重组毕氏酵母产中性纤维素酶条件的优化

通过对6个重组毕氏酵母转化子的产酶试验,筛选出一个优良转化子。在摇瓶条件下对该重组毕氏酵母的发酵过程进行了研究,得到适宜的培养条件为:250 mL三角瓶装液量30 mL,培养基起始pH4.8,此后不加控制,接种量10%,发酵过程中每隔24h补加1%的甲醇对产酶有明显的促进作用,中性纤维素酶活力可达1 144U/mL。研究结果表明:重组毕氏酵母中性纤维素酶的适宜催化条件为:50℃、pH 6.0;Zn2+和Mg2+对该酶有激活作用,Fe2+、Fe3+和Cu2+对该酶有抑制作用。牛仔服水洗试验结果显示:重组毕氏酵母中性纤维素酶可以明显降低靛蓝对牛仔服的反染作用,其工业应用前景良好。     

重组毕赤酵母表达蛋清溶菌酶发酵条件的优化

该研究以甲醇诱导型重组毕赤酵母（Pichia pastoris） NCY-2为研究菌株,在摇瓶水平上首先考察了诱导时间、甲醇含量、诱导pH及诱导温度对蛋清溶菌酶表达的影响,然后通过正交试验设计优化出了该菌株的最佳发酵条件,并进一步研究了摇瓶发酵过程中的菌体生长和酶活力随时间的变化规律。研究结果表明,蛋清溶菌酶的最适诱导时间为96 h,甲醇含量为2%,诱导pH值为3.5,诱导温度为20 ℃;在此条件下发酵液的蛋清溶菌酶酶活力达到775 U/mL,是优化前的2.2倍。 关键词：中图分类号：Q815 文章编号：0254-5071（20１7）02-0054-04 doi：     

基因重组毕赤酵母产蛋清溶菌酶发酵工艺及表达条件的优化

以甲醇诱导型蛋清溶菌酶基因重组毕赤酵母（Pichia pastoris）NCY-2为研究菌株,选用麦芽汁为培养基,首先通过单因素试验,对培养基锥形瓶种类、原麦芽汁稀释度及外加氮源进行了优化,在此基础上,采用均匀设计试验,得到菌株NCY-2的最佳发酵工艺条件为发酵温度31 ℃、pH 5.5,转速220 r/min,接种量4%;蛋清溶菌酶最佳表达条件为诱导温度18 ℃、诱导pH 4.4、转速190 r/min、甲醇初始添加量为0.3%（之后每隔24 h分别添加体积分数1.0%、1.5%、2.0%,诱导72 h结束）。在此优化条件下,摇床水平发酵液中蛋清溶菌酶酶活力可达到962.4 U/mL。     

重组毕赤酵母产果糖基转移酶发酵条件的优化

果糖基转移酶(EC 2.4.1.9)是利用蔗糖为底物制备低聚果糖的关键酶。利用前期构建的产果糖基转移酶的重组毕赤酵母为出发菌株,对其进行发酵优化。最适发酵产酶条件为:装液量30 m L/250 m L、V(甘油)∶V(甲醇)=1∶20、初始pH为5.5、诱导温度为30℃、初始甲醇浓度为1.0%、后续甲醇浓度为1.5%、硫酸铵浓度10 g/L、诱导时间为120 h。在优化的发酵产酶条件下,重组果糖基转移酶酶活力达218.3 U/m L,较优化前提高了5倍。     

人胰岛素B27K-DTrI前体在毕氏酵母中表达条件的优化

目的优化甲醇酵母表达系统,提高B27K-DTrI前体表达量。方法用不同浓度的G418 YPD平板、联合Real-time PCR筛选高拷贝菌株。优化高拷贝菌株的最佳起始诱导吸光度A、诱导时间、诱导剂浓度等表达条件。结果筛选到高拷贝菌株S3菌,最佳诱导条件为诱导起始A600约6.0,甲醇诱导浓度0.75%,诱导时间72 h,目的蛋白表达量118 mg/L。结论通过条件优化实验,为人胰岛素B27K的产业化提供了可靠的实验基础。     

人胰岛素B27K-DTrI前体在毕氏酵母中表达条件的优化

目的 优化甲醇酵母表达系统,提高B27K-DTrI前体表达量.方法 用不同浓度的G418 YPD平板、联合Real-time PCR筛选高拷贝菌株.优化高拷贝菌株的最佳起始诱导吸光度A、诱导时间、诱导剂浓度等表达条件.结果 筛选到高拷贝菌株S3菌,最佳诱导条件为诱导起始A600约6.0,甲醇诱导浓度0.75％,诱导时间72 h,目的蛋白表达量118 mg/L.结论 通过条件优化实验,为人胰岛素B27K的产业化提供了可靠的实验基础.     

超氧化物歧化酶重组酵母的构建及其发酵条件的优化

超氧化物歧化酶(SOD)由于具有高效清除氧自由基的作用而广泛用于食品、日化和医药领域。作者研究了提高SOD产量的基因工程新方法。利用密码子优化后人源铜锌超氧化物歧化酶基因,构建亚克隆及表达载体,最终转化进巴斯德毕赤酵母进行表达。通过正交试验,分析工程菌的最适摇瓶表达条件。摇瓶正交试验确定最优表达条件为:28℃,诱导剂体积分数1.0%,接种体积分数1.0%,最优表达水平为2 339.4 U/mL,与现有的一些研究相比,其表达量提高了近3倍。这些结果表明:对人源铜锌SOD经过适当的密码子优化和发酵条件优化,使酵母表达量显著提高,有助于解决SOD原料来源的局限。     

重组大肠杆菌产谷氨酰胺转氨酶培养基及发酵条件优化

对已构建好的表达谷氨酰胺转氨酶的大肠杆菌Rosetta DE3的摇瓶培养条件及发酵条件进行优化,所获优化培养基配方为葡萄糖4.0g/L,酵母膏3.0g/L,NH4Cl 4.0g/L,Na2HPO42.0g/L,K2HPO41.0g/L,MgSO4.7H2O 1.0g/L,NaCl 3.0g/L。得菌株发酵培养的最佳优化条件为装液量为25mL,接种量为5%,加IPTG浓度为0.6mmol/L,诱导时间为4h。     

毕赤酵母产类人胶原蛋白发酵条件的优化

胶原蛋白是结缔组织中一种重要蛋白质,具有抗皱、抗老化和补钙壮骨的功效,在食品工业中应用广泛.由于胶原蛋白的需求量大,因此利用重组微生物生产胶原蛋白成为近年来的研究热点.该文采用重组有类人胶原蛋白基因的毕赤酵母,通过优化培养基成分,使其在无机盐培养基中表达胶原蛋白.首先,类人胶原蛋白在每24 h补加体积分数1.5％甲醇诱...     

毕赤酵母发酵生产甲醇蛋白工艺条件的优化

利用实验室选育驯化出的高产甲醇蛋白的毕赤酵母(Pichia pastorisYM-SCP02)作为甲醇蛋白生产菌种,对甲醇蛋白发酵生产过程中的关键因素进行较为全面的考察和优化,初步确定了摇瓶水平发酵各因素的最优条件为接种量8%,分段发酵温度采用0~36 h,30℃,36~64 h,28℃,初始pH值为5.0,初始甲醇添加量为1.2%,装液量为50 mL/250 mL摇瓶,转速为200 r/min。在此条件下,得到的甲醇蛋白最高产量(细胞干质量)为19.3g/L。     

重组毕赤酵母发酵生产α-葡聚糖酶的放大研究

研究了毕赤酵母高密度发酵组成型表达α-葡聚糖酶,从6.8 L发酵罐逐级放大至5000 L发酵罐的放大工艺。采用恒定p H和控制甘油残留浓度和溶解氧相结合的调控策略,进行了多批次的发酵试验。结果表明:三磷酸甘油醛脱氢酶启动子驱动的α-葡聚糖酶的生成具有生长偶联特征,集中在对数生长期和稳定期。6.8 L发酵罐中上清酶活达1253 U/m L,中试放大至50 L发酵罐中产酶最高达1300 U/m L,500 L发酵罐中酶活为740 U/m L。5000 L规模发酵罐中产酶达到589 U/m L。建立了以甘油作为碳源,发酵调控简单的工艺,避免了使用甲醇带来的安全问题,适合放大生产。     

重组猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的优化表达及疫苗活性研究

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要致病原,在全世界范围内对养猪业造成了巨大的经济损失。猪圆环病毒2型Cap蛋白(PCV2-Cap)是制备猪蓝耳病疫苗的主要靶蛋白。针对目前PCV2疫苗生产工艺复杂、成本较高的问题,本研究利用毕赤酵母表达系统研究PCV2-Cap蛋白的重组表达及疫苗活性,将PCV2-Cap基因序列去除核定位信号序列(NLS)后,经密码子偏好性优化,构建重组表达载体,并转化至毕赤酵母宿主菌X-33,经Zeocin抗性筛选获得重组菌株。SDS-PAGE和Western blot结果显示Cap蛋白在酵母表达系统中成功表达,蛋白质大小为26 ku。5 L罐高密度发酵小试,得到PCV2-Cap蛋白在发酵上清液中的浓度约为0.53 mg/m L,占总蛋白的23.5%。动物免疫试验显示重组Cap蛋白能刺激机体产生特异性抗体。结果表明,PCV2-Cap基因在毕赤酵母中实现了分泌表达,为PCV2-Cap毕赤酵母亚单位疫苗的研制提供了数据支持。     

杂合抗菌肽MgJ基因在毕赤酵母中表达条件的优化

为确定杂合抗菌肽MgJ基因的最佳诱导表达条件,将构建好的重组表达载体pPICZαA-MgJ经SacⅠ线性化处理,电转入巴斯德毕赤酵母GS115,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,聚合酶链式反应（polymerase chainreaction,PCR）扩增验证,甲醇诱导表达。优化杂合抗菌肽MgJ诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度、初始菌体浓度表达条件。结果表明杂合抗菌肽MgJ的最佳表达条件为：28 ℃、250 r/min诱导培养,每24 h添加体积分数0.5%的甲醇,诱导时间120 h,MgJ表达量可达11.9 mg/L。纯化后获得的表达产物MgJ对S. aureus ATCC 29213有较好的抑菌活性,最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）为10 μg/mL。     

过氧化物酶A4-Prx在毕赤酵母中的优化表达

以来源于不动杆菌Acinetobacter sp.SM04的过氧化物酶A4-Prx的毕赤酵母工程表达菌株GS115/pPIC9K-A4-Prx为研究对象,优化其表达培养条件以提高该菌株对于目的蛋白A4-Prx的表达量。本论文首先研究了培养基成分与诱导条件对表达量的影响,结果表明培养基的pH、甘氨酸浓度和诱导温度对外源蛋白的产量均有显著影响。采用Box-Behnken设计,利用Design Expert软件进行二次回归分析得到了目的蛋白的最优表达条件为:诱导培养基pH 7.0、甘氨酸浓度为0.11%及诱导温度30℃。在此优化条件下重组蛋白的理论表达量达129.87 mg/L,约为未优化下的2倍,实验验证实际表达量达128.94 mg/L,且重组表达的过氧化物酶A4-Prx对酒糟蛋白饲料(DDGS)和食品中的玉米赤霉烯酮毒素(Zearalenone,ZEA)具有高效降解能力。本研究为过氧化物酶的工业化高密度发酵奠定了基础,推动生物降解ZEA研究的进展。     

牛透明质酸酶PH-20核心区在毕赤酵母中的高效表达

目的利用毕赤酵母表达牛源透明质酸酶核心区,以实现透明质酸酶的重组制备。方法将去除信号肽和锚定区域的牛源透明质酸酶PH-20成熟肽编码序列按照毕赤酵母密码子偏爱性进行优化,然后连入pPICZaA表达载体并转入毕赤酵母SMD1168H菌株。0.5%（v/v）甲醇诱导表达72 h后采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid,DNS）法测定培养液上清中透明质酸酶活性。结果包含PH-20核心序列（1332 bp）的重组酵母经甲醇诱导表达72 h,培养液上清中透明质酸酶活性达135.2 U/mL。结论实现了牛源透明质酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达。     

酵母分泌表达重组人神经生长因子

目的研究人神经生长因子基因工程制备工艺。方法构建了表达质粒pPIC9K/rhNGF,转化毕赤酵母,筛选多拷贝转化子,进行摇瓶表达,正交试验选择表达条件。结果得到高表达高外泌的工程菌,并确定了纯化步骤,经疏水层析和阳离子交换层析纯化后,取得高活性高纯度的rhNGF。结论为该药的规模生产奠定了基础。     

从毕赤酵母中提取外源重组蛋白的超声破碎条件及优化

建立适用于从毕赤酵母菌中提取外源重组蛋白的超声破碎方法。采用Western Blotting免疫印记技术检测从毕赤酵母菌中提取的外源人脂联素蛋白活性,并以外源人脂联素蛋白活性作为考察指标,采用单因素和L9(33)正交试验设计,对超声破碎条件进行优化。结果表明：在外源人脂联素蛋白活性最高的情况下,超声破碎条件为超声破碎功率450W、时间25min、时间间隔(工作时间:间歇时间)10:10(s/s),此时细胞破碎率为(67.8±2.1)%。若在超声破碎时添加1mmol/L PMSF,虽对细胞破碎率并无显著影响,但外源人脂联素蛋白活性将会明显增高。     

牡蛎抗菌肽Molluscidin的密码子优化、重组毕赤酵母表达及抑菌活性

目的:利用重组毕赤酵母高效表达抑菌活性较好的牡蛎抗菌肽Molluscidin.方法:按照毕赤酵母密码子偏好性优化合成牡蛎抗菌肽Molluscidin,利用生物信息学方法分析其基本理化性质,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后与表达载体pPICZαA连接,构建重组质粒pPICZαA-CgMoCo,电转至毕赤酵母X-33,利用博...     

牛肉风味强化肽表达条件的初步研究

牛肉风味强化肽(BeefyMeatyPeptide,BMP)最初是从牛肉的消化液中分离的八肽,能增强鲜味,可作为一种类似于谷氨酸钠的天然风味强化剂。文章介绍了利用基因工程技术在酵母菌中表达BMP的方法,对构建的Pichiapastoris酵母工程菌株X-33/pPICZαA-BMP进行了发酵表达,确定了菌株的表型、高密度生长及表达条件。试验结果显示:构建的工程菌株为甲醇利用慢表型Muts,优化后的种子培养基摇瓶条件下菌体密度OD600达到28。在pH3.0、诱导72h、甲醇添加量为0.5%的条件下BMP有最大表达,选用BSM有利于诱导表达BMP;建立了SephadexG-25分离纯化、RP-HPLC检测BMP的有效方法。     

毕赤酵母液态发酵产木聚糖酶条件研究

用麦麸、米糠农业废弃物作为主要原料生产木聚糖酶,对毕赤酵母液态发酵产木聚糖酶的条件进行研究。结果表明,最适产酶条件:以质量浓度20%的麦麸作为碳源,4%酵母浸膏作为氮源,调节初始pH值5.5,培养温度30℃,摇瓶发酵装液量6%,培养时间130 h,在此条件下毕赤酵母液态发酵产木聚糖酶最高活力达到2192 IU/mL。