中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法的建立

目的建立中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法。方法参照已发表的中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)基因序列,针对其结构蛋白基因设计1对特异性引物,提取感染CSBV的囊状幼虫RNA,反转录为cDNA,以其为模板,进行PCR扩增,对检测方法进行优化,验证该方法的特异性及敏感性,并对31份临床样品进行检测。结果所建立的CSBVRT-PCR检测方法特异性和敏感性良好,以含CSBV结构蛋白基因的重组质粒为模板,最低可检出10pgDNA。临床症状诊断和电镜观察均为阴性的22份样品经RT-PCR检测,有2份扩增出目的条带。结论已建立了中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法,为CSBV检测、流行病学调查及动物模型的建立奠定了基础。     

中蜂囊状幼虫病病毒重庆株编码序列分析

目的分析中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)重庆株(CSBV-CQ)编码序列的分子特性。方法采用RT-PCR法从重庆地区中蜂囊状幼虫病病死幼虫体内扩增CSBV编码序列片段,并进行序列测定,使用ClustalW2软件进行多序列比对分析,利用推导的氨基酸序列进行保守结构域BLAST和同源建模,采用MEGA 4软件的邻接法(neighbor-joining)中的最大可能性算法(maximum likelihood method)构建系统进化树。结果扩增的片段拼接出8 358 nt的片段,约占SBV基因组长度的95%;CSBV-CQ与CSBV-GZ的核苷酸和氨基酸序列同源性均最高,在CSBV-GZ的2 270² 320位碱基缺失51 nt核苷酸;多聚蛋白N-末端包含2个小RNA病毒衣壳蛋白药物结合口袋(drug-binding pocket)结构域(domain),C-末端包含RNA解旋酶(RNA helicase)和RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)2个结构域;基于基因组水平的系统进化分析显示,所有东方蜜蜂分离株、西方蜜蜂分离株AmSBV-Kor19构成1个基因型,但基于基因组片段的分子系统进化分析显示,部分毒株包含2个基因型片段。结论 SBV基因型间存在基因重组现象。     

重庆地区中蜂囊状幼虫病病毒型特异性遗传变异分析

目的分析重庆地区中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)的遗传多样性。方法采用RT-PCR法从重庆地区中蜂囊状幼虫病病死幼虫体内扩增CSBV的2段结构蛋白和1段非结构蛋白的编码序列,并克隆至pMD18-T载体进行双向序列测定,所得序列在NCBI上进行BLAST搜索,以进行同源性分析;应用ClustalW2软件进行多序列比对分析;应用SNAP软件计算同义替换率(Synonymous substitution rate,dS)、非同义替换率(Nonsynon-ymous substitution rate,dN)及其比值(dS/dN);采用MEGA 4软件的邻接法(Neighbor-joining)中的最大可能性算法(Maximum likelihood method)构建系统进化树。结果 CSBV重庆分离株片段SB1-2、SB6-7和SB14-15的序列同源性高于99.06%,序列保守,3个片段序列均只发现少数点变异碱基,属于亚洲型,与东方蜜蜂广州分离株和韩国分离株的亲缘关系最近;CSBV重庆分离株存在特有的核苷酸和氨基酸位点,且与亚洲型分离株存在广泛的共有基序;亚洲型分离株的替换率高于欧洲型分离株。结论 CSBV分离株存在型特异的遗传变异规律。     

中蜂囊状幼虫病病毒结构蛋白的表达及其抗血清的制备

目的原核表达中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sarbood virus,CSBV)结构蛋白,并制备其抗血清。方法采用RT-PCR法扩增CSBV结构蛋白基因片段,克隆至pGEX-4T-1载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Gluthathione-Sepharose 4B亲和层析纯化后,免疫小鼠,制备抗血清,并进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约52 000,以可溶性形式表达;纯化后纯度可达95%以上;制备的抗血清可识别天然CSBV结构蛋白。结论成功在大肠杆菌中表达了CSBV结构蛋白,并制备了其抗血清,为进一步研究囊状幼虫病病毒与宿主的相互作用及开发血清学诊断方法奠定了基础。     

中蜂囊状幼虫病毒VP1基因在杆状病毒表达系统中的表达

目的利用杆状病毒系统表达中蜂囊状幼虫病毒(chinese sacbrood virus,CSBV)结构蛋白VP1基因。方法提取感染CSBV的中蜂囊状幼虫总RNA,RT-PCR法扩增VP1基因,克隆至载体pFastBacI中,构建重组转座质粒pFastBacI-VP1,转化至感受态大肠埃希菌DHl0Bac中,获得重组杆粒rBacmid-VP1,转染至昆虫细胞sf9中,获得第1代重组杆状病毒,经透射电镜观察杆状病毒粒子;病毒连续传代3次后,RT-PCR鉴定重组杆状病毒,SDS-PAGE检测VP1蛋白的表达情况,Western blot检测表达产物的反应原性。结果重组杆粒经PCR鉴定构建正确;第1代重组杆状病毒经透射电镜观察,可见杆状病毒粒子;重组杆状病毒以M13通用引物和VP1基因特异引物进行PCR扩增,分别可见3 263和963 bp的片段,大小均与理论值一致;CSBV VP1基因能够在sf9细胞中表达,表达的重组VP1蛋白相对分子质量约31 000,可与兔抗CSBV-VP1阳性血清发生特异性反应。结论成功利用杆状病毒表达系统表达了CSBV VP1基因,为深入研究CSBV的感染机制和蜜蜂的免疫机制以及中蜂囊状幼虫病血清诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

中蜂囊状幼虫病毒VP1基因的优化表达及其免疫原性分析

目的原核表达优化的中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)的VP1基因,并分析其免疫原性。方法根据大肠埃希菌密码子偏爱性对野生型CSBV VP1(wt VP1)基因进行优化(opti VP1),将基因wt VP1和opti VP1分别克隆至p GEX-6P-1原核表达系统,构建原核表达质粒p GEX-6P-wt VP1和p GEX-6P-opti VP1,分别转化E.coli BL21,经IPTG诱导表达,并对诱导温度、IPTG终浓度及诱导时间进行优化,诱导蛋白经Western blot鉴定;重组蛋白经GSH-琼脂糖凝胶层析纯化;分别用PBS、纯化的GST标签蛋白、纯化的重组蛋白及CSBV纯化病毒免疫小鼠,经间接ELISA法检验各组小鼠的血清抗体效价。结果优化后的VP1基因序列降低了密码子影响指数,提高了密码子适应指数;质粒p GEX-6P-wt VP1和p GEX-6P-opti VP1经鉴定证明构建正确;最佳诱导表达条件为:IPTG终浓度0.8 mmol/L,30℃,220 r/min诱导8 h;诱导表达蛋白占菌体总蛋白百分比由wt VP1菌株(5.49±0.30)%提高至opti VP1菌株(59.7±0.51)%,纯化后纯度可达0.5 mg/ml;兔抗GST标签抗体及兔抗CSBV血清均与优化后的重组蛋白发生特异性反应;重组蛋白组小鼠二免后可产生较高水平抗体,明显高于PBS组和GST标签蛋白组(P0.05)。结论通过密码子优化实现了CSBV结构基因VP1的高效表达,表达蛋白可诱导小鼠机体产生特异性抗体,具有良好的免疫原性,为探讨CSBV感染的分子发病机制和制备抗CSBV病毒的多克隆抗体奠定了基础。     

囊状幼虫病病毒的流行及其感染治疗

目的调查重庆、浙江和云南蜜蜂幼虫囊状幼虫病病毒(sacbrood virus,SBV)的感染率,并观察抗微生物肽(amicrobial peptide)小分子阳离子六肽(short cationic hexapeptides,SP6)对人工感染的中蜂囊状幼虫病的治疗效果。方法采用RT-PCR法检测重庆、浙江和云南蜜蜂幼虫SBV的感染率。将SP6溶于糖水,隔天饲喂1次SBV人工感染的发病中华蜜蜂蜂群,连续给药9次,测定蜂群幼虫死亡率,评价其对感染的防治效果。结果重庆和浙江中蜂幼虫SBV感染率分别为85.6%和4.76%,云南西方蜜蜂幼虫SBV感染率为6.67%;重庆和浙江西方蜜蜂幼虫及云南中蜂幼虫未检出SBV。0.1%SP6给药组能极显著地降低SBV感染蜂群的幼虫死亡率,防治效果达到74.48%。结论在重庆、浙江和云南地区均检出SBV,但SBV在不同地区对蜜蜂种群的危害程度不同,在重庆中蜂群广泛流行。SP6对SBV感染中蜂有良好的防治效果,具有药物开发价值。     

中蜂囊状幼虫病毒LN-QY株VP1蛋白的空间结构与B细胞抗原表位预测

目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP1蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法以CSBV LN-QY株RNA为模板,RT-PCR扩增结构蛋白VP1基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,对经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对,获得LN-QY株VP1的核苷酸序列和推导的氨基酸序列,建立VP1结构蛋白的3D模型,在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域,亲水性,表面可能性以及抗原指数等参数。结果 VP1结构蛋白的空间构象比较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于47-53,139-145,273-284氨基酸区段。结论本研究为CSBV LN-QY株VP1蛋白表位疫苗的设计以及血清诊断试剂盒的研制奠定了理论基础。     

中蜂囊状幼虫病毒LN-QY株VP3蛋白空间结构及其B细胞抗原表位的预测

目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP3蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法采用RT-PCR法从感染CSBV的蜜蜂幼虫总RNA中扩增结构蛋白VP3基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,提取质粒,双酶切鉴定并测序,通过与SBV-KOR、CSBV-UK株VP3基因序列的比对,获得LN-QY株VP3基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列,建立VP3蛋白的3D结构。在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域、亲水性、表面可能性以及抗原指数等参数。结果 VP3结构蛋白的空间构象较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于4个区域:25-50,101-109,112-120,250-268氨基酸区段,其中,可能出现抗原表位的2个区域在100-150和250-300氨基酸区段,应作为抗原表位研究的重点区域。结论预测了CSBV LN-QY株VP3蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位,为CSBVVP3蛋白单克隆抗体的制备以及表位疫苗的设计奠定了理论基础。     

感染性疾病RNA病毒性病原体生物信息学检测方法的建立

目的以艾滋病病毒(HIV)为研究对象,建立感染性疾病RNA病毒性病原体的生物信息学检测方法。方法应用DNase-非序列依赖的单引物扩增技术,将艾滋病患者血清过滤后,经DNase处理去除血清中的内源DNA,提取血清病毒RNA,反转录合成病毒RNA的双链cDNA,TaqⅠ酶切双链cDNA,加接头分子,并以接头分子为引物非特异扩增病原基因;PCR产物克隆后,酶切鉴定并测序,经GenBankBLAST软件进行序列分析。结果非序列依赖的单引物扩增HIV患者血清中外源基因得到多个DNA片段;重组克隆质粒经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,可见插入片段存在;将所有PCR产物测序,序列与已知病原基因序列一致。结论应用DNase处理及非序列依赖的单引物扩增方法可以检测RNA病毒性病原体。     

新型狂犬病病毒中和抗体检测方法的建立

目的建立一种安全、快速、经济的新型狂犬病病毒中和抗体的检测方法。方法在狂犬病病毒弱毒株HEP-Flury基因组Ψ区插入增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein eGFP)基因,利用反向遗传技术,拯救重组病毒rHEP-eGFP,分别采用荧光显微镜观察、直接免疫荧光染色鉴定及电镜观察等方法对rHEP-eGFP病毒进行鉴定;分别绘制rHEP-eGFP和亲本毒株HEP-Flury的生长动力学曲线;将rHEP-eGFP在BHK-21细胞中连续传代9次,测定各代次rHEP-eGFP的滴度,荧光显微镜下观察eGFP的表达;采用TCID50法检测狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11和rHEP-eGFP的毒力;以rHEP-eGFP病毒为抗原,建立新型荧光抗体病毒中和试验(fluorescent antibodyvirus neutralization,FAVN)-eGFP,对25份犬血清的抗体效价进行测定,并与标准FAVN检测结果进行比较。结果经荧光显微镜观察、直接免疫荧光染色鉴定和电镜观察表明,成功拯救出rHEP-eGFP病毒;重组病毒rHEP-eGFP与亲本病毒HEP-Flury的生长特性相似;rHEP-eGFP连续传代9次,均能稳定表达eGFP;CVS-11的毒力为108TCID50/ml,rHEP-eGFP的毒力为107.3TCID50/ml;FAVN-eGFP与FAVN测定25份犬血清抗体效价的结果具有良好的一致性。结论建立的新型狂犬病病毒中和抗体检测方法(FAVN-eGFP)准确度高,特异性好。     

检测乙型脑炎减毒活疫苗中分枝杆菌污染的环介导恒温扩增法的建立

目的建立检测乙型脑炎减毒活疫苗中分枝杆菌污染的环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法。方法选择皮内注射BCG疫苗、人结核分枝杆菌标准株和临床株、牛分枝杆菌标准株和临床株、草分枝杆菌标准株和临床株、偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟脓分枝杆菌、戈登分枝杆菌、土地分枝杆菌、鸟分枝杆菌、施氏分枝杆菌、亚洲分枝杆菌共16株,对建立的LAMP法的灵敏度、精密度、适用性及特异性进行验证,分析其在乙型脑炎单一病毒收获液质量控制中的可行性。结果该方法对偶然、堪萨斯和鸟分枝杆菌的检测灵敏度为103CFU/ml,对其他分枝杆菌的检测灵敏度可达102CFU/ml,灵敏度良好;用建立的方法对同一批样品的6次检测结果均一致,2名试验人员分别每日检测每批样品,连续检测3 d,检测结果均一致,表明该方法精密度良好;乙型脑炎单一病毒收获液中的成分对实验结果无干扰作用,表明该方法适用性良好;分别加入百日咳杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌C3000 3种非分枝杆菌的乙型脑炎单一病毒收获液的检测结果均为阴性,表明该方法可区分分枝杆菌属细菌和非分枝杆菌属细菌,特异性良好。结论建立了检测乙型脑炎减毒活疫苗中分枝杆菌污染的LAMP法,该方法可用于检测乙型脑炎单一病毒收获液是否被分枝杆菌污染。     

金黄色葡萄球菌噬菌体扩增方法的建立

目的建立金黄色葡萄球菌噬菌体扩增方法。方法通过比较培养体系中宿主菌浓度、噬菌体效价、培养时间及氯化钙对金黄色葡萄球菌噬菌体扩增的影响,确定最佳噬菌体扩增条件。结果经优化后,扩增培养体系中金黄色葡萄球菌宿主菌浓度为1×10~7个/mL,噬菌体效价为1×10~3 PFU/mL,扩增培养6~8 h,噬菌体效价达较高水平,氯化钙对噬菌体扩增无影响。结论建立了金黄色葡萄球菌噬菌体扩增方法,为金黄色葡萄球菌噬菌体治疗制剂的研制奠定了基础。     

重组细胞中鼠细小病毒检测方法的建立及初步应用

目的建立生物技术产品用重组细胞中鼠细小病毒(Murine minute virus,MMV)污染的检测方法,并进行验证及初步应用。方法以NB324K细胞为指示细胞,建立MMV感染性检测方法,并以不同CCID50的MMV分别感染NB324K细胞,验证方法的灵敏度;通过设计针对编码非结构蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)保守序列的引物和探针,建立用于重组细胞中MMV检测的实时荧光定量PCR,并对其线性、特异性、精密性、灵敏度、最低检测限及试验可行性和干扰性进行验证;将NB324K细胞感染试验与荧光定量PCR法相结合,建立NB324K细胞感染-PCR法,并通过对大量样本的检测,分析荧光定量PCR法和NB324K细胞感染-PCR法的可行性。结果 NB324K细胞感染试验的灵敏度为0.2 CCID50;荧光定量PCR检测方法最佳线性范围为1×108～1×104拷贝/μl,R2达0.99以上,特异性良好,与其他种属的细小病毒均无交叉反应,试验内和试验间Ct值的变异系数(CV)均小于5%,试验内病毒定量拷贝数的CV在20%～30%之间,试验间病毒定量拷贝数的CV在20%～50%之间,灵敏度为5×103拷贝/μl,最低感染性病毒颗粒检测限为2 CCID50。该方法能够用于细胞样品中MMV的检测,部分样品基质对病毒的检测具有一定的干扰性。NB324K细胞感染-PCR法的灵敏度为0.02 CCID50,检测时间可缩短为96 h,与荧光定量PCR法分别对47份样品进行检测,结果均为阴性。结论成功建立了MMV荧光定量PCR检测方法和NB324K细胞感染-PCR法,可应用于重组细胞中MMV污染的检测,为进一步提高生产用重组细胞的安全性奠定了基础。