脱羧酶基因ARO10的过量表达及其对Saccharomy cescerevisiae的β-苯乙醇合成代谢影响

为了验证脱羧酶在S.cerevisiaeβ-苯乙醇合成途径中的调控作用,本文从S.cerevisiae S288C中克隆脱羧酶基因ARO10,并构建由3-磷酸甘油酸激酶基因PGK1组成型强启动子控制的ARO10基因表达载体pYES2-Ppgk-ARO10,将重组载体导入S.cerevisiae S288C,研究ARO10基因过量表达对重组菌株中β-苯乙醇合成的影响。经摇瓶实验测定,携带pYES2-Ppgk-ARO10的转化子SP10在发酵60h时β-苯乙醇产量达到最大量1.0g/L,较野生型的对照菌提高16.3%。研究结果表明,脱羧酶是S.cerevisiae S288C中β-苯乙醇生物合成途径的关键酶之一,增加ARO10基因表达量有利于提高β-苯乙醇产量,研究为构建β-苯乙醇高产工程菌株奠定了重要基础。      

Cloning and Expression of AROIO Gene in Saccharomyces cerevisiae and It＇ s Influence on 3- （methylthio） -1-propanol Biosynthetic Metabolism

研究了脱羧酶ARO10基因克隆与过量表达对酿酒酵母INVSc1 3-甲硫基丙醇合成途径的代谢流量影响。将脱羧酶基因ARO10与穿梭质粒pYES2连接,构建其酿酒酵母表达质粒（载体）pYES2-ARO10,LiAc/SSD-NA/PEG方法转化酿酒酵母菌株INVSc1中进行表达,验证ARO10基因过量表达对发酵产物3-甲硫基丙醇影响。结果表明,构建的酿酒酵母转化子SC10-1发酵120 h时,3-甲硫基丙醇生成量达到0.90 g/L,与未导入脱羧酶ARO10基因的对照菌株相比,3-甲硫基丙醇产量提高55.2%。因此,S.cerevisiae s288c中脱羧酶（EC 4.1.1.72）是3-甲硫基丙醇生物合成途径的关键限速酶,其增强脱羧酶基因ARO10的克隆及基因表达,有利于提高3-甲硫基丙醇的合成代谢流量。     

ARO10基因在Saccharomyces cerevisiae中的克隆表达及其对3-甲硫基丙醇合成代谢的影响

研究了脱羧酶ARO10基因克隆与过量表达对酿酒酵母INVSc1 3-甲硫基丙醇合成途径的代谢流量影响。将脱羧酶基因ARO10与穿梭质粒pYES2连接,构建其酿酒酵母表达质粒(载体)pYES2-ARO10,LiAc/SSD-NA/PEG方法转化酿酒酵母菌株INVSc1中进行表达,验证ARO10基因过量表达对发酵产物3-甲硫基丙醇影响。结果表明,构建的酿酒酵母转化子SC10-1发酵120 h时,3-甲硫基丙醇生成量达到0.90 g/L,与未导入脱羧酶ARO10基因的对照菌株相比,3-甲硫基丙醇产量提高55.2%。因此,S.cerevisiae s288c中脱羧酶(EC 4.1.1.72)是3-甲硫基丙醇生物合成途径的关键限速酶,其增强脱羧酶基因ARO10的克隆及基因表达,有利于提高3-甲硫基丙醇的合成代谢流量。     

溶氧量对酿酒酵母及其工程菌的β-苯乙醇合成代谢的影响及调控效应

目的:研究溶氧量对酿酒酵母S288C及工程菌ARO8-10的β-苯乙醇合成代谢的影响及调控效应。方法:在5 L发酵罐中装液量60%,控制p H 5.0,温度30℃,通气比0.5~2.0 vvm,定时取样检测发酵液生物量、β-苯乙醇、L-苯丙氨酸转化率以及菌体相关代谢酶活性等。结果:通气条件在0.5~2.0 vvm范围时,野生型菌株S288C的生物量、异柠檬酸脱氢酶(ICDH)酶活力明显高于转氨酶基因ARO8与脱羧酶基因ARO10耦合过表达工程菌ARO8-10;ARO8-10的β-苯乙醇发酵产量、L-苯丙氨酸转氨酶、苯丙酮酸脱羧酶、G6PD、GK及PDC酶活力均明显高于S288C(P≤0.01)。在1.0 vvm通气条件发酵60 h时,ARO8-10的发酵液中葡萄糖已基本用尽,β-苯乙醇产量达到2.68 g/L,L-苯丙氨酸转化率达到47.3%,较S288C分别提高了44.4%和12.4%。1.0 vvm为β-苯乙醇发酵较适宜的通气条件。结论 :酿酒酵母的β-苯乙醇代谢与艾利希途径、莽草酸途径、EMP、PPP途径TCA循环等密切相关,构成其合成代谢网络,代谢途经多种酶相互影响;ARO8和ARO10基因耦合过表达,增强了L-苯丙氨酸氨基转移酶和苯丙酮脱羧酶活力,有利于提高G6PD、GK及PDC酶活力,β-苯乙醇代谢流量及产量。     

Saccharomy cescerevisiae氨基转移酶基因ARO8克隆及对3甲硫基丙醇合成的影响

酿酒酵母可通过艾希利（Ehrlich）途径将L-蛋氨酸转化为3-甲硫基丙醇等食品风味成分,本文研究了氨基转移酶及其基因在Ehrlich途径及3-甲硫基丙醇合成代谢的调控作用。从Saccharomyces cerevisiae S288C克隆氨基转移酶ARO8基因,并基于酿酒酵母-大肠杆菌穿梭型表达载体pYES-pgk,构建重组质粒表达载体pYES-pgk-ARO8,PEG/LiAc转化法将其导入S.cerevisiae S288C。结果表明,克隆的ARO8基因全长1503bp,与NCBI GenBank中酿酒酵母芳香族氨基转移酶Ⅰ编码基因ARO8的序列相似度为100%;构建的ARO8基因过表达工程菌S.cerevisiae AR8,其氨基转移酶活力为187U/mL,较野生型S288C菌株的酶活性提高1.63倍;工程菌AR8的摇瓶发酵3-甲硫基丙醇产量为0.76g/L,较野生型S288C提高28.8%。表明氨基转移酶Aro8p及其ARO8基因在S.cerevisiae 3-甲硫基丙醇合成代谢中发挥重要作用,增强其ARO8基因表达,有助于提高3-甲硫基丙醇的产量。      

Saccharomy cescerevisiae氨基转移酶基因ARO8克隆及对3甲硫基丙醇合成的影响

酿酒酵母可通过艾希利(Ehrlich)途径将L-蛋氨酸转化为3-甲硫基丙醇等食品风味成分,本文研究了氨基转移酶及其基因在Ehrlich途径及3-甲硫基丙醇合成代谢的调控作用。从Saccharomyces cerevisiae S288C克隆氨基转移酶ARO8基因,并基于酿酒酵母-大肠杆菌穿梭型表达载体pYES-pgk,构建重组质粒表达载体pYES-pgk-ARO8,PEG/LiAc转化法将其导入S.cerevisiae S288C。结果表明,克隆的ARO8基因全长1503bp,与NCBI GenBank中酿酒酵母芳香族氨基转移酶Ⅰ编码基因ARO8的序列相似度为100%;构建的ARO8基因过表达工程菌S.cerevisiae AR8,其氨基转移酶活力为187U/mL,较野生型S288C菌株的酶活性提高1.63倍;工程菌AR8的摇瓶发酵3-甲硫基丙醇产量为0.76g/L,较野生型S288C提高28.8%。表明氨基转移酶Aro8p及其ARO8基因在S.cerevisiae 3-甲硫基丙醇合成代谢中发挥重要作用,增强其ARO8基因表达,有助于提高3-甲硫基丙醇的产量。     

原生质体融合结合基因编辑技术显著提高酿酒酵母2-苯乙醇产量

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)已用于生产天然2-苯乙醇(2-phenylethanol, 2-PE),但其产量低，耐受性差。该研究筛选出3株具有不同优良性状的酿酒酵母菌株，其中菌株LSC-1的2-PE产量为3.41 g/L,菌株NGER对2-PE的耐受性达3.60 g/L,菌株S.C-1耐热性好并能在41℃下生长。以这3株菌为亲本，通过2轮原生质体融合获得融合子菌株RH2-16,对2-PE的耐受性提高了20%。以L-苯丙氨酸为底物，发酵转化36 h, 2-PE产量达到4.31 g/L,与亲本菌株LSC-1和2-PE工业生产菌株CWY132相比，分别提高26.4%和38.1%。利用CRISPR/Cas9系统，在RH2-16中构建了含突变的Ras特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子CDC25(W1416C)菌株，2-PE的产量提高了8%。在RH2-16中过表达艾氏途径合成2-PE关键基因ARO8,ARO10和ADH2未能提高2-PE产量。研究为筛选合成2-PE等天然产物的新型酿酒酵母菌株及其育种提供了一种有效策略。     

CYS3基因的敲除及其对Saccharomyces cerevisiae3-甲硫基丙醇合成代谢的影响

研究胱硫醚γ-裂解酶基因CYS3敲除对S. cerevisiae 3-甲硫基丙醇合成代谢的影响。将编码胱硫醚-γ-裂解酶的CYS3基因和抗性标记基因Zeocin克隆,构建敲除组件CYS3Δ:Zeocin,醋酸锂法将其转化导入S. cerevisiae S288C表达,构建CYS3基因敲除的工程菌。结果表明：摇瓶发酵120 h时,工程菌S. cerevisiae C3和S. cerevisiae S288C的3-甲硫基丙醇生成量分别为0.60 g/L和0.94 g/L,S. cerevisiae C3较野生型S288C的3-甲硫基丙醇生成量降低36.2%。说明CYS3基因敲除对S. cerevisiae的3-甲硫基丙醇有较大影响,并呈现负调节作用。     

高效表达木糖醇脱氢酶基因酿酒酵母的构建及木酮糖发酵的初步研究

通过RT-PCR方法克隆得到Candida tropicalis木糖醇脱氢酶基因xyl2,将该基因连入酵母表达载体pYES2的诱导型启动子GAL1下,构建表达质粒pYES2-xyl2;同时用从Pichia pastoris中克隆获取的甘油醛磷酸脱氢酶基因GAP换下GAL1基因,构建含组成型启动子GAP基因的表达质粒pYES2-GAP-xyl2;通过电转化法将其依次转入酿酒酵母S.cerevisiae INVSc1,山梨醇培养基上筛选的转化子经木糖醇梯度驯化培养,筛选出1株耐木糖醇浓度为20%的酿酒酵母重组菌株ZCX4和1株在半乳糖诱导下耐木糖醇浓度为15%的重组菌株YDX2。酶活测定表明,重组菌株ZCX4比酶活0.621 U/mg(蛋白),是YDX2比酶活的2.29倍。摇瓶发酵结果显示,重组菌株ZCX4木糖醇消耗76.46 g/L,木糖醇消耗率为76.46%,是重组菌株YDX2木糖醇消耗率的1.63倍,说明木糖醇脱氢酶实现了高效表达。     

毕赤酵母多基因组装系统的构建及其在2-苯乙醇合成中的应用

巴斯德毕赤酵母是一种优良的外源蛋白生产平台,近年来也被用于发酵生产高附加值化学品。为了使产品生产适应发酵工业的需要,常需要对毕赤酵母进行代谢改造,同时表达多个基因。该文设计并建立了一种毕赤酵母多基因组装系统,利用golden gate克隆实现多元件整合,并通过Cre-lox系统去除抗性标签。该系统可实现同时游离或整合表达多个基因,插入位点、启动子、终止子均可灵活调整。利用这一系统对毕赤酵母进行改造,用于发酵合成高价值化学品2-苯乙醇。通过游离表达比较不同来源的关键基因,并整合表达2-酮-3-脱氧-D-阿拉伯庚酮-7-磷酸合酶ARO3、ARO4^K229L和ARO5,分支酸变位酶ARO7^G141S和预苯酸脱水酶PHA2基因,最终重组菌株PE-3合成了408.4 mg/L 2-苯乙醇,是出发菌株的10倍以上。该研究建立多基因组装的系统可用于毕赤酵母代谢工程,构建适用于发酵生产蛋白或其他代谢产物的重组菌株。     

转木糖还原酶基因XYL1酿酒酵母的构建及产木糖醇能力研究

将人工合成的树干毕赤酵母（Pichia stipitis）的木糖还原酶基因XYL1插入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达载体pYES2中,然后将重组质粒pYES2-XYL1导入酿酒酵母INVSc1中,构建转木糖还原酶基因XYL1酿酒酵母菌株INVSc1/pYES2-XYL1,最后采用营养缺陷培养基筛选转木糖还原酶基因酿酒酵母并对其产木糖醇的能力进行检测。结果表明,成功获得2株转木糖还原酶基因XYL1酿酒酵母菌株INVSc1/pYES2-XYL1-01、INVSc1/pYES2-XYL1-02,当两菌株以50 g/L木糖及10 g/L半乳糖为碳源发酵5 d后,木糖醇产量分别高达（13.68±2.37）g/L、（12.09±1.45）g/L,显著高于非转基因酿酒酵母INVSc1的木糖醇产量（1.08±0.37）g/L（P＜0.05）,说明XYL1基因的导入显著提高了酿酒酵母INVSc1生产木糖醇的能力（P＜0.05）。为采用基因工程酿酒酵母制备食用木糖醇提供了理论及技术基础。     

黄酒酵母β-苯乙醇合成途径醇脱氢酶I的异源表达及酶学特性

醇脱氢酶 I (Adh1p)是黄酒酵母艾利希途径最后合成β-苯乙醇的一个关键酶。为探究黄酒酵母Adh1p的差异及酶学特性,以工业生产菌株黄酒酵母HJ和模式菌株酿酒酵母S288C的基因组为模板,设计引物PCR扩增醇脱氢酶编码区基因ADH1,构建pET-28a(+)表达质粒,转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,IPTG诱导表达获得Adh1p。通过超声破碎菌体后获取粗酶液,亲和层析纯化后获取纯酶,进而探究酶学特性。以苯乙醛为底物,酶活性测定表明:来自黄酒酵母的Adh1pHJ纯酶的酶活(231.51 U/g) 比来自酿酒酵母的Adh1pS288C (203.48 U/g)高13.79%,且Adh1pHJ的Km值(0.524 μmol/L)小于Adh1pS288C的Km值(0.759 μmol/L),表现为Adh1pHJ与底物的亲和力更大。从kcat/Km值发现Adh1pHJ(0.406 L/(μmol·min))的催化效率更高。Adh1pHJ耐受β-苯乙醇和乙醇的能力较高于Adh1pS288C。本研究结果为Adh1p的结构以及酶学性质分析提供方法和理论依据,同时也对β-苯乙醇工业生产开发提供借鉴。     

生物合成γ-氨基丁酸酿酒酵母谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达

为了提高酵母菌的γ-氨基丁酸产量,本研究以十六烷基三甲基溴化铵法(hexadecyl trimethy ammonium bromide,CTAB)提取的酿酒酵母28基因组DNA为模板,扩增得到序列长度为1 758 bp的GAD1基因,经比对与S.cerevisiae S288c的一致性达到98.58%,并设计引物扩增包括GAD1基因上游启动子及调控序列,下游终止子在内的全长基因序列,长度为3 490 bp。将全长基因序列克隆至高拷贝质粒p UG6,构建重组质粒p28。以菌株28作为出发菌株进行转化,经G418抗性筛选得到转化子,进一步经过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)实验验证,质粒提取及酶切验证,确证得到重组子DL28。经重组质粒p28的特性研究得知,重组质粒p28具有良好的遗传稳定性,无抗性传代培养10次重组质粒不丢失。转化后进行酶活力测定,重组子DL28的谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)酶活力比菌株28提高73.8%。通过以上实验结果得出结论,GAD基因高表达菌株DL28具有更高的G418抗性和GAD酶活性。     

生物转化合成β-苯乙醇代谢途径及其调控的研究

β-苯乙醇是种具有玫瑰风味的芳香醇,目前在食品、化妆品、烟草及医药等方面有广泛应用。随着社会经济的发展,生物转化法生产β-苯乙醇备受关注。文中综述了微生物生物转化合成β-苯乙醇的两个代谢途径,分别是苯丙酮酸途径和艾氏途径,其中艾氏途径是利用微生物合成β-苯乙醇的首选途径,L-苯丙氨酸经转氨酶、脱羧酶及脱氢酶的作用,终转化为β-苯乙醇。着重介绍了艾氏途径中编码这3种酶相关基因的调控。     

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的Candida tropicalis过量表达及其对木糖醇合成代谢的影响

研究葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因g6pd过量表达对Candida tropicalis木糖醇生物合成代谢的影响。克隆Candidatropicalis CT16的g6pd基因,并将其与表达载体pYES-pgk重组连接,构建重组载体pYES-pgk-g6pd,LiAc/ssDNA/PEG方法转化导入C. tropicalis CT16,筛选阳性转化子,实现g6pd基因的过量表达。结果表明：发酵62 h,阳性转化子C. tropicalis SYG5的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力提高了300%,发酵液中木糖醇质量浓度达到79.90 g/L,较野生型对照菌株的木糖醇产量提高了12.41%,木糖醇产率提高了44.94%。因此,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在C. tropicalis木糖醇的合成代谢途径中发挥重要作用,增强g6pd基因的表达,可以明显提高菌体NADPH供应量和还原力,有利于木糖醇的生物合成。     

高产β-苯乙醇黄酒酵母的选育

黄酒中重要的风味物质β-苯乙醇主要由黄酒酵母(酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae)代谢产生,提高黄酒酵母β-苯乙醇产量可显著提升黄酒风味。本研究以绍兴地区酿酒酵母为紫外诱变出发菌株,对紫外诱变菌株进行底物类似物抗性筛选、酒精耐受性筛选、黄酒模拟液筛选,得到可提高β-苯乙醇产量的正突变菌株,再经产孢纯化与筛选得正突变菌株BYC-3。在发酵体系不外源添加前体化合物情况下,正突变菌株BYC-3菌株β-苯乙醇产量达238.12 mg/L,是出发菌株的2.67倍,其产酒精能力与出发菌株没有显著性差异,可为高品质黄酒开发提供参考。     

生物合成天然2-苯乙醇细菌的筛选及合成途径分析

从上海国家森林公园土壤样本中筛选到1?株菌株,经过生理生化鉴定和16S rDNA序列分析,该菌属肠杆菌属并命名为Enterobacter sp. MF024。Enterobacter sp. MF024全基因组测序结果表明该菌株包含从头合成途径和艾氏途径合成2-苯乙醇所有关键酶的编码基因。分别以葡萄糖、L-苯丙氨酸为底物进行生物转化实验,并以苯乙醛、苯丙酮酸等合成途径中间产物为底物进行验证,气相色谱-质谱法、红外光谱分析结果进一步说明Enterobacter sp. MF024具备两种2-苯乙醇合成途径,且该菌利用从头合成途径和艾氏途径产2-苯乙醇产量分别达到0.56、1.15 g/L。该菌株以葡萄糖为碳源生物合成2-苯乙醇极具应用前景。     

代谢工程改造大肠杆菌合成酪醇

酪醇是一种天然存在于橄榄油、酒及绿茶中的酚类化合物。由于酪醇具有抗炎症和抗氧化的生理活性,因此广泛应用于医药、化工等工业领域。传统的酪醇生产方法是化学合成法,但是这些方法存在着工艺复杂、得率低和环境污染等问题。另外,植物中较低的酪醇含量也限制了酪醇的分离纯化工艺研究。因此微生物发酵法生产酪醇研究越来越受到重视。通过在大肠杆菌内异源表达酿酒酵母中的丙酮酸脱羧酶基因ARO10,成功构建了合成酪醇的重组大肠杆菌。通过敲除预苯酸脱水酶编码基因pheA和苯乙醛脱氢酶编码基因feaB,提高了酪醇的合成能力。在最适的培养条件下,过表达ARO10基因的重组菌利用10 g/L葡萄糖作为碳源,发酵48 h酪醇产量可达4.15 mmol/L。研究发现,发酵培养基中外源添加酪氨酸能够提高重组大肠杆菌的酪醇合成能力。同时,研究还发现在大肠杆菌细胞中存在能够催化酪氨酸合成酪醇的前体物质4-羟基苯丙酮酸的酶。为工业水平微生物发酵法合成酪醇提供了思路。     

PHA聚合酶基因phaC的克隆及其在酿酒酵母中的表达

对聚羟基脂肪酸酯(PHA)聚合酶基因phaC进行克隆,并将其与穿梭质粒pYES2连接.构建了酿酒酵母表达质粒pYES2-phaC.测序验证后用LiAc/SSDNA/PEG方法将质粒转化至Saccharomyces cerevisiae INVSCI中,经SC-URA培养基筛选得到阳性转化子.由2%半乳糖培养基诱导表达后,提取细胞粗蛋白测定PHA聚合酶酶活力,结果表明,表达phaC基因的重组菌酶活力为2.45 U/mg,证明phaC基因在在cerevisiae INVSCI中得到表达.     

代谢工程改造酿酒酵母生产2,3-丁二醇的研究进展

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为“细胞动力车间”能够生产生物燃料和工业产品,2,3-丁二醇（2,3-BD）是其重要的一 种次级代谢产物,广泛应用于工业化生产。 但野生型S. cerevisiae合成2,3-BD的效率低,制约着工业化生产进程,因此,应用代谢工程 法优化代谢途径来解决这一问题极其重要。 该研究对近年来利用代谢工程手段来提高S. cerevisiae 2,3-BD产量的策略进行了总结, 主要包括：过表达2,3-BD合成途径中的关键酶编码基因;敲除编码乙醇、甘油、乙酸等分支途径的关键酶基因;利用可再生能源合成 2,3-BD;应用辅因子工程手段对S. cerevisiae合成2,3-BD的代谢网络进行重新设计及合理改造等。 对S. cerevisiae未来的研究方向进行 了展望,为实现生物燃料2,3-BD的工业化生产提供了保障。