酿酒酵母胞外蛋白在衰老过程中的变化

阐述酵母细胞衰老时胞外蛋白变化。在无菌生理盐水中对酵母细胞衰老培养,测定细胞内SOD酶、POD酶、蛋白酶酶活性变化,判断细胞衰老情况并同时提取酵母分泌蛋白,与正常培养细胞的分泌蛋白的双向电泳作对比,并结合质谱分析。结果表明,在衰老情况下胞内抗氧化酶活性降低,细胞内蛋白酶活性升高,酵母胞外蛋白分泌量增加。质谱分析结果表明,胞外蛋白中有部分内源蛋白碎片排出,内源蛋白碎片可能与细胞内蛋白酶活性升高相关,胞内"垃圾"蛋白被水解成碎片排出到胞外。     

几株米曲霉成曲胞外蛋白鉴定及发酵结果分析

采用SDS-PAGE电泳和MALDI-TOF-MS技术,鉴定4株米曲霉成曲胞外蛋白表达量最高的4种蛋白,其中2种确定为淀粉酶和碱性蛋白酶,这2种酶在4株米曲霉成曲胞外蛋白中的表达量和都超过胞外蛋白总量的50%,但不同菌株间淀粉酶与碱性蛋白酶表达量比例不同。同时分析蛋白电泳凝胶酶蛋白表达量、酶活与发酵结果的关系,结果表明酶蛋白表达量与酶活力具有较好的一致性。蛋白酶活力低的菌株发酵氨基酸态氮水平并不低,淀粉酶高的菌株发酵生成还原糖较低。     

豆酱生产菌株米曲霉ZJGS-LZ-12的分泌蛋白组学研究

该研究以米曲霉（Aspergillus oryzae）ZJGS-LZ-12为研究对象,米曲霉3.042为对照,通过双向电泳结合生物质谱检测,对其胞外分泌蛋白差异进行比较分析。结果表明,与米曲霉3.042相比,米曲霉ZJGS-LZ-12胞外蛋白的分泌能力相当,但胞外分泌蛋白组存在显著差异（P＜0.05）。差异表达蛋白点共169个,其中80个蛋白点分泌表达量下调,89个蛋白点分泌表达量上调。差异蛋白质主要参与糖类和蛋白质水解过程,主要是水解淀粉、纤维素、半纤维素及蛋白质的酶。其中,淀粉水解酶、半纤维素酶活性显著增强,β-1,4-内切木聚糖酶F3、β-半乳糖苷酶A和阿拉伯半乳聚糖-β-内切半乳聚糖酶A分泌表达量分别上调292、1 156和2 569倍,蛋白酶Pep1和Alp1分泌表达量分别上调100和1 300倍,充分表明运用此菌株发酵有利于改善豆酱的风味和品质。     

牡蛎致敏蛋白初步分离和酶解处理对其抗原性的影响

分离获得太平洋牡蛎致敏蛋白,考察酶解法对牡蛎致敏蛋白抗原性的影响。方法 利用硫酸铵沉淀和葡聚糖凝胶G-75分离牡蛎致敏蛋白,聚丙烯酰胺电泳分析获得蛋白的分子量大小,使用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和动物蛋白水解酶(3 000 U/g)酶解牡蛎致敏蛋白,OPA法测定水解度,间接竞争ELISA法测定酶解产物的抗原性。结果 分离到分子量约为40和98 kD的牡蛎致敏蛋白,经木瓜蛋白酶酶解的致敏蛋白特征条带消失,酶解产物水解度为(31.87±0.309)%,动物蛋白酶和中性蛋白酶对牡蛎致敏蛋白水解度分别为(24.13±0.153)%和(12.43±0.115)%,但致敏蛋白特征条带未完全消失;间接竞争ELISA检测表明3种蛋白酶均能不同程度地降低牡蛎致敏蛋白的抗原性或使致敏性基本消除。结论 蛋白酶酶解法可有效水解牡蛎致敏蛋白,从而降低其抗原性,其中木瓜蛋白酶效果明显。     

毛霉蛋白酶的组分特性及对大豆蛋白水解的研究

毛霉是腐乳酿造的主要微生物之一,其分泌的蛋白酶对大豆蛋白具有较高的水解效率以及对蛋白水解物良好的脱苦效果,因此在大豆蛋白水解加工方面显示出很好的应用前景.本研究采用多种蛋白纯化的方法从毛霉胞外分离纯化出三种不同的蛋白酶组分.在探讨了各组分蛋白酶性质的基础上,考察了各种蛋白酶组分对大豆蛋白的水解效果.结果显示,纯化得到的碱性蛋白酶组分Pb1对大豆蛋白具有相对较强的水解能力,而酸性蛋白酶对大豆蛋白水解能力较差,碱性蛋白酶与酸性蛋白酶之间具有良好的协同作用.     

Bacillus sp.L1胞外蛋白酶EL1基因克隆及酶学性质分析

目的:对菌株Bacillus sp.L1分泌的胞外蛋白酶EL1进行分离纯化、基因克隆及酶学性质研究。方法:利用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析从菌株Bacillus sp.L1的发酵液中分离纯化出胞外酶EL1,对其进行了质谱分析、基因克隆及酶学性质研究。结果:质谱结果提示EL1属于丝氨酸蛋白酶,该酶基因开放阅读框为1326 bp,蛋白序列共441个氨基酸,氨基酸序列与菌株Bacillus stratosphericus分泌的丝氨酸蛋白酶(WP_007499449)同源性最高(98%)。该酶最适温度60℃,具有较好的热稳定性;最适pH8.0,在pH8.0时稳定性较好;Mn2+对其有一定的激活作用,Cu2+对其有一定的抑制作用。结论:Bacillus sp.L1分泌的胞外蛋白酶EL1具有较好的热稳定性,在碱溶液中可以保持较高的活力,具有潜在的工业应用价值。     

酱油酿造米曲霉AS 3.951(沪酿3.042)种曲胞外蛋白谱鉴定与分析

分析米曲霉AS 3.951 (沪酿3.042)种曲培养过程中不同培养时间的胞外蛋白谱,确定培养时间为48h 时种曲达到蛋白鉴定要求;采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)技术检测鉴定出SDS-PAGE胶图上11 个蛋白条带,通过比对数据库鉴定得到8 个蛋白,其中包括α - 淀粉酶、淀粉糖化酶B、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶等,与已在2009 年Biosci Biotechnol Biochem 期刊发表的《Analysis of extracellular proteins of Aspergillusoryzae grown on soy sauce koji》米曲霉AS 3.951 大曲的分泌蛋白谱共同提供了米曲霉沪酿AS 3.951 在酱油制曲过程中较完整的胞外分泌蛋白谱。     

葵花籽粗油体中内源性蛋白酶系的性质探究以及鉴定

通过电泳探究葵花籽粗油体中内源性蛋白酶系的水解性质,以及用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定内源性蛋白酶的种类。结果表明,油质蛋白在pH 4~8水解速度相对较快,22 kDa球蛋白在pH 3~5水解速度相对较快,35 kDa球蛋白在pH 4~8水解速度相对较快。葵花籽粗油体中内源性蛋白酶系在pH 4、50 ℃水解速度相对最快。通过抑制剂实验发现,在pH 4下,葵花籽粗油体中有金属蛋白酶类、天冬氨酸蛋白酶类、丝氨酸蛋白酶类的酶活表征,几乎无半胱氨酸蛋白酶酶活的存在。通过LC-MS/MS分析发现,葵花籽粗油体中存在金属蛋白酶类、天冬氨酸蛋白酶类和丝氨酸蛋白酶类和天冬氨酸蛋白酶类抑制剂、丝氨酸蛋白酶类抑制剂以及半胱氨酸蛋白酶类抑制剂。研究结果为利用内源性蛋白酶类进行水相加工提供了理论基础。     

猪肉水溶性蛋白提取液培养过程中热杀索丝菌胞外蛋白酶分泌情况研究

热杀索丝菌对猪肉的致腐作用主要来自于其分泌的酶对猪肉蛋白质及碳水化合物的分解。前期研究发现,在STAA液体培养基中,热杀索丝菌分泌蛋白酶少,其胞外蛋白酶酶活难以准确检测出。在国标福林酚法的基础上,以10、20、30、40、50、60 min作为反应时间,测定热杀索丝菌于猪肉蛋白提取液中培养过程中所分泌的胞外蛋白酶酶活。结果表明:在热杀索丝菌初始数量远大于其他菌数目总和的条件下,热杀索丝菌增殖不如其他菌迅速,24 h时,其他菌数目已大于热杀索丝菌数目。此外,培养过程中,36 h以后,所测胞外蛋白酶酶活增大十分显著(P0.01)。未严格除菌的条件下,猪肉水溶性蛋白提取液中的胞外蛋白酶主要由热杀索丝菌以外的微生物分泌。     

嗜盐古菌Halorussus sp.XZYJ18产胞外蛋白酶特点及其酶学性质

通过脱脂牛奶平板从分离自我国西藏芒康盐井古盐田的133株嗜盐古菌中筛选获得11株产胞外蛋白酶菌株,其中XZYJ18产蛋白酶能力最强。16SrRNA基因序列分析表明XZYJ18为Halorussus属的新种。XZYJ18在对数生长后期开始大量合成胞外蛋白酶,营养丰富的培养基抑制胞外蛋白酶合成。XZYJ18胞外蛋白酶在55℃,pH 8.0和0mol/L NaCl的条件下酶活最高,在酸性、碱性、低盐或高盐条件下均具有良好的稳定性,因而能够在不同的环境中催化蛋白质水解。     

响应面法优化玉米黄粉蛋白的酶解工艺

利用pH-stat法测定碱性蛋白酶和中性蛋白酶对玉米黄粉蛋白的水解度,通过Box-Benhnken响应曲面法优化水解条件。根据单因素试验结果设计中心组合试验,以水解度为指标,采用响应面分析法确定最优水解工艺参数。结果表明：蛋白酶水解的最适条件为酶解pH11.10、酶解温度55.00℃、底物质量浓度112g/L、碱性蛋白酶与中性蛋白酶酶活单位比值5:1、加酶量48000U/g、酶解时间120min;在此条件下,玉米黄粉蛋白水解度实测值为30.23%,模型的预期值为30.84%。采用复合酶水解可提高玉米黄粉蛋白水解度,且工艺简单。     

不同酶处理对鸡蛋清中卵白蛋白致敏性的影响

选取了木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和动物蛋白水解酶,并利用单因素实验,以水解度为指标,确定各种蛋白酶对蛋清蛋白最佳的酶解工艺参数。在此基础上,对蛋清蛋白进行水解,通过SDS-PAGE和间接竞争ELISA检测各蛋白酶蛋清水解液,比较各蛋白酶对蛋清中卵白蛋白抗原性降低效果。SDS-PAGE结果显示木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和动物水解蛋白酶对卵白蛋白的降解效果较明显,胰蛋白酶和风味蛋白酶的降解效果不明显;间接竞争ELISA检测结果表明,木瓜蛋白酶和中性蛋白酶对卵白蛋白抗原性的降低作用更有效,分别达到了57.8%和49.6%,其他几种酶都在30%左右。因此可以选用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶对研究开发脱敏鸡蛋食品做进一步研究。     

嗜盐古生菌Halogranum rubrum RO2-11胞外蛋白酶酶学特性研究

对嗜盐古菌Halogranum rubrum RO2-11所产胞外蛋白酶的特性进行初步研究,脱脂奶粉平板法验证其是否可以产生胞外蛋白酶,福林酚法测定胞外蛋白酶酶活。试验结果表明,嗜盐古菌Halogranum rubrum RO2-11可以产生胞外蛋白酶,此蛋白酶对高浓度的Na Cl有一定的耐受性;酶促反应的最佳温度为50℃,在温度超过60℃后,对温度的耐受性下降;最佳p H为8.0,在p H 8.0~11.0之间有较高的活性并保持相对稳定,表明该酶是一种碱性蛋白酶;金属离子Ca2+对该蛋白酶有激活作用,Mn2+、Cu2+对该蛋白酶有抑制作用;金属螯合剂EDTA对蛋白酶有强烈的抑制作用,有机溶剂异丙醇、巯基反应物DTNB和丝氨酸抑制剂PMSF对酶活力的影响很小,表明该蛋白酶是一类不含巯基的金属蛋白酶,并且能够耐受一定浓度的有机溶剂。     

多酶协同水解核桃蛋白的研究

以核桃蛋白为原料,采用酶法制备核桃多肽,对单一酶解、多酶酶解、加酶顺序进行了研究。试验结果表明:蛋白酶种类对核桃蛋白水解作用影响较大,单酶水解度大小依次为碱性蛋白酶中性蛋白酶酸性蛋白酶菠萝蛋白酶木瓜蛋白酶;分步依次加酶方式优于同时加酶方式;选择碱性、中性、酸性3种蛋白酶对核桃蛋白进行分步依次加酶水解,水解度达到45.58%。     

黑曲霉Aspergillus niger H菌株所产酸性蛋白酶的质谱法鉴定及酶学特性

采用质谱指纹(MS mapping)分析方法,直接对黑曲霉Aspergillus niger H菌株发酵液中所产蛋白进行鉴定,通过与质谱数据库比对分析,确定此蛋白为曲霉酸性蛋白酶Aspergillopepsin I(EC.3.4.23.18).对其酶学性质的研究表明,此蛋白酶分子量约为47kDa,最适温度为50℃,温度稳定性范围为30～50℃,最适pH为3.0,pH稳定性为2～5,其表征与其它已报道的曲霉酸性蛋白酶基本一致,证实此质谱指纹分析方法可快速有效地鉴定混合发酵液中的未知蛋白,并省去中间繁琐的分离纯化步骤.     

泡菜中高产蛋白酶乳酸菌的筛选鉴定及其酶学特性初步研究

从传统泡菜中分离得到16株乳杆菌株,通过脱脂乳平板试验,从中初步筛选出12株产蛋白酶的菌株,通过复筛得到1株高产蛋白酶菌株L4。采用PCR技术对该菌株进行鉴定,通过硫酸铵盐析、透析袋透析收集胞外产物,以交联葡聚糖凝胶G-75层析纯化蛋白酶,以SDS-PAGE电泳确定蛋白酶分子量,同时对不同条件下蛋白酶的酶学特性进行研究。结果表明,该菌株的碱基序列与多株植物乳杆菌相应的16S r DNA序列99%相似,鉴定其为植物乳杆菌;蛋白酶分子量为40 k Da,在p H为9时胞外蛋白酶活性最高,其最适温度为50~60℃。酶活抑制试验显示Ca2+、Ba2+、Zn2+、EDTA能大大抑制该蛋白酶活性,而Mg2+、Mn2+、Cu2+、PMSF对胞外蛋白酶活力影响不大。     

淀粉液化芽孢杆菌BS5582中性蛋白酶基因的克隆表达及其酶学性质研究

以一株高产中性蛋白酶的Bacillus amyloliquefaciens BS5582基因组DNA为模板,PCR扩增获得结构基因npr,构建质粒pPIC9K-npr,并转化到表达菌株毕赤酵母GS115中得到重组菌。经甲醇诱导发酵,测定中性蛋白酶活性。结果表明,目的基因大小为1566bp,在宿主中得到了成功表达,重组菌酶活力为9.17×103U/g,酶学性质分析表明,重组中性蛋白酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为7,在40℃中保温1h后仍能保持85%左右活性,在pH4～9的范围内稳定性较好,Ca2+、Mg2+、Mn2+离子对该酶有激活作用。     

土壤宏基因组中芽孢杆菌信号肽的克隆及分析

从土壤宏基因组中筛选获得在芽孢杆菌中高效分泌重组蛋白的信号肽。通过数据分析,将预测到的信号肽DNA片段与蛋白酶基因融合,在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WB800和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）DL6中表达,进行胞外蛋白酶酶活测定。筛选得到25个可能来源于G+菌的信号肽序列,胞外蛋白酶活性分析的结果显示,有14个信号肽具有较好的分泌蛋白酶的能力,其中引导效果最好的信号肽（sig20）是蛋白酶自身信号肽的1.64倍。将高分泌信号肽转化到地衣芽孢杆菌中,证实其在地衣芽孢杆菌同样具有较好的引导效果。应用生物信息学与宏基因组学相结合的方法,可有效获得高效的芽孢杆菌信号肽序列,为蛋白质高效分泌表达系统的构建提供丰富的表达元件。     

纳豆芽孢杆菌蛋白酶的制备及性质研究

纳豆芽孢杆菌是纳豆发酵生产的主要菌种,对其胞外蛋白酶催化特性的研究有助于了解纳豆的发酵生产过程,并有利于从中发掘有开发应用潜力的蛋白酶。实验从不同纳豆产品中分离筛选得到1株高产蛋白酶的纳豆芽孢杆菌,对其胞外蛋白酶的催化特性及活性影响因子进行了分析。结果显示,纳豆芽孢杆菌蛋白酶是一典型的金属蛋白酶,EDTA几乎可完全抑制其活性,Ca2+是其活性中心的辅基;该蛋白酶在60℃、pH 7.0有最大催化活性,在pH 6～9和低于45℃条件下具有很好的稳定性;50℃时,该蛋白酶会缓慢失活,其热失活规律符合一级指数衰减模型:a=0.124+0.887e(-0.45t);该蛋白酶对大豆蛋白有很强的水解能力,其水解效率与Alcalase蛋白酶相当,可以实现底物蛋白的深度水解,具有一定的开发应用价值。     

花生蛋白水解产物ACE抑制活性的研究

采用胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶水解花生蛋白,研究了水解过程中水解度的变化,并对水解产物的ACE抑制活性进行了探讨。得出三种酶对花生蛋白的水解作用:碱性蛋白酶>胰蛋白酶>中性蛋白酶。碱性蛋白酶水解产物ACE抑制活性明显高于胰蛋白酶和中性蛋白酶,水解产物的ACE抑制活性高达89.73%,中性蛋白酶水解产物ACE抑制率仅为27.24%。