制备ACE抑制肽。以体外ACE抑制率和水解度为指标,通过单因素试验对酶解温度、酶解pH值、底物质量浓度、加酶量、酶解时间等酶解工艺参数进行研究,并用响应面法优化酶解工艺,建立二次多项数学模型。结果表明,胃蛋白酶水解猪血红蛋白制备ACE抑制肽的最佳工艺参数为酶解温度37.60℃、酶解pH 1.98、底物质量浓度4.98g/100mL、加酶量3.04%、酶解时间4h,酶解产物的最大ACE抑制率为70.09%。     

酪蛋白双酶水解物ACE抑制肽的分离纯化

采用胃蛋白酶和胰蛋白酶依次对酪蛋白进行双酶水解,制备ACE抑制肽。水解物经截留分子质量6ku的超滤膜初步分离,再通过Sephadex G-15进一步纯化,体外测定各分离产物ACE活性的半数抑制质量浓度(IC50值)。纯化得到的各组分经毛细管电泳分析肽谱、Q-TOF LC/MS检测分子质量范围。结果显示：双酶水解产物IC50值为560μg/mL,超滤流出物IC50值为250μg/mL;Sephadex G-15分离得到3个组分,组分Ⅰ的IC50值为123.41μg/mL,含有19个肽段;组分Ⅱ的IC50值为66.67μg/mL,含有14个肽段;组分Ⅲ的IC50值为64.29μg/mL,含有5个肽段。Q-TOF LC/MS测得纯化组分的分子质量范围为400～800u。