干酪乳杆菌胞壁蛋白酶提取条件优化及其水解特性研究

干酪乳杆菌细胞壁蛋白酶是其蛋白水解系统中一个关键的蛋白酶.采用Ca2+-free法研究干酪乳杆菌细胞壁蛋白酶的提取方法,确定其最佳实验条件.菌体用含有30 mmol/L CaCl2的50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)缓冲液洗涤3次,然后用含有50.03 mmol/LEDTA-Na2的50 mmol/LTris-HCl(pH6.98)缓冲液悬浮,39.75℃保温,60 min后取出离心(4 500 r/min、20 min、4℃),上清液即粗酶液.用粗酶液与纯化后的酶分别水解各种酪蛋白,粗酶较纯化后的酶能产生更高的ACE抑制能力,而纯化后的酶水解β-酪蛋白产生的抗ACE活性能力最强.     

曲霉型豆豉酿造中米曲霉产蛋白酶作用条件研究

研究曲霉型豆豉酿造用米曲霉沪酿3.042产蛋白酶在其酿造过程中的最适作用条件。利用大豆豆汁培养基对米曲霉沪酿3.042菌株进行培养,并用(NH4)2SO4溶液对所产蛋白酶进行沉淀,脱盐处理后,研究该酶的最适作用pH及pH稳定性、最适作用温度及热稳定性以及Na Cl浓度对酶活力的影响。结果显示:该蛋白酶最适作用pH为6.0,酶活最高为1941U/m L,在pH为6.0~8.0时稳定性较高;最适作用温度为50℃,酶活为2658U/m L,在40℃以下其酶活力较稳定;Na Cl对淀粉酶酶促反应有明显的抑制作用,随着Na Cl浓度的升高,其抑制效果越明显。     

草鱼消化道粗蛋白酶的部分性质

用丙酮脱脂然后用磷酸盐缓冲溶液从草鱼肠道中提取一种主要含有酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的粗蛋白酶。该粗酶水解血红蛋白的最适pH=3～4，水解酪蛋白的最适pH值有2个，分别为pH4．4和PH10．3。水解牛血红蛋白的最适作用温度为37℃，水解酪蛋白的最适作用温度为45℃。酸性蛋白酶在50℃保温30min后只有大约20％的最初活性被保留，而要使碱性蛋白酶丧失80％的最初活力需要在60℃保温30min。     

安卡红曲霉酸性蛋白酶分离纯化及部分酶学性质分析

安卡红曲霉（Monascus anka）CICC 40806培养液经硫酸铵分级沉淀和CM Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析两步分离纯化,得到纯度较高的胞外酸性蛋白酶,然后对其性质和动力学进行研究。结果表明M.?anka酸性蛋白酶的最适反应pH值为3.0,pH值稳定范围为3.0～7.0,最适反应温度为50?℃,低于50?℃时酶具有较好的稳定性,50?℃时的衰减常数为0.569。M.?anka酸性蛋白酶以酪蛋白为底物时反应活化能为28.85?kJ/mol,相对较低。M.?anka酸性蛋白酶具有一定的耐盐性,当NaCl质量分数为7%时,最适条件下反应时相对酶活力为12%。以酪蛋白、米渣蛋白、牛血清蛋白为底物时,Km值分别为12.48、14.77、20.05?mg/mL,对米渣蛋白和酪蛋白的催化效率相对较高。M. anka酸性蛋白酶可能在米渣蛋白发酵降解中发挥积极作用。     

一种米曲霉蛋白酶的分离纯化及酶解特性研究

对米曲霉固态发酵所产蛋白酶分离纯化,采用硫酸铵盐析、DEAE-FF层析、Butyl-HP层析和Superdux 7510/300GL凝胶层析得到一种电泳纯的蛋白酶,SDS-PAGE显示分子量大小为27 ku左右。以酪蛋白为底物时,该蛋白酶Km=1.23 g·L-1,Vm=27.03μg·m L-1·min-1,最适反应条件为50℃,p H9.0。该蛋白酶对酪蛋白水解活性最高,而对牛血清蛋白的水解活性很低;对牛胰岛素B链上-Phe-Val-,-Cys-Gly-,-Glu-Ala-和-Arg-Gly-组成的肽键有较强的切割能力,酶切位点较多,对疏水性氨基酸具有较高的选择性,为米曲霉所产蛋白酶在食品上的应用提供有力的参考。      

中国蛤蜊内源酶性质的研究

研究了中国蛤蜊的肌肉与消化腺中内源酶的性质。结果表明:1中国蛤蜊肌肉中蛋白酶最适温度为60℃,最适p H为7.0与9.0,可能存在同工酶;Pb2+对蛋白酶活力有激活作用;Ca2+对酶活力有抑制作用;Mg2+与Cu2+在5mmol/L时,对酶活力有激活作用,随着浓度升高对酶活力有抑制作用;Mn2+在5~15 mmol/L时,对酶活力影响不大,在20 mmol/L时对酶活力有激活作用。2消化腺中蛋白酶最适温度为60℃,最适p H 8.0;Pb2+对蛋白酶活力有激活作用;Mn2+对酶活力有抑制作用;Mg2+与Ca2+在5 mmol/L时,对酶活力有抑制作用,随着浓度升高有促进作用。Cu2+在5~15 mmol/L时对酶活力有促进作用,当浓度为20 mmol/L时,对酶活力有抑制作用。3肌肉中淀粉酶最适温度为40℃,最适p H 10.0;Mn2+、Ca2+对淀粉酶活力有促进作用;Pb2+在5~10 mmol/L时对酶活力有促进作用,在15~20 mmol/L时对酶活力有抑制作用;Mg2+在5~10 mmol/L时对酶活力有抑制作用,在15~20 mmol/L时对酶活力有促进作用;Cu2+在5 mmol/L时对酶活力有促进作用,随着浓度升高,对酶活力有抑制作用。4消化腺中淀粉酶最适温度为40℃,最适p H为9.0;Ca2+在20 mmol/L时对淀粉酶活性有促进作用,低于此浓度有抑制作用。Pb2+、Mg2+、Cu2+和Mn2+对淀粉酶活性皆有不同程度的抑制作用。     

瑞士乳杆菌细胞壁蛋白酶提取研究

瑞士乳杆菌细胞壁蛋白酶是其蛋白水解系统中一个非常重要的蛋白酶。本实验采用螯合Ca2+的方法对瑞士乳杆菌细胞壁蛋白酶的提取进行了研究,并确定了细胞壁蛋白酶提取的最佳实验条件。菌体用含有30mmol/LCaCl2的50mmol/LTris-HCl(pH7.10)缓冲液洗涤三次,然后用含有45mmol/LEDTA-Na2的50mmol/LTris-HCl(pH6.50)缓冲液悬浮,43℃保温,蛋白酶就会释放出来,90min后取出离心(4500r/min,20min,4℃),上清液即为粗酶液。粗酶液再经DEAE Sepharose CL-6B纯化,比酶活力提高了1.8倍。     

酒曲中高蛋白酶产生菌筛选及酶学性质研究

利用脱脂牛奶平板法从宋河酒曲中分离得到6株有明显水解圈的蛋白酶产生菌,其中水解圈直径与菌落直径之比最大为8.84,经鉴定为芽孢杆菌。以此菌种通过发酵培养提取出粗酶液,然后对该蛋白酶的酶学性质进行研究。试验表明,该蛋白酶的最适酶活力温度为40℃,在40℃～50℃热稳定性较好;该蛋白酶最适pH值为11.0,在pH值为9.0～11.0稳定性较好,在pH6.0条件下酶活力很快丧失;金属离子Fe2+对该蛋白酶有激活作用,Cu2+、Zn2+和Pb+有抑制作用,Mg2+、Ca2+和Li+对该蛋白酶酶活性影响不大。     

酱油发酵用2种米曲霉中性蛋白酶的酶学性质比较

米曲霉产蛋白酶的性质对酱油品质有重要的影响。研究以一株产中性蛋白酶的米曲霉CICIM F0899为研究对象,首先对其进行扫描电镜观察,与米曲霉沪酿3.042比较表明F0899的分生孢子头较小,分生孢子大于沪酿3.042。其次对F0899和沪酿3.042产蛋白酶酶学性质研究表明F0899产蛋白酶在20～40℃保持稳定,最适反应温度为60℃,在pH 6.0～8.0时保持稳定,最适反应pH为8.0,在盐浓度为18%的条件下,仍能保留20%的酶活,可达沪酿3.042的2.2倍,Ag+对F0899有严重的抑制作用,Fe3+没有明显的抑制。因此,米曲霉CICIM F0899产的蛋白酶在耐高温、耐低pH和耐高盐的性能优于沪酿3.042。     

日本曲霉酸性蛋白酶的分泌表达、性质及其在猪肉嫩化中的应用

为研究日本曲霉酸性蛋白酶的分泌表达、性质及其在猪肉嫩化中的应用。将日本曲霉来源的酸性蛋白酶基因(AjproA1)在毕赤酵母中高效表达,经5L发酵罐高密度发酵后测得该酸性蛋白酶酶活力为669.6U·mL^-1,蛋白质量浓度为6.64mg·mL^-1。氨基酸多重序列比对结果表明:该酸性蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶A1家族,与海枣曲霉来源的酸性蛋白酶同源性最高(73%),是一个新型的酸性蛋白酶。采用强阴离子交换层析柱对该酸性蛋白酶进行纯化得到电泳级纯酶,纯化后分析测得该重组酸性蛋白酶(AjproA1)的最适催化条件为pH值3.0,反应温度为45℃,在pH值为3.0~6.0及温度为40℃以下具有良好的稳定性。该酸性蛋白酶对不同蛋白质水解的分析结果表明,该酶底物水解特异性广泛,对酪蛋白组分中的κ-酪蛋白表现出最高水解活力。利用该酸性蛋白酶对猪肉进行处理,发现该酶能够有效降低猪肉剪切力,起到嫩化效果。研究结果旨在为新型酸性蛋白酶的开发及其在肉类嫩化中的应用提供理论参考。     

2种蛋白酶酶解曲拉干酪素条件优化及抗氧化性比较

以曲拉干酪素为原料、水解度为指标,在酶解时间、酶解温度、pH值、曲拉干酪素质量浓度、酶添加量单因素试验基础上,采用响应面试验对碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶解工艺条件进行优化,并对2 种酶解液的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基清除率,Fe2＋、Cu2＋螯合能力和还原力等抗氧化性指标进行比较。结果表明,碱性蛋白酶和胰蛋白酶分别在酶解时间3.8、2.5 h,酶解温度49.8、47.8 ℃,曲拉干酪素质量浓度60、35 g/L,pH 8.5、7.5,酶添加量140、2 900 U/g时水解度最大,为24.25%和13.57%。碱性蛋白酶解液超氧阴离子自由基清除率、Fe2＋螯合能力显著低于胰蛋白酶解液（P＜0.01）;羟自由基清除能力高于胰蛋白酶解液（P＞0.05）;2 种蛋白酶酶解液在酶解液质量浓度1～5 mg/mL时,Cu2＋螯合能力、DPPH自由基清除率和还原力随质量浓度均呈上升趋势,Cu2＋螯合能力低于Fe2＋螯合能力（P＞0.05）,DPPH自由基清除率和还原力二者差异显著（P＜0.01）。2 种蛋白酶对酶解物抗氧化性指标影响不同,碱性蛋白酶酶解物抗氧化性相对较优。     

海参肠组织蛋白酶D的提取及酶学特性研究

本研究以海参肠为原料,采用p H3.0 50 mmol/L甘氨酸-盐酸缓冲体系,按1∶6（w/v）的料液比,在4℃浸提1 h,获得海参肠组织蛋白酶D的粗酶液。以酸变性牛血红蛋白为底物,进行酶活测定,并研究了该酶的酶学性质。结果表明,海参肠组织蛋白酶D粗酶的最适p H为3.0,在p H3.0⁷.0之间稳定性较好;最适反应温度为50℃,在4⁴0℃具有较高稳定性。5 mmol/L的金属离子Mg²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺和K⁺对该酶有激活作用,而Fe³⁺和Fe²⁺则对其有抑制作用。天冬氨酸蛋白酶抑制剂Pepstatin A对该酶活性有较强的抑制作用。上述结果说明,在本研究条件下提取获得的海参肠组织蛋白酶D粗酶是一种酸性蛋白酶,其组成以天冬氨酸蛋白酶为主。      

酶解水牛奶制备抗凝血肽的工艺研究

目的:本文以新鲜水牛奶为原料,研究木瓜蛋白酶、中性蛋白酶及碱性蛋白酶复合酶解、混合酶解水牛奶的作用,比较不同水解方式的作用效果;并采用凝血酶滴定改进法测定水解液抗凝血活性。方法:分别进行三种蛋白酶单因素水解实验,确定各种酶的最适水解条件;在此基础上进行复合酶解与混合酶解实验,测定水解度和抗凝血活性。结果:木瓜蛋白酶的最适水解条件为:水解温度60℃、水解时间2.0 h、p H5.0、料水比1∶2（v/v）、酶用量6000 U/（m L底物）;中性蛋白酶的最适条件为:水解温度40℃、水解时间3.0 h、料水比1∶2（v/v）、p H6.0、酶用量6000 U/（m L底物）;碱性蛋白酶的最适条件为:水解温度50℃、水解时间4.0 h、料水比1∶2（v/v）、p H8.0、酶用量6000 U/（m L底物）。复合酶解法制备的水解液其抗凝血活性均高于混合酶解,最高抗凝血活性为52.0 ATU/m L。结论:本实验条件下,加酶组合为\     

牛肉成熟过程中氧化对钙激活酶活性及降解的影响

为了探究牛肉宰后成熟过程中氧化对钙激活酶活性及降解的影响,在牛屠宰后立即取其背最长肌,注射不同浓度氧化剂（0 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl ;50 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl;200 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl;500 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl）。真空包装后于4 ℃成熟。分别在0、1、3、7、14 d时取样,通过活性电泳和蛋白免疫印迹进行分析钙激活酶的活性和降解情况。结果表明：在牛肉的宰后成熟过程中,随着氧化程度的提高,μ-钙激活酶活性逐渐减弱,降解程度逐渐增强,而m-钙激活酶活性几乎未发生变化。因此,氧化促进了μ-钙激活酶的降解并抑制了其活性。     

不同因素对酪蛋白酶解产物与锌盐螯合效果的影响

本研究采用酶解法制得酪蛋白酶解产物,分析了不同锌源、酶解产物浓度、酶解产物与Zn2+质量比、反应体系pH值、反应温度、螯合时间等因素对酶解产物与锌盐螯合效果的影响,确定了酪蛋白酶解产物与Zn2+螯合的适宜反应条件。研究表明,ZnSO4·7H2O与酪蛋白酶解产物的螯合能力显著高于醋酸锌或氯化锌与酪蛋白酶解产物的螯合能力(p<0.05)。当酶解产物浓度为0.04g/ml、酶解产物与Zn2+质量比为4:1、反应pH值为6.0、反应温度为40℃、螯合时间为20min时螯合效果较好。     

一种米曲霉耐盐蛋白酶的纯化及酶学性质分析

采用硫酸铵沉淀、Q-HP阴离子交换柱和Superdux 75凝胶柱等技术,从酱油大曲中纯化得到一种耐盐蛋白酶,经飞行时间质谱鉴定为钙蛋白酶RIM13,属于一种半胱氨酸蛋白酶。该蛋白酶的最适温度为50?℃;最适pH值为6.5;稳定温度为40?℃;稳定pH值为7.0;Mn2＋促进蛋白酶活力,Fe3＋、Fe2＋、Cu2＋、Ca2＋、K＋、Na＋抑制蛋白酶活力,以上金属离子对蛋白酶二级结构也产生不同程度的影响;米氏常数Km为2.43?g/L,最大反应速率Vm为103.09?mg/（L·min）。在5、10?g/100?mL和15?g/100?mL的NaCl质量浓度条件下,蛋白酶保留的酶活力分别为77.22%、54.39%以及41.15%。该蛋白酶在高盐度环境下保持较高的酶活力,因此具有潜在的工业应用价值。     

磷脂酰丝氨酸合成酶发酵及反应条件的研究

研究重组磷脂酰丝氨酸合成酶表达条件及其用于酶法合成磷脂酰丝氨酸的反应条件。结果表明,在50 mL培养基中,菌体浓度为OD600=0.6时,用0.5 mmol/L的IPTG,在温度为20℃,转速为120 r/min的条件下,诱导12 h后,重组磷脂酰丝氨酸合成酶活力可达1.33 U/mL,是优化前的1.66倍。酶法转化磷脂酰丝氨酸的最适温度为38℃,最适pH为8.0,最适离子是12 mmol/L Mn2+,最适表面活性剂是1.0%Trition X-100。在最适条件下,磷脂酰丝氨酸转化率可达33.15%。     

分子量对酪蛋白多肽抗氧化活性的影响

在对酪蛋白酶解产物制备工艺进行优化的基础上,对不同分子量抗氧化肽(>3ku,1～3ku,<1ku)的抗氧化活性进行了评价。首先对酶的种类、酶底物比及水解时间进行了单因素实验,最终确定采用碱性蛋白酶,在pH8.0,55℃,底物浓度5%,酶底物比0.192AU/g的条件下,酶解4h所得水解物抗氧化活性最高。经过超滤和凝胶过滤层析分离获得不同分子量的抗氧化肽,并采用2,2′-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS+.)、羟自由基和超氧自由基清除活性评价其抗氧化性。结果表明,ABTS+.清除活性与分子量呈负相关(r=-0.898,p<0.01),分子量低于1ku组分活性最强(2mg/mL,Trolox当量为2.08±0.05mmol/L);分子量低于3ku的抗氧化肽羟自由基清除活性较高(IC50:1～3ku,4.43±0.03mg/mL;<1ku,4.35±0.06mg/mL);分子量高于3ku组分主要分布在3～5ku,超氧自由基清除活最强(10mg/mL,66.1%±1.0%)。     

海沃德猕猴桃巯基蛋白酶的催化特性与稳定性

对以海沃德猕猴桃残次果提取的巯基蛋白酶进行了动力学研究,考察了一些外加剂对酶活的影响,同时初步探讨了酶液的稳定性。结果表明:以酪蛋白为底物的猕猴桃巯基蛋白酶的Km值为6.56×10-3mmol,Vmax为163.93mg·mL-1·min-1;在其底物浓度为1.0g/L时,该酶的最适温度和pH分别为55℃和5.5;L-半胱氨酸、2-巯基乙醇、硫代硫酸钠、EDTA以及葡萄糖等外加剂对酶具有明显的激活效果,且EDTA的激活作用最强;抗坏血酸、碘乙酸和过氧化氢等外加剂对酶则具有抑制作用。在最适酶促反应条件下,于4℃温度存放的酶液活性随时间延长呈急剧的降低,并以pH为3.5存放条件下的降低最少,约可保存80%的酶活性。     

产β-甘露糖苷酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究

本研究通过初筛（魔芋粉为唯一碳源并结合刚果红染色法）和复筛（利于对硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷法测定β-甘露糖苷酶活力）,从采集的森林土壤中筛选产β-甘露糖苷酶的菌株,获得1株酶高产菌株B19。通过显微形态、革兰氏染色、生理生化特征、16S r DNA序列及系统发育进化树分析等方法,将其鉴定为肠杆菌属（Enterobacter sp.）。菌株B19所产的β-甘露糖苷酶为胞内酶,在37℃、200 r/min条件下培养48 h后,测得的酶活力为1.26 U/m L。初步酶学性质研究表明:该酶的最适反应p H和最适反应温度分别为7.5和50℃,且在p H6.0⁸.0和温度45⁵0℃稳定性较高,浓度为10 mmol/L的Mn2+和Mg2+对该β-甘露糖苷酶具有激活作用,但K+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Co2+及Zn2+抑制酶活力。该菌株可作为产β-甘露糖苷酶的潜在菌株。