酸解氧化魔芋葡甘聚糖对齐口裂腹鱼肠道微生物的影响

探讨了氧化魔芋葡甘露聚糖酸解产物对齐口裂腹鱼肠道微生物的影响。选取平均体质量为81±2.64 g健康齐口裂腹鱼360尾,随机分为4组(每组3个重复,每个重复30尾),分别为对照组(饲喂基础饲料)、LOKGM-0.8%组(基础饲料+0.8%LOKGM)、LOKGM-1.6%组(基础饲料+1.6%LOKGM)和LOKGM-3.2%组(基础饲料+3.2%LOKGM),试验期75 d(驯养期15 d,正试期60 d)。采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对齐口裂腹鱼后肠肠道内容物细菌16S rDNA V3可变区进行菌群多样性分析,利用实时荧光定量PCR技术对肠道中嗜水气单胞菌及芽孢杆菌的数量进行定量分析。结果表明:与对照组相比,LOKGM-1.6%与LOKGM-3.2%组后肠肠道菌群多样性显著增加(P0.05),LOKGM-0.8%组无显著影响(P0.05);LOKGM-0.8%组齐口裂腹鱼前肠和中肠嗜水气单胞菌的数量显著减少(P0.05),前肠芽孢杆菌的数量显著增加(P0.05);LOKGM-1.6%组前中后肠嗜水气单胞菌数量均显著减少(P0.05),中肠与后肠芽孢杆菌数量显著增加(P0.05);LOKGM-3.2%组前肠和后肠嗜水气单胞菌的数量显著减少(P0.05),前肠和中肠芽孢杆菌数量显著增加(P0.05)。由此得出:氧化魔芋葡甘露聚糖酸解产物能够改善齐口裂腹鱼的肠道菌群结构,有利于保持鱼体健康。     

澳门市售即食海产中嗜水气单胞菌的污染情况及其致泻性毒力基因分析

目的 对澳门地区市售即食海产品进行嗜水气单胞菌的分离鉴定及致泻毒力基因检测。方法 从甲壳类、鱼类、贝类、头足纲类共4类80份样本中分离嗜水气单胞菌,使用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法检测菌株16S rRNA基因进行菌株鉴定,使用多重PCR测定分离菌株4种致泻毒力基因。结果 澳门地区市售的80份即食海产品中,有57份样本(71.25%)分离出嗜水气单胞菌,其中6份(10.53%)带有致泻毒力基因。在6株携带毒力基因的嗜水气单胞菌中,4株携带2种毒力基因,其余的只携带1种毒力基因。其中携带alt有4株(7.02%)、aerA 3株(5.36%)、ast 2株(3.51%)及act 1株(1.75%)。即食海产品的4个分类与嗜水气单胞菌检出率,经χ2检验分析差异无统计学意义(P>0.05)。此外,在15个经烹煮过样本中分离鉴定出13株嗜水气单胞菌。结论 嗜水气单胞菌有较高的检出率可能是因不当包装、运输及处理过程中受到交叉污染。致泻性毒力基因检出率不高,但存在嗜水气单胞菌的致病风险。     

嗜水气单胞菌(Aeromonase hydrophila)引起人类腹泻的流行病学意义

为了预防和控制嗜水气单胞菌引起疾病的暴发流行，对567例散发性肠道门诊腹泻病人粪便标本进行了分析和对一起食物中毒进行了调查。检出嗜水气单胞菌51株，其中检出含有气溶毒素Aero基因的菌株18株，占35．3％。用流行病学方法对其病原学进行分析，同时针对近几年来腹泻病人嗜水气单胞菌检出率增高的趋势，开展嗜水气单胞菌对人类致病性的研究和疫情监测，提出进一步认识和评价嗜水气单胞菌引起人类腹泻的流行病学意义，以指导对该病的防治工作。     

食品中弓形菌16S rRNA特异性扩增检测方法的建立

针对弓形菌16SrRNA基因合成1对引物,通过对聚合酶链式反应(PCR)扩增条件的优化,建立了检测弓形菌的PCR方法。3株弓形菌标准菌株PCR产物测序结果与NCBI上公布的弓形菌16S rRNA基因序列进行比对,比对结果表明3株弓形菌测序结果与NCBI上公布的弓形菌16S rRNA基因序列同源性均在99%以上。3株弓形菌标准菌株均特异性地扩增出了长度为1202bp的片段,其他19株不同种类的菌株均无扩增产物出现。55份食品样品用Johnson-Murano肉汤增菌后用此法进行检测,其中6份样品为弓形菌阳性,阳性率为10.9%。上述实验结果表明,方法特异性强、操作简便,节省了检测时间,可用于食品中弓形菌的快速检测。     

基于blaCARB-17和toxR基因的副溶血弧菌双重PCR检测方法的建立

建立一种针对副溶血弧菌bla_CARB-17和toxR基因的双重PCR检测方法。按照副溶血弧菌的bla_CARB-17和toxR基因序列设计并合成引物,于同一反应体系中进行PCR扩增,优化退火温度、退火时间和引物比例,确定双重PCR的特异性和灵敏性,最后用实验室分离鉴定的副溶血弧菌分离株验证。结果表明:建立的双重PCR最佳退火条件是52℃30 s,引物比例1∶1,在同一体系中特异地扩增出副溶血弧菌的bla_CARB-17和toxR基因的303、350 bp片段,其它对照菌株均无扩增,表明该方法特异性良好。双重PCR的最低检测限达1×10² CFU/mL,对实验室鉴定的56个副溶血弧菌分离株验证均为阳性。建立的双重PCR方法操作简单、高效快速、特异性强,适用于副溶血弧菌的检测。     

食源性气单胞菌属种水平监测和表型特征研究

调查上海市浦东新区食源性气单胞菌的属种分布和表型特征。方法 2011年5~11月,对采集自上海市浦东新区2个农贸市场的3种生鲜食品(共291份)进行气单胞菌属的选择性分离和属种水平鉴定;分析菌株表型特征的差异性。结果 291份生鲜食品样品中,74份阳性,总检出率25.4%。 其中肉制品阳性检出率最高,为34.1%(43/126);水产品和蔬菜阳性检出率分别为18.9%(17/90)和18.7%(14/75)。经系统生化鉴定的74株气单胞菌属菌株包括:嗜水气单胞菌23株,维隆气单胞菌温和生物变种35株,豚鼠气单胞菌16株。溶血试验和蛋白酶表达测试显示分别有51株菌β溶血素阳性,59株菌蛋白酶试验阳性,两者皆阳性的菌株有48株。抗生素敏感性试验表明,多数菌株对头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星呈现高度敏感,但对氨苄西林呈现高度耐药;对含青霉素酶药物(奥格门丁)的耐药能力存在种水平的差异;3种气单胞菌均存在低水平的多重耐药(MDR)。结论 上海市浦东新区农贸市场流行季节供应的主要生鲜食品气单胞菌属污染程度较高,除嗜水气单胞菌外的其他气单胞菌株也具有毒力因子,虽然目前耐药水平较低,但仍需加强基于食物链的食源性疾病的综合监测。     

一株鲢鱼肠道中嗜水气单胞菌拮抗菌株的筛选、鉴定及特性

从鲢鱼肠道中筛选嗜水气单胞菌的拮抗菌株,并对生长培养条件进行研究,以期为鲢鱼养殖过程中嗜水气单胞菌病的生物防治提供理论依据。通过对鲢鱼肠道中嗜水气单胞菌拮抗菌株的分离、筛选,并对其中拮抗作用较稳定的菌株进行生理生化、分子鉴定以及生长培养特性优化。经过多次筛选得到了15株拮抗效果较好的目标菌株,其中拮抗作用较稳定的S4为气单胞菌属,是偏碱性革兰氏阴性短杆菌;通过单因素和正交实验表明,S4最佳生长培养条件为1.5 g/d L淀粉,1.5 g/d L牛肉膏,1 g/d L氯化钙,32℃,pH 8.5,接种体积分数3%。研究结果为嗜水气单胞菌的防治及拮抗菌S4的应用提供理论依据。     

鱼类产品中嗜水气单胞菌RPA结合CRISPR/Cas12a快速检测

本文收集了来自水产养殖企业的74例鱼类样品, 采用基于最新的成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)基因编辑技术建立重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification, RPA)结合CRISPR/Cas12a新方法, 快速检测鱼类样品受嗜水气单胞菌感染水平; 同时采用等温扩增LAMP方法进行检测, 比对分析两种方法的检出率。同时对分离出来的嗜水气单胞菌作耐药性分析, 分别采用纸片扩散法(K-B)测定分离株的耐药表型, 采用SYBG实时荧光PCR方法测定分离株的耐药基因, 分析耐药表型与耐药基因检测结果的一致性。结果表明, 检测了74例鱼类样品, 基于RPA-CRISPR/Cas12a和LAMP方法同时检测出6例嗜水气单胞菌阳性。分析耐药性结果, 嗜水气单胞菌分离株对氨基糖苷类的卡那霉素、庆大霉素和妥布霉素比较敏感, 对氯霉素类的氟苯尼考比较敏感, 对于其余药物产生不同程度的耐药。耐药基因分别检出四环素类tetA、喹诺酮类qnrA、qnrD和qnrS、磺胺类sul 1和sul 2、氯霉素类cmlA、floR和cfr; 分析耐药表型与耐药基因检测结果一致性较高。研究结果有助于提高鱼类产品中嗜水气单胞菌及耐药性快速检测水平。     

水产品中创伤弧菌的分离、鉴定及毒性研究

通过溶血试验和小鼠急性毒性实验,评价市售水产品中创伤弧菌和标准创伤弧菌ATCC27562菌株毒性大小。从市售水产品中分离获得的6株疑似创伤弧菌菌株,经生化鉴定和溶细胞素基因扩增、基因测序后证实,除2号分离菌株基因测序未测出外,其它5株确定为创伤弧菌。创伤弧菌标准菌株ATCC27562菌株扩增出400 bp左右的基因条带,而6株分离株扩增出222 bp左右的典型创伤弧菌溶细胞素基因条带。在溶血试验中,创伤弧菌ATCC27562菌株的溶血圈与菌落直径之比达到3.0,1~6号分离株分别为2.3,2.0,2.8,2.0,2.5和2.1。在小鼠急性毒性实验中,创伤弧菌ATCC27562菌株的半致死量(LD_(50))是3.776×10~7CFU/m L,而3号分离株的LD_(50)为2.218×10~8CFU/m L。创伤弧菌ATCC27562菌株为较强毒株,而3号分离株为弱毒株。     

两种多糖对齐口裂腹鱼免疫性能的影响

探讨OKGM、OKGMS两种多糖对齐口裂腹鱼免疫性能的影响,将齐口裂腹鱼随机分为7组,两种多糖添加剂量分别为质量分数0.4%、0.8%、1.6%,饲喂60 d,测定齐口裂腹鱼血清免疫及抗氧化指标,并采用RT-PCR技术检测组织MyD88、IRF7基因相对表达量。结果表明,OKGMS1.6组能显著提高齐口裂腹鱼血清IgM活性、ACH50含量;OKGMS0.4、OKGMS0.8、OKGM0.4、OKGM0.8组均能显著降低血清MDA的含量;OKGMS与OKGM均能提高血清SOD活性;OKGMS能上调齐口裂腹鱼肠道MyD88基因mRNA相对表达量及肝脏、脾脏、中肾IRF7基因mRNA相对表达量;OKGM能上调肠道、头肾、中肾MyD88基因mRNA相对表达量及肠道、肝脏、脾脏、中肾IRF7基因mRNA相对表达量。结果表明：适量添加OKGM、OKGMS能提高齐口裂腹鱼抗氧化活性及免疫性能。     

唾液乳杆菌素Salivaricin SJH-8基因信息与生物学特性研究

以实验室从水产动物白斑鱼肠道中分离鉴定的一株唾液乳杆菌SJH-8为研究对象,根据Class IIb类抗菌肽ABP-118结构基因序列设计引物,以SJH-8基因组为模板可扩增出一段大小为702bp的基因片段,经测序和分析得出Salivaricin SJH-8结构基因与ABP-118的结构基因相似度达95%以上。根据基因序列推测出组成Salivaricin SJH-8的α肽和β肽的氨基酸序列,并进行化学合成。当二者分别存在时无抑菌活性,而将二者等比例混合时可表现出对革兰氏阳性菌的广谱抑菌活性。该细菌素具有较强的热稳定性和p H稳定性,可被胰蛋白酶水解;且经溶血实验证明该细菌素基本不会造成细胞溶血毒性,因此是一种环境友好型抗菌物质,具有作为食品或饲料防腐剂的潜力。     

珠江口水产源乳酸菌资源库的构建及优良乳酸菌的高通量筛选

目的构建珠江口水产养殖动物源的乳酸菌资源库,开发一套较为完善的高通量筛选优良乳酸菌的方法。方法采集珠江口水域多种水产动物的肠道,研磨,稀释涂布于含溴甲酚紫及碳酸钙的MRS平板上,挑取有溶钙圈的单菌落,进行过氧化氢酶实验以排除产气菌。提取细菌的基因组作模板, PCR扩增16S rDNA基因,根据测序结果进行同源性比对分析确定乳酸菌的种属,建立乳酸菌库。进一步借助96孔板培养技术,将乳酸菌与水产致病菌(指示菌)混合培养,根据对指示菌的抑菌效果,确定具有优良抑菌活性的乳酸菌。结果从水产动物肠道中筛选出乳酸菌14属71种1638株,获得了15株对常见水产养殖致病菌(嗜水气单胞菌、创伤弧菌、副溶血弧菌等)具有高效广谱抑制效果的菌株。结论本研究建立的乳酸菌菌种资源库,弥补了国内目前水产养殖来源乳酸菌菌株储备缺乏的现状,有望提供各类性能优良菌株用于渔业、畜牧业和食品生产。     

基于lolB和toxR基因的水产品中霍乱弧菌双重PCR检测方法

选择lolB和toxR两种基因序列设计2对特异性引物,建立一种针对霍乱弧菌所有生物型菌株的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为519bp和779bp。结果表明:在同步扩增中,仅霍乱弧菌模板可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌模板无任何扩增条带;敏感性检测结果显示,该双重PCR最低能检测3.42×103CFU/mL菌落数的霍乱弧菌。所建立的基于lolB和toxR两种基因的双重PCR检测方法特异性强、敏感性高、方法简单、用时短,可用于霍乱弧菌检测。     

基于16S rRNA基因序列鉴定秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼

通过对秘鲁茎柔鱼及澳洲双柔鱼的线粒体16S rRNA基因片段进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增和序列比对,确定2 种柔鱼品种的特异性位点,并由此设计品种特异性引物。利用多重PCR体 系对秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼进行快速、准确地鉴定和区分,并对该体系的灵敏度进行检验。结果表明：在多重 PCR体系下,秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼分别扩增出长度400、229 bp的品种特异性条带,2 种柔鱼的混合样品则同时 扩增出长度400、229 bp的条带;且该多重PCR体系可以检测澳洲双柔鱼中1%秘鲁茎柔鱼的掺入,检测限为0.1 ng。     

CODEHOP法设计引物克隆色盐杆菌ST307胆碱脱氢酶基因及其序列分析

目的研究色盐杆菌ST307甜菜碱的合成,克隆分析其胆碱脱氢酶betA基因片段。方法采用醇提法提取色盐杆菌ST307中的甜菜碱并检测,用CODEHOP在线程序设计简并引物扩增胆碱脱氢酶betA基因序列,并进行序列分析。结果色盐杆菌ST307细胞中积累甜菜碱,通过PCR获得长度为485 bp的betA基因片段。BLAST序列分析显示该基因序列与多个菌株的betA基因序列具有较高的同源性,最高达83%。核苷酸序列比对及进化树构建结果显示,色盐杆菌ST307胆碱脱氢酶基因序列与Pseudomonas fulva 12-X进化关系最为接近。结论 CODEHOP法设计的简并引物可信性较强,同时betA基因片段的成功克隆将为获得ST307胆碱脱氢酶基因的全序列、研究耐盐机制和遗传改良提供科学依据。     

牛乳腺炎金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆及序列分析

根据Genbank上公布的金黄色葡萄球菌肠毒素A的全序列,利用生物学软件Primer 5.0和oligo 6.0设计了一对特异性引物来扩增靶序列片段,经克隆预测序,结果表明扩增片段长度为101 bp,锦州分离株与标准菌株的基因片段序列相似性为100%,与Genbank上公布的金黄色葡萄球菌菌株(EF520720.1)SEA基因相似性达到99.14%。高度相似性结果为进一步研究建立分子检测技术奠定了实验基础。     

食品中副溶血性弧菌toxR和tdh基因双色荧光PCR检测方法的建立

目的 建立对副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）特异性检测toxR（跨膜转录激活蛋白）基因和tdh（热稳定性直接溶血素）毒力基因的Taqman探针双色荧光PCR检测方法。方法 根据副溶血性弧菌toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立Taqman探针双色荧光PCR扩增体系,进行特异性、灵敏度试验;对副溶血性弧菌分离菌株实施检测,了解其tdh基因和tdh基因分布情况。结果 结果表明,副溶血性弧菌标准菌株和3株从食物中毒患者中分离获得的分离株均出现toxR基因和tdh扩增曲线,而溶藻弧菌、单增李斯特菌等31株弧菌属其他菌株和肠杆菌科的菌株未见扩增曲线。从食品中分离的37株副溶血性弧菌分离株均未携带tdh毒力基因。副溶血性弧菌检测灵敏度可达到3.6×102 cfu/mL。结论 该方法可用于同时检测食品中副溶血性弧菌的特异性和毒力基因。     

应用聚合酶链式反应和限制性内切酶酶切技术鉴别鳕鱼

大西洋鳕鱼（Gadus morhua）作为一种具有高营养价值的海洋经济鱼类,常常会被掺入劣质、价格低廉的阿拉斯加狭鳕鱼（Theragra chalcogramma）或白姑鱼（Argyrosomus argentatus）等。通过对大西洋鳕鱼、阿拉斯加狭鳕鱼和白姑鱼的线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunit Ⅰ,COⅠ）基因序列进行比对分析,分别设计特异性引物。结果表明：通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增得到大西洋鳕鱼和阿拉斯加狭鳕鱼COⅠ 基因扩增产物大小为579 bp,白姑鱼为399 bp;进一步使用BstE Ⅱ限制性内切酶对大西洋鳕鱼和阿拉斯加狭鳕鱼COⅠ 基因的PCR产物进行酶切,大西洋鳕鱼不能被酶切,而阿拉斯加狭鳕鱼被酶切为长度分别为361、218 bp的2 个片段,从而有效区分大西洋鳕鱼、阿拉斯加狭鳕鱼和白姑鱼。     

2种检测变形杆菌PCR方法的比较研究

选取atpD基因作为靶序列设计了2对引物,分别采用不同的PCR扩增条件,对3株变形杆菌属标准菌株,67株样品分离株及13株非变形杆菌属菌株进行扩增实验,结果2种PCR方法对3株标准菌株和66株样品分离株分别扩增出348 bp和596 bp的特异性片断,实验结果呈阴性的1株分离株经全自动微生物鉴定仪鉴定为阴沟肠杆菌。13株非变形杆菌属菌株均未有特异性条带产生。2种PCR方法检测变形杆菌,均具有快速、准确、灵敏、特异的优点。建立的引物2的PCR方法在检测时间、特异性、灵敏度方面比引物1的PCR方法更具优势。     

人源性嗜酸乳杆菌的分离及分子鉴定

从健康婴儿的新鲜粪便中分离纯化的10株乳杆菌,用嗜酸乳杆菌l6S rDNA的特异性引物和建立的PCR方法对乳杆菌分离株进行分子水平上的鉴定。结果表明,有3株菌和嗜酸乳杆菌参考菌株扩增出大小一致的目的片段,证明此3株菌为嗜酸乳杆菌。测序结果显示,3株分离菌株与标准菌株的同源性达到95%以上,进一步说明了3株菌为嗜酸乳杆菌。