基于核酸适配体结合纳米金模拟酶用于单增李斯特菌的快速检测

利用纳米金模拟酶在一定条件下能够催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺发生颜色反应,同时结合特异性高、亲和力强的核酸适配体建立了单增李斯特菌快速检测方法。通过对实验条件进行优化,建立了单增李斯特菌浓度与特定波长下吸光度值之间的关系式。线性回归方程为y=0.032 1x+0.024 8,R²=0.996 3,检出限约为5 CFU/mL,实际样品测定的回收率为93.5%～105.4%,相对标准偏差小于10%。该文方法特异性强、操作简单、成本低,能快速对食品中单增李斯特菌进行定量检测。     

适配体结合聚酰胺-胺修饰的磁性纳米粒子富集单增李斯特菌

目的制备聚酰胺-胺聚合物修饰的磁性纳米粒子,增加连接适配体的数量,提高富集单增李斯特菌的效率。方法通过迈克尔加成和酰胺化的级联反应,在Fe_3O_4磁性纳米粒子表面接枝3.0代聚酰胺-胺树枝状聚合物(poly(amidoamine)dendrimers,PAMAM),制得聚酰胺-胺磁性纳米粒子(G3-MNPs),并对其进行表征。G3-MNPs偶联生物素标记的单增李斯特菌特异性适配体,获得适配体磁性纳米粒子(AP-G3-MNPs)。然后对AP-G3-MNPs富集单增李斯特菌的工作条件和捕获率进行测定。结果傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)分析、Zeta电位测定以及碳、氮元素分析结果表明,PAMAM已接枝在MNPs表面,G3-MNPs偶联适配体的效率为1.412 nmol/mg。AP-G3-MNPs(200μg)对浓度为2×102～2×108 CFU/mL的单增李斯特菌的捕获率均大于90%。结论接枝PAMAM提高了MNPs的负载能力,增强了其富集单增李斯特菌的能力。     

食品中单增李斯特菌快速检测技术研究进展

单核细胞增生性李斯特氏菌(简称单增李斯特菌)是一种广泛存在于自然界中可导致人畜共患病的病原菌, 同时也是一种常见的食源性致病菌。目前, 食品中单增李斯特菌的检测主要采用国标法, 传统检验方法虽然可操作性高, 但检验流程耗时过长。随着生活水平不断提高, 人们在饮食中摄入受单增李斯特菌污染的食品的风险增大, 如遇到食品安全突发事件, 传统检测不能及时得到检测结果, 无法保障人们的饮食安全。本文概述了基于分子生物学和免疫学发展起来的快速检测方法, 包括PCR法、实时荧光定量PCR法、环介导等温扩增法、酶联免疫吸附法、免疫层析试纸条, 其中环介导等温扩增法已经应用于食品致病菌的检测。通过分析对比以上快速检测方法, 为探索更灵敏高效且适用于基层食品检验的检测方法提供参考。     

基因探针快速检测食品中单增李斯特氏菌

应用AccuProbe基因探针方法快速检测食品中单增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes),结果表明,采用该基因探针方法检测食品中单增李斯特氏菌特异性强,对食品中单增李斯特氏菌鉴定时间仅需30min,采用增菌肉汤检测低限为7.5×107cfu/mL。对206个样品检测结果表明,AccuProbe基因探针方法可快速准确地检测食品中单增李斯特氏菌。     

食源性单增李斯特菌检测技术研究进展

由单核细胞增生李斯特氏菌(简称单增李斯特菌)(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes)引起的李斯特菌病,被认为是世界范围内主要的食源性疾病之一,致死率可高达20％～30％.单增李斯特菌普遍存在于各类食品中,其在低温、有氧或无氧条件下、以及较宽的pH和渗透压范围内均可生长繁殖.因此,...     

基于化学发光磁酶免疫分析技术检测 单增李斯特菌

探索化学发光磁酶免疫分析技术在单核细胞增生性李斯特菌检测中的应用,并初步建立和优化检测方法及条件。将抗LM兔多抗与磁性微球偶联构建免疫磁分离原件,应用双抗夹心法ELISA检测LM全菌抗原,应用化学发光法进行定量检测,应用正交设计优化主要反应条件,建立标准曲线,测试灵敏性与特异性。通过正交试验优化的反应条件为37℃条件下,免疫磁珠用量20μL、含0.1%BSA的PBS封闭15 min,捕获抗原2 h,HRP标记的抗LM单抗稀释至1∶10 000(体积比)特异性结合反应30 min后进行化学发光检测,标准曲线拟合优度0.954,最低检出限10~4 CFU/m L,特异性良好,检测时限为3 h~4 h。     

EMA-LAMP方法快速鉴别检测单增李斯特菌

作者建立一种将叠氮溴化乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)结合环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的新分析方法(EMA-LAMP),快速鉴别检测单增李斯特菌。通过对单增李斯特菌hly基因的六个区域设计4条LAMP特异性引物,EMA-LAMP在63℃下反应1 h,检测单增李斯特菌的死活细胞。结果表明,在浓度为2.0×108CFU/mL的单增李斯特死菌悬液中,使EMA激活光解进入死细胞中且与DNA结合的最佳曝光时间至少为20 min,不抑制活菌细胞DNA的LAMP扩增的最大EMA质量浓度为10μg/mL,而抑制死菌细胞DNA的LAMP扩增的最小EMA质量浓度为4.0μg/mL;活菌细胞的检出限为20 CFU/mL。     

胶体金试纸快速检测食品中单增李斯特菌

制备单增李斯特菌(Lm)特异性单克隆抗体,研制胶体金试纸,快速检测食品中Lm。所研制的胶体金试纸具有较高的特异性,不与绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌同属菌及大肠杆菌、沙门氏菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌异属菌发生交叉反应;对Lm 纯培养物检测的灵敏度为3.9 × 105CFU/mL;4℃保质期在120d 以上;对自来水、牛奶、生肉制品、蔬菜、冷冻虾仁和面包模拟样品检测的灵敏度为3.9 × 105CFU/mL。该试纸具有快速、敏感、特异的优点,可用于食品中Lm 的快速检测。     

食品中单增李斯特菌检测进展

研究表明,单增李斯特菌能使人和牲畜共同患病,治病感染性极强,并且已成为四大食源性疾病致病菌之一,因此,对于食品中单增李斯特菌的检测尤为重要.主要介绍国标法和快速检测单增李斯特菌的方法,对我国食品安全问题的管理工作以及保障社会的稳定具有十分重要的意义,并且对国内外不同检测单增李斯特菌的方法做出了整体的比较,对比其检出限与...     

全细胞SELEX法筛选单增李斯特菌的ssDNA适配体

以单增李斯特菌活细胞为靶标,采用指数富集配基的系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)从含40个随机碱基序列的单链DNA(single-stranded DNA,ss DNA)文库中筛选与之特异性结合的适配体。酶联配体吸附法(ELASA)测定筛选过程中次级文库与单增李斯特菌结合力的变化。对筛选得到的适配体进行序列测定,RNA structure软件预测二级结构,ELASA测定适配体与靶标的结合能力和特异性。结果显示,每轮筛选后次级文库与靶标的亲和力增强,特异性适配体逐步得到富集。测序获得23条适配体,其序列同源性不高,但预测的二级结构有些相似,根据二级结构将其分为3个群,分析结果表明二级结构与适配体的亲和力有关。挑选亲和力较强的21号(Lma-21)和35号(Lma-35)适配体能特异性地识别单增李斯特菌。本研究为开发食源性病原菌单增李斯特菌的新型检测试剂提供了基础材料。     

链置换恒温扩增快速检测单核细胞增生李斯特氏菌

目的开发单核细胞增生李斯特氏菌快速、简便、准确的链置换恒温扩增(strand displacement amplification,SDA)检测方法。方法根据单核增生李斯特菌特异性基因prfA基因片段,设计链置换扩增特异性引物,建立单核细胞增生李斯特菌SDA快速检测方法,同时对设计的引物的特异性和灵敏度进行研究。结果所建立的单核细胞增生李斯特菌SDA扩增方法灵敏度达到了7.0×10~2 CFU/mL,检验技术可以特异性地扩增单核增生李斯特菌。结论本试验所建立的单核细胞增生李斯特菌SDA检验技术具有快速、简便、特异性强的特点,具有在进出口实验室推广应用前景。     

实时定量荧光PCR快速鉴定食品中单核细胞增生李斯特氏菌

目的建立实时定量荧光PCR法(real-time PCR)快速鉴定食品中的单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)。方法选取2016年国家食品风险监测样本134例与模拟灭活LM样本10例,采用GB/T4789.30-2010与real-time PCR方法同步检测单核细胞增生李斯特菌。结果共检测食品134份,包括肉制品、水产品、快餐和即食食品等。共检出8株LM,检出率为5.97%。以GB/T4789.30-2010为金标准判断,real-time PCR方法检测样本中LM的灵敏度与特异度均达到100%。模拟灭活LM样本real-time PCR方法检出率为100%,标准法检出率为0%。结论本方法可以简化实验程序,减少工作量,节约检测试剂,为可能发生的食物中毒尽早提供实验依据。     

食品中单核增生性李斯特菌的PCR快速检测研究

为提高食品中单增李斯特菌的检测水平,针对单增李斯特菌中多个稳定的特异性基因hlyA、plcB、prfA、iap,设计并筛选出7对引物组成多重-巢式PCR联合检测体系,并结合高灵敏性的聚丙烯酰胺凝胶电泳,对单增李斯特菌进行快速检测,多重PCR的灵敏度达到1×102CFU ml,巢式PCR的灵敏度达到1×10CFU ml。结果表明该检测体系具有快速可靠、灵敏准确及特异性好的特点,而且有效缩短了检验周期,从传统的7～14d缩短到1～2d。     

重组酶介导扩增技术快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌

目的 建立重组酶介导扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)快速检测单核细胞增生李斯特菌的方法.方法 以单核细胞增生李斯特菌的hlyA基因作为靶序列,设计引物和探针,通过构建含目的基因片段的重组质粒,评价RAA方法的灵敏度,通过检测沙门氏菌核酸、金黄色葡萄球菌核酸、副溶血性弧菌...     

环介导恒温扩增方法快速检测乳中单增李斯特菌

建立了一种快速检测灭菌乳中单增李斯特菌的环介导恒温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)方法。以hlyA基因作为靶基因,对人工污染乳中单增李斯特菌进行了LAMP方法的灵敏度试验,同时与PCR方法进行比较。并对单增李斯特菌和7种其他乳中常见致病菌进行了LAMP检测,以验证该方法的特异性。结果表明,LAMP检测单增李斯特菌的特异性强,检出限为42 mL-1,其灵敏度比普通PCR高10倍。并且检测时间比PCR更短,在1.5 h内即可完成扩增反应。此方法快速、特异、简单、灵敏,具有较高的推广价值。     

食品中单核细胞增生性李斯特氏菌PCR快速检测

通过扩增hly基因建立检测单核细胞增生性李斯特氏菌(Lm)的PCR方法.该方法具有较强的特异性,35株经传统方法鉴定的菌株PCR结果均为阳性,而其他三种同属异种菌,包括英诺克李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌和威尔斯李斯特氏菌及非李斯特氏菌均未扩增出特异性的片段.PCR方法对上Lm纯培养物的最低检测限为7.3CFU/μl,对模拟污染的生猪肉和蔬菜的检测低限为4CFU/g,牛奶为4CFU/ml.应用该方法对285份食品样品检测,17份样品Lm呈阳性,结果与常规的分离培养方法完全一致.该种方法具有敏感、特异、快速及准确的优点,可用于食品中Lm的快速检测.     

免疫磁珠捕获PCR快速检测单核细胞增生李斯特氏菌

利用免疫磁珠富集单核细胞增生李斯特氏菌,采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增进行快速检测。所制备的免疫磁珠选取在37 ℃条件下均匀振荡1 h为最佳包被条件,1 mg磁珠偶联抗体的最佳量为100 μg/mg,制备的免疫磁珠捕获率为45%。所建立的免疫磁珠捕获-PCR技术在样品细菌浓度达到104 CFU/mL即可被检出,其灵敏度是直接PCR检测限（105 CFU/mL）的10 倍,可为病原菌的富集和快速检测提供新方法。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证

目的通过能力验证提升食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力和实验室质量管理水平。方法依据GB 4789.30-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》进行检测,利用BAX system Q7全自动病原微生物检测系统对能力验证中的3个样品进行快速筛查,采用VITEK2COMPACT全自动细菌鉴定系统、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)和溶血素O基因(hlyA)序列比对分析鉴定可疑菌株。结果编号CODE1和CODE3的样品检出单核细胞增生李斯特氏菌,编号CODE2的样品未检出。结论本实验室参加了中国食品药品检定研究院组织的食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证测试,取得了满意的实验结果。     

评价平板法定量检测单增李斯特氏菌

目的 评价平板法定量检测单增李斯特氏菌的效果以保障其准确性和灵敏性。方法 选择市场上常用的5种显色培养基和PALCAM琼脂培养基进行试验,根据4789.28-2013对培养基的质量和效果进行评估;依据GB 4789.30-2016进行单增李斯特氏菌平板计数,通过配对t检验法对6种培养基定量结果进行分析,同时比较涂布法和倾注法两种接种方法的差异性。结果 市售的6种培养基半定量测试中,目标菌的生长指数G＞6,非目标菌的生长指数G＜1,质量符合标准检测要求;统计分析显示6种培养基获得的单增李斯特氏菌计数结果无显著差异,但显色培养基的上菌落分布均匀,容易辨认,效果优于PALCAM;同时过分析两种接种方法的检测结果,发现涂布法和倾注法无显著性差异。结论 市售的6种培养基质量符合标准要求,且对单增李斯特氏菌的计数结果具有较好的一致性,涂布法和倾注法两种接种方法具有可交换性。