石墨烯增敏的SPR技术应用于HIV1 p24抗原的检测

目的:建立石墨烯增敏的表面等离子体共振技术(Surface Plasmon Resonance,SPR)用于检测HIV1 p24,为HIV感染者的早期快速筛查提供一种检测方法.方法:石墨烯通过静电连接在采用聚乙二醇高分子处理的SPR芯片表面,HIV1 p24特异性抗体通过石墨烯表面的羧基官能团和HIV1 p24抗体表面...     

共振瑞利散射法测定尿中痕量砷

建立了一种测定尿中痕量砷的共振瑞利散射(RRS)新方法。在pH=5.6的HAc-NaAc缓冲溶液中,I3-与硫酸耐而蓝生成稳定的离子缔合物,体系共振瑞利散射增强。当加入微量As(Ⅲ)时,碘能定量氧化As(Ⅲ),导致共振瑞利散射减弱,在0.10~4.0μg/25 mL浓度范围内,共振瑞利散射强度的改变值ΔIRRS与As(Ⅲ)浓度呈线性关系,方法检出限为1.65μg/L。用于尿中痕量砷的测定,回收率为93.5%~106.7%。     

曲妥珠单克隆抗体生物学活性检测方法的建立及比较

目的建立4种检测曲妥珠单克隆抗体Trastuzumab生物学活性的方法,并进行比较。方法利用表面等离子共振技术(Surface plasmob resonance,SPR)建立Trastuzumab的BIAcore分析方法,同时建立抗体对人乳腺癌SKBR3细胞增殖抑制活性的检测方法、基于SKBR3细胞的抗体结合特性检测方法及抗体与ErbB2抗原结合活性的ELISA检测方法,验证各方法的重复性,并对不同检测方法进行比较。结果 BIAcore法的偶联最佳pH值为5.0,样品浓度为0.05～5.00 nmol/L,动力学常数(KD)为0.19 nmol/L;Trastuzumab体外抑制SKBR3细胞增殖的半数有效浓度(EC50)为0.145μg/ml(R2>0.98);基于SKBR3细胞的抗体结合特性的EC50值为0.124μg/ml(R2>0.98);Trastuzumab抗体与ErbB2抗原结合活性的EC50值为0.143μg/m(lR2>0.98);4种检测方法重复性较好,检测结果基本一致。结论 4种检测方法均能有效地反映Trastuzumab的生物学活性,为快速、简便地筛选曲妥珠单克隆抗体提供了多种检测方法。     

四价脑膜炎球菌多糖疫苗中结合物多糖抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的建立一种检测A、C、W135和Y群四价脑膜炎球菌多糖疫苗中各血清群多糖蛋白结合物的双抗体夹心定量ELISA检测方法,并进行验证。方法以白喉类毒素无毒变异体(CRM197)特异性单抗为包被抗体,HRP标记的脑膜炎球菌A、C、W135和Y群多糖特异性单抗为捕获抗体,建立可定量检测脑膜炎球菌各血清群结合物多糖含量的双抗体夹心ELISA法,确定方法的最佳线性范围和检测限,并对方法的特异性、准确性和重复性进行验证。结果定量检测A群脑膜炎球菌结合物(GAMP-CRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为3.75~120 ng/ml,检测限为3.75 ng/ml;定量检测C群脑膜炎球菌结合物(GCMP-CRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为1.875~30 ng/ml,检测限为0.938 ng/ml;定量检测W135群脑膜炎球菌结合物(GWMPCRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为7.5~240 ng/ml,检测限为7.5 ng/ml;定量检测Y群脑膜炎球菌结合物(GYMP-CRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为1.875~60 ng/ml,检测限为0.938 ng/ml。A、C、W135、Y群双抗体夹心ELISA法均能特异性地检测相应的结合物多糖抗原含量,而不与其他群的结合物多糖抗原发生交叉反应;A、C、W135、Y群双抗体夹心ELISA法的回收率均在80%~120%之间,检测相应的结合抗原样品时,变异系数(CV)均小于15%。结论建立的双抗体夹心ELISA法特异性较强,准确性较高,重复性良好,可用于四价脑膜炎球菌多糖疫苗中各血清群结合物多糖抗原的定量检测。     

流感病毒裂解疫苗中游离的痕量甲醛反向HPLC检测方法的建立

目的 建立测定流感病毒裂解疫苗中游离的痕量甲醛的反向HPLC法。方法 优化衍生化条件后,2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH)衍生流感病毒裂解疫苗中游离的甲醛,利用反向HPLC法进行痕量甲醛的测定,色谱条件:色谱柱:TC-C18(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:乙腈-水(45∶55);进样量:10μl;流速:1.0 ml/min;检测波长:360 nm;柱温:35℃。确定DNPH衍生物的检测波长,对建立的方法进行线性、准确度、精密度、稳定性、重现性验证,确定方法的定量限及检出限。取4批不同厂家的流感病毒裂解疫苗,按建立的方法,2批衍生化、2批直接进行痕量甲醛检测。结果 确定衍生化溶液为磷酸溶液(5 mol/L),衍生温度为20℃,30 min为最终体系反应时间。DNPH衍生物的检测波长为360 nm。甲醛浓度在10.02~250.5 ng/ml范围内,与峰面积呈良好的线性关系,R2=0.999 8;6份甲醛DNPH衍生物样品检测的平均回收率为99.93%,RSD为0.34%;甲醛DNPH衍生物样品连续重复进样6次的峰面积均值为724.15,RSD为0.74%;甲醛DNPH衍生物不同时间重复6次检测的痕量甲醛平均为8.04μg/ml,RSD为0.98%,24 h内稳定性好;6份同批样品的游离痕量甲醛平均为8.06μg/ml,RSD为0.68%;痕量甲醛的最低检出限为0.01μg/ml,定量限为0.03μg/ml。4批流感病毒裂解疫苗痕量甲醛均低于《中国药典》三部(2010版)中规定的50μg/ml。结论 本文建立的流感病毒裂解疫苗中游离痕量甲醛的反向HPLC检测方法,具有简单、高效、灵敏、痕量等特点,适用于疫苗中游离痕量甲醛的测定。     

催化共振光散射法测定血浆中痕量甲醛

在稀硫酸介质中,溴酸钾与吡啰红Y能聚集成较大粒径的纳米微粒而使共振光散射增强,而甲醛能催化溴酸钾氧化吡啰红Y而导致体系共振光散射减弱,据此建立了一种灵敏、简单、快速测定血浆中痕量甲醛的新方法。结果表明,在适宜的反应条件下,在574.6 nm波长处的RLS强度与甲醛的浓度在一定范围内呈良好线性关系;该方法甲醛的线性范围在1.141×10-2~2.279μg/mL,相关系数为r=0.999 7,检出限为3.804 ng/mL。已成功用于血浆中痕量甲醛的测定,血样分析甲醛的相对标准偏差为4.9%~7.9%,平均回收率为101.6%(n=6)。     

牛血清白蛋白单克隆抗体的筛选与双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的筛选高效抗牛血清白蛋白(BSA)单克隆抗体细胞株,并建立BSA抗原检测的双抗体夹心ELISA法。方法分别采用辛酸-硫酸铵法和葡萄球菌A蛋白亲和层析法纯化单抗,并进行抗体类型、腹水效价、特异性和相对亲和力测定;应用纯化的单抗建立BSA双抗体夹心ELISA检测法,并进行初步应用。结果筛选出4株可稳定分泌抗BSA单抗的杂交瘤细胞株,抗体类型为IgG,抗体滴度均可达10-6,特异性良好,相对亲和力较高。建立的双抗体夹心ELISA法线性范围为1.25～20ng/ml,R2>0.98,灵敏度为1.25ng/ml。结论已筛选出高效抗BSA的单抗,并建立了BSA双抗体夹心ELISA检测方法。     

牛血清IgG双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立及应用

目的建立牛血清Ig G(bovine immunoglobulin G,BIg G)抗原的双抗体夹心ELISA定量检测方法。方法用BIg G-Fc免疫BALB/c小鼠,制备抗BIg G单抗,确定包被抗体及酶标抗体后,建立定量检测BIg G抗原的双抗体夹心ELISA方法,并验证该方法的准确度、精密度、稳定性、特异性,确定该方法的线性范围和定量限度。应用建立的方法检测不同厂家、不同批次牛血清及纯化EV71样品中BIg G抗原残留量。结果建立了以3E12D2为包被单抗(8.0μg/ml,100μl/孔),4A2G1B1-HRP为酶标抗体(1∶1 000稀释,100μl/孔)定量检测BIg G的双抗体夹心ELISA方法,该方法的线性范围为0.3~9.6 ng/ml,R~20.99,定量限度为0.3 ng/ml;回收率在94.1%~108.5%之间,同一实验者重复检测和不同实验者检测的变异系数均10%;37℃放置3和6 d的稳定性均90%;该试剂样品与BIg G可发生特异性反应,与其他动物源血清无交叉反应。9批牛血清中BIg G含量均存在差异;精纯样品较粗纯样品BSA和BIg G均明显去除,但BIg G占牛血清残留量(BSA+BIg G)的比例却明显上升。结论建立的BIg G抗原的双抗体夹心ELISA方法符合定量检测需要,可用于牛血清的质量质控及残留量检测。     

表面等离子体激元共振方法检测三聚氰胺的含量

基于三聚氰胺与DNA的反应,建立了一种利用表面等离子体激元共振技术检测三聚氰胺的方法。固定在芯片表面的NH2-A15捕获T15-biotin和链霉亲和素的混合溶液。当有三聚氰胺存在时,由于三聚氰胺可以与胸腺嘧啶(T)结合导致连接到芯片表面的T15-biotin和链霉亲和素减少,SPR信号与没有加入三聚氰胺时的信号值相比有所下降。因此,SPR信号的变化可反应三聚氰胺的浓度。该方法对三聚氰胺的最低检测浓度为0.32 n M,为检测牛奶中三聚氰胺的含量提供了可能。     

Triton X-100共振能量转移荧光猝灭法测定尿中α-萘酚

研究了α-萘酚与Triton X-100之间的共振能量转移的最佳条件,建立了Triton X-100共振能量转移荧光猝灭法测定α-萘酚的新方法。在pH7.5的Tris-HCl缓冲溶液中,在300.8 nm,Triton X-100的荧光猝灭强度与α-萘酚浓度成正比,工作曲线的线性范围为0.36~1.80μg/L,方法的检出限为0.12 ng/mL,RSD为0.7%~1.1%,平均加标回收率为100.9%(n=6)。该方法已用于尿样测定,结果满意。