实时荧光PCR法检测奶制品中常见谷物成分

建立Taqman实时荧光PCR法对奶制品中掺加物大米、玉米、小麦、高粱、大麦等谷物源性成分的初筛检测体系。方法 以常见掺加物大米、玉米、小麦、高粱、大麦等谷物的叶绿体rbcL基因作为靶基因,通过BLAST软件比对,选择其同源保守区域设计引物和探针。经通用性、特异性、灵敏性试验对探针和引物可行性进行验证,并通过模拟含谷物奶粉及市售奶类制品检测对其实际检测能力进行验证。结果 所建立体系可扩增大米、玉米、小麦、高粱、大麦等常见的谷物掺加物的DNA提取物,与市售奶制品的主成分牛奶、羊奶以及其常见添加物香蕉、红枣、菠萝、草莓、西红柿、花生、大豆等动植物源性成分无交叉扩增(Ct＞35)。对小麦纯DNA提取物检出限为0.01ng。对分别掺加5种谷物成分的模拟奶制品检出限均可达0.5%,对市售的14份奶类食品中的谷类成分的检测结果均与食品标签相符。结论 本研究建立的Taqman实时荧光PCR体系具有通用、相对特异、灵敏、实用等优点,可用于奶制品中掺加或掺杂掺假谷物源性成分的快速定性检测。     

实时荧光PCR技术快速检测食品中的牛源成分

目的:建立基于实时荧光PCR技术的食品中牛源性成分快速检测方法.方法:以牛线粒体细胞色素b为目的基因,设计特异性引物和探针,通过特异性、灵敏性实验,及模拟混合肉样和市售肉制品检测,对该体系进行验证.结果:该牛源荧光PCR检测体系具有很好的特异性及灵敏性,可检测1pg牛源DNA的存在,对于各模拟肉类样品中掺杂的牛源性成分,其检测限低至0.5％,且经市售加工食品验证具有较好的应用能力.结论:所建立的牛引物探针体系具有特异性好、灵敏度高,快速高效等优点,可用于对食品中牛源性成分的掺假鉴别检测.     

一种基于实时荧光聚合酶链式反应的肉及肉制品中猪源性成分含量测定

为了建立一种基于实时荧光聚合酶链式反应的肉及肉制品猪源性成分含量测定方法,分别以猪线粒体DNA的NADH4基因和16S rRNA基因为靶位点设计猪特异性引物、探针和通用引物、探针,建立猪源性成分含量测定方法,通过特异性、灵敏性、线性、准确度及市售肉制品检测,对该方法体系进行检验和评价.结果表明:建立的猪源性成分含量实时荧光聚合酶链式反应测定方法体系具有良好的特异性及灵敏性,最低可检测到0.4pg/μL纯猪肉DNA;无论是猪特异性体系还是通用体系都呈现良好的线性关系(R2均达到0.999以上)和较宽的线性范围;通过含猪源性成分的模拟混合肉样检测,样品猪源性成分含量的回收率平均值为122.27％,说明该方法具有较高的准确度;通过市售肉制品检测表明该方法可以用来检测实际样品(包括生鲜样品和熟肉样品)中猪源性成分含量.     

实时荧光PCR在虹鳟源性成分鉴别中的应用

为鉴别食品中虹鳟源性成分,以线粒体ATP6 基因为靶点,设计虹鳟特异性聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）的引物、探针,利用实时荧光聚合酶链式反应（real-time fluorescent PCR,RT-PCR）技术,建立针对虹鳟源性成分的实时荧光PCR 快速检测方法;选取17 种市场上常见鱼类进行试验,结果均无扩增反应,同时通过DNA灵敏度试验,表明该研究建立的鉴别方法DNA 浓度灵敏度能达到0.1 ng/μL,且特异性良好。同时,利用该方法对市售的22 种商品三文鱼及其制品进行检测,结果显示10 种商品中含有虹鳟（Oncorhynchus mykiss）成分。该研究所建立的检测方法可用于对市售产品中虹鳟源性成分的鉴别,同时也表明虹鳟是市售三文鱼的主要鱼种之一。     

环介导等温扩增与qPCR用于检测肉制品中狗源性成分的比较

目的 建立基于实时荧光PCR和环介导等温扩增检测肉制品中狗源性成分的检测方法并比较2种方法的检测效能。方法 针对狗线粒体CYTB基因保守序列, 采用Primer Explorer Version 4软件设计环介导等温扩增引物, Primer Express 3.0.1软件设计实时荧光PCR引物及探针。提取狗肉基因组DNA作为阳性模板, 黄牛肉等20种基因组DNA作为阴性对照, 分析扩增特异性; 用含靶序列的人工质粒确定检测灵敏度及人工掺肉样确定最低检出限; 用市售肉制品分析检出率。结果 对于肉制品中狗源性成分检测, 实时荧光PCR和环介导等温扩增检测均有较好的特异性, 人工质粒分析灵敏度分别为0.1、1 fg/μL。对10种市售狗肉制品的狗源性成分均检出阳性、10份不含狗肉制品均检出阴性, qPCR法和环介导等温扩增法的检测结果符合率均为100%。结论 qPCR法和环介导等温扩增法在检测肉及肉制品中的狗源性成分时, 在灵敏度、检出限和准确度上具有相当的效能。     

肉制品中鸵鸟源性成分的实时荧光PCR检测

通过实时荧光PCR技术检测肉制品中鸵鸟源性成分。根据鸵鸟线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(COX1)序列,用Primer Express和DNAMAN软件设计特异性的引物和Taq Man探针,并用阳性样本进行验证。结果表明,引物和探针对鸵鸟源性成分的特异性良好,与常见物种DNA无非目标扩增,该方法的检测灵敏度达0.27 pg/反应,适用于鸵鸟源性成分的鉴定,从而建立了肉制品中鸵鸟源性成分的实时荧光PCR鉴定方法 。     

实时荧光PCR在鉴别鸡精中鸡源性成分的应用研究

文章利用实时荧光PCR方法,以鸡的cytb基因为目的基因,设计了一套特异性的引物和探针,对鸡精中的鸡源性成分进行定性、定量分析研究.结果表明,该套引物和探针能特异性的检测鸡精中鸡源性成分;荧光PCR检测的灵敏度为0.002％ (W/W),检测时间为3h.此方法具有准确、快速、高效的特点,为食品中鸡源性成分的检测提供了新方法.     

实时荧光聚合酶链式反应法检测食品中猪源性成分

针对猪线粒体细胞色素b基因序列设计特异的引物和探针,建立食品中猪源性成分实时荧光聚合酶链式反应检测方法,并经特异性和敏感性试验验证其可行性。结果表明：该体系可扩增猪肉DNA片段,长度为98bp,其他常见畜、禽肉成分均无法正常扩增。该体系灵敏度低至1pg,且阴性样品扩增后的Ct值限制在35循环以后。对于各模拟肉类样品中掺杂的猪源性成分,其检测限均达1%,经市售加工食品检测验证,表明所建立的猪引物探针体系具有特异性好、灵敏度高、快速、高效等优点,可用于对食品中猪源性成分的掺假鉴别检测。     

食品中马源性成分的实时荧光PCR检测

针对马线粒体DNA细胞色素b基因设计特异性引物和探针,建立食品中马源性成分实时荧光PCR检测方法,并经特异性和灵敏度试验验证其可行性。结果表明:该体系可扩增马DNA片段,长度为127 bp,其他常见畜、禽肉成分均无法正常扩增。该体系的检测灵敏度为1.25 pg马DNA和质量分数0.001%马肉粉。经市售食品的检测验证,表明所建立的马引物探针体系具有特异性好、灵敏度高、快速、高效等优点,可用于对食品中马源性成分的掺假鉴别检测。     

食品中马源性成分定性检测能力验证结果与分析

摘要：目的提高实验室对食品中马源性成分定性鉴定的准确性和评估检测人员的专业技术水平,增强实验室竞争力。方法 通过核酸蛋白仪器分析法和单重实时荧光PCR法对样品真核生物18S rRNA基因扩增的循环阈值来分析DNA的提取质量。在利用标准SN/T 3730.5-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第5部分：马成分检测实时荧光PCR法》检测过程中,对该标准扩增体系的引物探针浓度进行优化和检出限分析后,用优化的扩增体系对样品进行检测。再依据标准SB/T 10923-2012《肉与肉制品中动物源性成分的测定实时荧光PCR法》的要求,对样品进行检测。最后对2个标准的检测结果进行比对。结果 提取的DNA质量符合标准要求。标准SN/T 3730.5-2013的引物探针浓度优化后,能有效扩增阳性样品,检出限为0.1%,能有效检测马源性成分。2个标准检测20-M805和20-Q719待测样品,均未检出马源性成分。结论 本次能力验证获得满意评价。DNA提取质量的评估,反应体系中引物探针浓度的优化与选择,不同检测方法结果的相互验证和实验的质量控制都是影响能力验证结果的重要因素     

实时荧光PCR法鉴别玛咖及其掺假物芜菁

为建立玛咖原料及其制品中玛咖及其掺假物芜菁物种鉴别方法,根据defensin基因序列,分别设计了玛咖、芜菁的特异引物探针,建立了两种植物源性成分的实时荧光PCR检测方法。以玛咖、芜菁等33份样品DNA为模板,经实时荧光PCR扩增,结果表明:已建立方法分别能特异扩增玛咖、芜菁成分;灵敏度测试结果表明:本方法检测玛咖、芜菁成分的绝对灵敏度均达0.01 ng/μL,相对灵敏度均达0.1%(w/w),且能准确鉴别市售玛咖制品中的玛咖与芜菁成分。由此说明所建立方法可作为检测玛咖原料及其制品中玛咖与掺假物芜菁成分的特异性鉴别方法。     

实时荧光聚合酶链式反应检测肉制品中的鸭源性成分

通过鸭的肌动蛋白β-actin保守基因设计可特异检测鸭肉成分的引物和探针,建立实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术检测鸭肉的方法,并通过模拟肉样和市售样品检测方法的准确性和适用性。结果表明：该方法可以特异性检测出麻鸭和草鸭成分,而对猪、牛、羊、鸡等DNA均没有扩增,检测灵敏度可达到1 pg DNA;通过模拟肉样检测确定最低质量分数检测限为0.01%;市售样品的检测结果表明,该方法能很好地应用于市场,满足市场检测需求。     

食品中鸡源性成分实时荧光PCR检测方法的建立

目的：建立基于实时荧光聚合酶链式反应技术的食品中鸡源性成分快速检测方法。方法：以鸡线粒体细胞 色素b为目的基因,设计特异性引物和探针,通过特异性、灵敏性实验及模拟混合肉样和市售肉制品检测,对该体 系进行验证。结果：该鸡源荧光聚合酶链式反应检测体系具有很好的特异性及灵敏性,可检测3.5 pg/μL鸡源DNA 的存在;经含鸡源成分的模拟混合肉样检测,证实体系抗干扰能力强;并且通过市售食品检测表明体系可用于定性 加工食品中的鸡源成分。结论：所建立的鸡源引物探针体系具有特异性好、灵敏度高、快速高效等优点,可用于对 食品中鸡源性成分的掺假鉴别。     

Taqman探针荧光聚合酶链式反应实时同步鉴定动物源性食品中猪肉、鸡肉源性成分

目的:建立一种能实时同步检测动物源性食品中猪肉源性和鸡肉源性成分的Taqman探针双重荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,应用于动物源性食品的成分掺假快速检验。方法:分别依据猪和鸡的种间保守基因(Cytb)序列设计、合成特异性引物及不同荧光标记(FAM、HEX)的Taqman探针,建立可同步检测动物源性食品中的猪源性和鸡源性成分的Taqman探针双重荧光PCR方法。结果:所建立的Taqman探针双重荧光PCR检测方法特异性强,仅对猪、鸡成分有扩增;灵敏度高,最低检测到猪源、鸡源DNA的含量分别为0.02、0.10 ng;抗干扰性强,当DNA混样中猪源、鸡源性成分含量在2%以上水平时,所建立的混合检测体系均能对DNA混样给出正确判断。结论:所建立的混合检测体系具有高特异性、高灵敏度,能够适用于动物源性食品中猪肉、鸡肉成分的同时快速检测。     

多重实时荧光PCR鉴别金钱白花蛇源性方法研究

目的用多重实时荧光聚合酶链式反应(多重实时荧光PCR)快速鉴别金钱白花蛇源性。方法以线粒体细胞色素C基因为目标靶基因,根据其特异性核酸序列设计引物和探针,通过优化引物及探针浓度、退火温度等PCR体系和条件,建立从活体材料和粉末制剂等中药材中检测金钱白花蛇源性的二重二色实时荧光PCR检测体系。结果通过检测市售15块金钱白花蛇药材,发现其中5块不含金钱白花蛇源性成分;10份金钱白花蛇粉末制剂中3份未检出金钱白花蛇成分;5份活体样本均为金钱白花蛇。检测结果与DNA测序结果一致。结论本研究建立的方法可用于金钱白花蛇源性的检测,能有效保障金钱白花蛇相关名贵中药及制品的安全性。     

肉制品中鸭源性成分TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立与应用

目的 建立TaqMan探针实时荧光PCR法快速检测肉制品中鸭源性成分的分析方法。方法 以鸭生长激素(growth hormone, GH)基因为靶基因, 基于特异性保守序列设计引物和TaqMan探针, 优化反应体系和反应条件, 建立了鸭源性成分实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法。结果 所建立的real-time PCR方法特异性强, 仅对鸭基因组DNA出现特异性扩增曲线, 对牛、羊、猪等其他异源性动物基因组DNA均无扩增曲线; 灵敏性高, 以鸭基因组DNA为模板, 检出限为1.0 pg; 重复性好, 不同浓度基因组DNA测定的Ct值变异系数小于4%。使用建立的real-time PCR方法对200份市售肉制品进行检测, 在11份肉制品中检出鸭源性成分, 同现行行业标准SN/T 3731.5—2013检测结果一致。结论 本研究所建立的real-time PCR方法检测具有特异性强、敏感性高、快速高效等特点, 适用于肉制品中鸭源性成分快速检测。     

实时荧光PCR检测饲料中鸭源性成分

根据GenBank中的鸭线粒体DNA基因片段序列,用Primer6.0软件设计针对鸭的特异性扩增引物及探针,建立一种检测鸭源性成分的实时荧光PCR方法.以鸭、鸡、鹅、牛、羊、猪、马、鸽、水貂、鱼、猫肌肉组织DNA进行实时荧光PCR反应,只有鸭具扩增曲线,其余样品和空白对照则无扩增曲线,说明该引物及探针只对鸭有特异性.对不同含量的鸭肉粉进行实时荧光PCR反应,结果表明灵敏度约为0.01％(质量分数).     

实时荧光PCR法快速检测肉类中貉源性成分

目的建立貉源性成分的实时荧光PCR快速检测手段。方法根据貉的线粒体Cytb基因序列设计引物和探针,通过优化扩增反应体系进行实时荧光PCR(RT-PCR)扩增,产物进行快速检测。结果此方法特异性良好,灵敏度可达到10~(-4)ng貉源性DNA的量。在混合或纯肉样品以及常见的肉制品中均可检测。结论本方法可以满足实际工作中肉类掺假检测的要求。     

肉制品中表皮葡萄球菌实时荧光PCR检测方法的研究

根据表皮葡萄球菌16S基因片段序列,用Primer express 3.0设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立表皮葡萄球菌实时荧光PCR检测方法。通过对梯度含量的表皮葡萄球菌标准菌液样品DNA和多种细菌的DNA进行实时荧光PCR检测,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。实验结果表明,只有表皮葡萄球菌产生扩增曲线,其他细菌无扩增,说明引物及TaqMan探针特异性较好,检测灵敏度为1×10~3CFU/mL。该方法具有很好的研究价值和应用前景。     

黑松露成分TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立与应用

以黑松露核糖体内转录间隔区基因为靶基因设计特异性引物和探针,建立黑松露成分的TaqMan实时荧光PCR检测方法,并进行物种特异性验证。同时对不同掺入比例的模拟样品和市售黑松露及制品进行检测。结果表明:该方法特异性强,仅对黑松露基因组DNA出现特异性扩增曲线,与其它食用菌和异源性动植物样品无非目标扩增;检测灵敏度为1×10-3 ng/μL黑松露基因组DNA或质量分数0.01%的黑松露粉。对120份市售黑松露(鲜品、冻品、干品、粉末)、黑松露制品(黑松露酱和黑松露调味粉)以及不含黑松露成分的杂菌包进行检测,在70份黑松露(鲜品、冻品、干品、粉末)和10份黑松露制品中检出黑松露成分,其它样品均未检出黑松露成分,检测结果与商品标识一致。该方法灵敏度高,特异性强,可快速精准地进行黑松露成分的真实性甄别。