3种不同Protein A亲和层析填料纯化抗CD52单克隆抗体的比较

目的 比较3种Protein A亲和层析填料MabSelect SuRe、Protein A Diamond及UniMab 50纯化抗CD52单克隆抗体的载量及纯化效果.方法 将浓度为1.24 mg/mL的抗CD52单克隆抗体分别流经3种Protein A亲和层析填料,确保保留时间一致,检测流穿液的抗体浓度,以流穿液中...     

应用于抗体药物捕获的耐碱亲和层析介质性能的比较

目的比较应用于抗体药物捕获的耐碱的4种蛋白A亲和层析介质和2种小分子亲和层析介质的性能,为单抗纯化工艺的选择提供参考。方法利用两种单抗纯品(mAb1和mAb2)测定4种蛋白A亲和层析介质MabSelectSuRe、POROS MabCaptureA、Absolute High Cap、TOYOPEARL AF-rProtein A-650F和2种小分子亲和层析介质Mabsorbent A2P HF、Fabsorbent F1P HF在停留时间分别为4、6、8 min时的动态载量;利用含mAb2的发酵液,从回收率和杂质去除方面比较6种亲和层析介质的纯化效果。结果在5%穿透点,各介质对mAb1和mAb2的动态载量在35~73 g/L之间。小分子亲和层析介质Mabsorbent A2P HF纯化mAb2的回收率为89%,其他5种介质纯化mAb2的回收率均≥96%;6种介质纯化mAb2的宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)在2 000 ppm之内,蛋白A残留量在20 ppm之内。结论结合流速、动态载量、回收率和杂质去除效果等指标,可从6种亲和层析介质中挑选适用于抗体类药物下游纯化工艺的耐碱型蛋白A或小分子亲和介质。     

两种阴离子交换层析填料去除重组全人源抗程序性死亡配体1单克隆抗体宿主蛋白能力及动态载量的比较

目的比较两种阴离子交换层析填料Capto Q和Eshmuno Q去除重组全人源抗程序性死亡配体1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)单克隆抗体宿主蛋白(host cell protein,HCP)的能力以及动态载量。方法采用AKTA avant 25层析系统,通过实验设计(design of experiment,Do E)考查上样量、pH和电导率3个工艺参数变量对HCP去除的影响,设计条件为上样量范围40~60 mg IgG/m L gel,pH范围6.6~7.4,电导率范围1~4 ms/cm,阴离子交换层析采用抗体穿透模式。结果在设计的工艺参数范围内,随着pH的增加和电导率的减小,HCP去除效果有上升趋势;随着pH的减小和电导率的增加,动态载量有上升趋势。在最佳操作范围内当pH=7.0,电导率=1 ms/cm时,Capto Q的HCP去除能力为0.01%,载量为45 mg/m L gel;Eshmuno Q的HCP去除能力为0.02%,载量为35 mg/m L gel。结论阴离子交换层析能有效去除PD-L1单抗的HCP,去除率达50倍以上,动态载量Eshmuno Q达35 mg/m L gel,Capto Q达45 mg/m L gel。     

抗血管内皮生成因子单克隆抗体中试纯化工艺的建立

目的通过对小试条件优化,选择纯化抗血管内皮生成因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)单克隆抗体生物类似药的最佳条件,放大至中试规模,建立中试纯化工艺。方法 protein A亲和填料捕获收集液进行料液调节后,采用阳离子填料进行纯化。通过单因素试验,探讨protein A洗脱p H对收获液抗体质量的影响,以及阳离子洗脱p H、洗脱盐浓度和上样载量对收获液抗体质量的影响,分别经上述两步纯化获得抗VEGF单克隆抗体,再分别采用Protein A-HPLC检测单抗的浓度,高效毛细管电泳检测其纯度,SEC-HPLC检测其多聚体含量。结果通过小试优化,protein A最佳洗脱p H为3.8,阳离子层析最佳操作条件为上样载量40 mg/ml,洗脱p H 6.5,洗脱盐浓度(25 mmol/L PBS+100 mmol/L Na Cl)。按小试优化的条件放大至中试规模,无论是protein A还是阳离子层析均能够成功放大,最终下游纯化产物纯度为(98.3±0.2)%,多聚体含量为(1.6±0.3)%,均优于参比制剂。结论通过两步层析:亲和层析+阳离子层析的下游纯化组合方法得到的抗VEGF单克隆抗体的关键质量指标与参比制剂一致,为其进一步的工业放大提供了实验依据。     

复合模式介质Capto core 700纯化轮状病毒

目的采用复合模式介质Capto core 700纯化轮状病毒(rotavirus,RV),去除培养液中的残余细胞宿主蛋白和DNA,提高病毒收率。方法将RV LH9毒种接种Vero细胞,制备RV原液,澄清、超滤后,用Capto core 700纯化:样品LH9、LH9+150 mmol/L Na Cl[以缓冲液A(20 mmol/L PB+150 mmol/L Na Cl,p H 7.0)作为缓冲液]上样纯化分别标记为A、B组合,样品LH9+300 mmol/L Na Cl[以缓冲液B(20mmol/L PB+300 mmol/L Na Cl,p H 7.0)作为缓冲液]上样纯化标记为C组合,样品LH9+450 mmol/L Na Cl[以缓冲液C(20 mmol/L PB+450 mmol/L Na Cl,p H 7.0)作为缓冲液]上样纯化标记为D组合,洗脱,收集流穿峰,检测纯化后病毒的滴度和收率、RV RNA、RV抗原性、残余宿主细胞蛋白(HCP)和DNA;并用初步筛选出的纯化组合纯化3批RV超滤浓缩液,检测各项指标,进行进一步验证。结果用20 mmol/L PB+150 mmol/L Na CL缓冲体系和样品中加入150 mmol/L Na Cl的组合纯化RV,病毒收率在80%以上,病毒核酸完整,其抗原性未发生改变,可去除94%以上的HCP,残余DNA符合《中国药典》三部(2010版)标准。结论 Capto core 700纯化RV收率和残余蛋白去除效率均较高,组合B操作相对简便,工艺时间短,病毒收率高,更适于RV的纯化。     

Vero细胞疫苗生产过程中宿主细胞蛋白含量分析

目的了解Vero细胞疫苗中间产品中宿主细胞蛋白(Host cell protein,HCP)的含量变化。方法模拟Vero细胞疫苗生产工艺流程,制备Vero细胞HCP,免疫家兔制备Vero细胞HCP免疫血清,经Protein ASepharose CL-4B亲和层析,制备纯化的抗Vero细胞HCPIgG,通过SDS-PAGE和Western blot分析Vero细胞乙型脑炎疫苗及Vero细胞SARS疫苗各中间产品的蛋白、HCP及病毒抗原成分的含量变化。结果Vero细胞乙型脑炎疫苗和Vero细胞SARS疫苗中间产品中均存在一定量HCP,不同的纯化工艺均可以去除大部分HCP,随着生产工艺的进行,疫苗中间产品中HCP的含量逐渐降低,病毒成分的纯度逐渐增高,但纯化后产品中仍存在少量HCP。结论Vero细胞乙型脑炎疫苗和Vero细胞SARS疫苗均存在一定量HCP。     

单抗制品中CHO细胞宿主蛋白残留双抗夹心ELISA检测方法的建立

目的建立单抗制品中CHO细胞宿主蛋白(host cell protein,HCP)残留双抗夹心ELISA检测方法。方法确定双抗夹心ELISA方法的最佳工作条件,并对该方法的精密度和准确度进行验证,确定线性范围及最低检出限;用建立的方法与市售试剂盒分别检测低、中、高浓度HCP标准品及抗TNF-α单抗原液、抗VEGF单抗纯化工艺样品中的HCP。结果建立的双抗夹心ELISA法最佳抗体包被浓度为1.5μg/ml,酶标抗体浓度为1μg/ml,160 r/min,37℃孵育2.5 h;TMB 37℃孵育15 min;以630 nm为参比波长,450 nm为测定波长。该方法的线性范围为3.125~100 ng/ml,最低检测限为3.125 ng/ml;试验内变异系数(CV)和试验间CV均小于15%,回收率为85.3%~115.1%。与商品化试剂盒检测结果基本一致,可用于检测纯化工艺样品。结论已成功建立单抗制品中CHO细胞HCP残留双抗夹心ELISA检测方法,该方法可代替市售试剂盒用于CHO细胞HCP残留检测,可使检测成本降低30倍。     

减少重组蛋白TP25在Protein L层析中形成多聚体方法的建立

目的建立减少重组蛋白TP25在Protein L层析中形成多聚体的方法。方法通过在Protein L层析纯化重组蛋白TP25使用的洗脱缓冲液中添加半胱氨酸(L-cysteine,Cys)等保护剂,并采用碱性溶液中和洗脱液的方法优化多聚体去除条件,经非还原SDS-PAGE检测纯化过程中目的蛋白多聚体的变化情况,葡聚糖凝胶Sephadex G25层析去除洗脱液中Cys。结果去除Protein L层析形成多聚体的最适条件为:用含Cys终浓度为100 mmol/L的20 mmol/L柠檬酸溶液进行直接洗脱,并经0. 5 mmol/L的NaOH溶液中和。该条件下纯化的目的蛋白纯度可达95%以上,且多聚体含量大幅减少。葡聚糖凝胶Sephadex G25可有效去除半胱氨酸。结论在洗脱液中添加Cys可有效减少重组蛋白TP25在Protein L层析纯化过程中多聚体的形成。     

Sf9昆虫细胞宿主蛋白含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的建立Sf9昆虫细胞宿主蛋白(host cell protein,HCP)含量双抗体夹心ELISA检测方法。方法从Sf9昆虫细胞中提取总蛋白,免疫家兔,制备兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体,经辛酸-硫酸铵沉淀和CL-4B层析柱纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,间接ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性;用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,采用改良过碘酸钠法将HRP酶标记至纯化的抗体上作为酶标抗体,采用方阵滴定法确定双抗体夹心ELISA方法的最适工作条件。确定该方法的最佳线性范围及最低检测限,验证该方法的准确度及精密度。将表达戊型肝炎ORF2基因的重组杆状病毒感染Sf9细胞,收获病毒培养上清,制备3批纯化的重组蛋白,用建立的方法检测纯化过程中HCP含量的变化,验证其在纯化工艺中的适用性。与商品化试剂盒进行比较,检测两种方法的灵敏度及在制品中的适用性。结果纯化后的兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体纯度达90%以上,抗体效价为1∶10 000,可与Sf9细胞蛋白特异性结合。建立的双抗体夹心法ELSA方法最佳抗体包被浓度为20μg/ml,37℃孵育1 h;酶标抗体的工作浓度为1∶200,37℃孵育1 h;TMB室温显色30 min;测定各孔A450值。该方法的最佳线性范围为50~1 600 ng/ml,最低检测为50 ng/ml;不同浓度的Sf9细胞蛋白抗原回收率在87.8%~117%之间,变异系数均小于10%;制备的3批重组蛋白经超滤及层析纯化后,HCP含量均逐渐降低至小于50 ng/ml,纯化工艺可有效去除HCP;与商品化试剂盒比较,该方法更适用于检测戊肝类病毒颗粒样品。结论已成功建立Sf9昆虫细胞残余蛋白含量检测的双抗体夹心法ELSA方法,可用于检测Sf9昆虫细胞/杆状病毒表达系统纯化的重组蛋白中HCP含量。     

重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺的优化

目的优化重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺。方法采用试验设计(Design of Experiment,DOE)方法优化重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺,试验因子为中间清洗液Na Cl浓度(130~870 mmol/L)和洗脱液p H(3.50~4.20),试验响应变量为纯化后样品收率、纯度、残余宿主蛋白含量、外源DNA含量及蛋白A含量,通过DOE构建模型,预测中间清洗液Na Cl浓度和洗脱液p H范围。同时采用DOE方法验证预测工艺参数的稳定性。结果确定中间清洗液Na Cl浓度为400~700 mmol/L,洗脱液p H为3.55~3.75。试验因子在该参数范围内变动时,样品收率均大于80%,纯度均大于97%,外源DNA浓度均低于260 pg/mg,宿主蛋白含量均低于2 300 ng/mg,蛋白A含量均低于6.5 ng/mg。结论成功优化了重组抗CD52单克隆抗体的亲和纯化工艺,且具有较好的稳定性。     

一方圆玺 一朝国事

一方圆玺,不知见证了多少的历史风云!     

A SIMULATION OF A MOTIONLESS MIXER

Continuous laminar mixing in segmented twisted-tape motionless mixers is considered. A solution to the steady isothermal creeping flow of a Newtonian fluid in a twisted-tape mixer has been obtained via two-dimensional numerical procedures. The developed flow within a section of the mixer has been solved in a helical coordinate system by an iterative scheme. The resulting solution is rigorously correct in the absence of entrance and exit flows at the junction between sections. An algorithm is presented for the modelling of these junction flows via two-dimensional procedures. Simulated cross-sectional mixing patterns have been generated for comparison with experimental results

The performance of twisted-tape mixers is simulated for various designs, beginning with the particular geometry of the Kcnics Static Mixer, and for different operating conditions Results suggest that the rate of mixing as a function of the total twist per section is optimized with respect to pressure drop when sections contain 80 degrees of twist. The capability for rational improvement in other design and operating parameters is illustrated. The mechanisms of laminar mixing are discussed and quantified; of primary importance is the tendency for interfacial area to assume an orientation within each section which is favorable to mixing in subsequent sections.     

千碉之国·丹巴

丹巴县是四川省甘孜州的东大门.被誉为"深藏在横断山脉中的世外桃源",是嘉绒藏族风情文化的中心,属岷山、邛崃山区,是川西高山峡谷的一部分.文化底蕴厚重,民俗风情浓郁,区内遍布的古碉是藏族先民的建筑艺术杰作,具有悠久灿烂的历史.     

A MATHEMATICAL ANALYSIS OF A MEMBRANE BIOREACTOR CONTAINING A SLUDGE DISINTEGRATION SYSTEM

The activated sludge process is widely used to treat domestic and industrial wastewater. A significant drawback of this process is the production of “sludge”, the disposal of which can comprise a significant proportion of the total operating costs of a wastewater treatment plant. We analyze the steady-state operation of a membrane bioreactor system (MBR) incorporating a sludge disintegration unit (SDU) to reduce sludge production. We provide a qualitative understanding of the model by finding analytically the steady-state solutions of the model and determining its stability as a function of the residence time. In practice a target value of the mixed liquor suspended solids (MLSS) content within the membrane reactor is specified. Applying the mathematical technique of singularity theory we show that if the sludge disintegration factor is sufficiently high then the MLSS content is guaranteed to be below the target value. This model prediction, of key interest from a practical perspective, was not identified in the original investigation of this model, which relied upon numerical integration of the governing equations.     

一起制氮设备的故障分析

在浮法玻璃生产过程中,氮气流量保持恒定,是保持锡槽工况稳定的重要条件,是生产优质浮法玻璃的重要前提条件之一.只有制氮设备的稳定运行,才能保证氮气供应.本文就制氮空压机运行中出现的故障现象、原因进行了分析,并提出了改进措施.     

一种新型传动结构的斜坡辊道

浮法玻璃厂联合车间受工艺限制,往往将2楼熔制成形车间和1楼包装车间用斜坡辊道连接起来。而2楼与斜坡之间衔接的凸弧辊道、1楼与斜坡之间衔接的凹弧辊道,其结构形式往往成为设计及安装调试的难点。传统的弧段结构采用锥齿轮箱和同步带传动结构,与当前主流的通轴弧齿锥齿轮结构相比较为落后。本文对浮法玻璃车间斜坡辊道结构进行详细阐述,并提出了一种新的凸、凹弧辊道的传动结构。     

A MATHEMATICAL MODEL FOR A YANKEE HOOD

Drying of thin paper sheet on a Yankee cylinder equipped with a steam heated high velocity hood is examined. When possible infiltration of air from the surroundings is considered, then the process is fully determined by twelve variables. One of these can be chosen as an independent variable. An equation group of eleven equations is derived. The method of solution is iterative. Finally, a numerical demonstration example is presented.