新城疫病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)一步法RT-PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法根据NDV F基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立一步法RT-PCR检测方法,并验证其特异性及敏感性;应用建立的方法对23份疑似新城疫(Newcastle disease,ND)病料进行检测,并与血凝及血凝抑制试验检测结果进行比对。结果建立的一步法RT-PCR同时检测NDV、传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)和禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)H9亚型,仅NDV为阳性,IBDV和AIV H9均为阴性;该方法最低可检出约4 pg的NDV RNA;23份疑似ND病料,一步法RT-PCR检出11份阳性,血凝及血凝抑制试验检出13份阳性,两种方法的阳性符合率为85%。结论建立了NDV一步法RT-PCR检测方法,该方法特异性良好,敏感度较高,用时较短,可从分子水平上对NDV进行早期快速诊断和流行病学调查。     

猪瘟和猪蓝耳病病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)和猪蓝耳病病毒(Porcine respiratory and reproductivesyndrome virus,PRRSV)多重RT-PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法根据GenBank中登录的CSFV和PRRSV疫苗株基因组序列,分别设计针对CSFV和PRRSV的两对引物,建立多重RT-PCR检测方法,并进行敏感性及特异性验证。用建立的多重RT-PCR法检测20份疑似猪瘟、猪蓝耳病或混合感染病料,并与市售RT-PCR试剂盒的检测结果进行比较;检测病料的部分PCR产物测序后,与9株具有代表性的CSFV毒株和10株具有代表性的PRRSV毒株进行核苷酸序列同源性比对。结果以CSFV和PRRSV混合引物扩增,分别可扩增出286和664 bp的特异性条带。建立的多重RT-PCR检测方法可检出100倍稀释的病毒RNA;该方法可检出CSFV、PRRSV及CSFV与PRRSV混合病毒,而猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Trans-missible gastro-enteritis virus,TGEV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)的检测结果均为阴性;该方法检测20份疑似猪瘟、猪蓝耳病或混合感染病料的结果与市售RT-PCR试剂盒比较,灵敏度达100%;选取的两份CSFV扩增片段与9株具有代表性的CSFV毒株的核苷酸序列同源性在92.3%⁹8.2%之间,扩增的PRRSV与10株具有代表性的PRRSV毒株的核苷酸序列同源性在94.1%98.2%之间,扩增的PRRSV与10株具有代表性的PRRSV毒株的核苷酸序列同源性在94.1%⁹7.9%之间。结论成功建立了CSFV和PRRSV多重RT-PCR检测方法,为猪瘟和猪蓝耳病的早期诊断及流行病学调查奠定了基础。     

乙型脑炎减毒活疫苗中猪圆环病毒PCR检测方法的建立及验证

目的建立乙型脑炎减毒活疫苗中猪圆环病毒1型(porcine circovirus 1,PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法参照Gen Bank中登录的PCV1(AY193712)及PCV2序列(AY181946)设计引物,以提取的PCV1和PCV2基因组DNA为模板,分别经PCR扩增726 bp的PCV1片段和433 bp的PCV2片段,并对PCR反应中的退火温度、引物浓度、Mg2+浓度参数进行优化。将PCR扩增产物分别与p MD18-T载体连接,连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5α,挑取阳性克隆,测序并进行同源性分析。对优化的PCR方法进行灵敏度和特异性验证,并用该方法检测3批乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批、4批明胶和10批胰蛋白酶中的PCV1和PCV2。结果确定PCR反应的退火温度为54℃,引物浓度为10μmol/L,Mg2+浓度为10 mmol∕L。扩增的目的基因测序结果与Gen Bank中发布的PCV1及PCV2序列的同源性均为100%。建立的PCR方法最低可检出10 pg的目的基因;该方法只对PCV1和PCV2基因组DNA能扩增出特异性条带。用该方法检测乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批、明胶和胰蛋白酶,均未检出PCV1和PCV2。结论成功建立了乙型脑炎减毒活疫苗中PCV1和PCV2的PCR检测方法,该方法具有较高的灵敏度和较强的特异性,可用于乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批及两种猪源性原材料的PCV1和PCV2污染检测。     

腮腺炎减毒活疫苗感染性滴度荧光定量RT-PCR检测方法的建立及验证

目的建立腮腺炎减毒活疫苗感染性滴度荧光定量RT-PCR检测方法,并进行验证。方法针对腮腺炎减毒活疫苗株S79血凝素(hemagglutinin,H)基因保守区域设计特异性引物和Taq Man荧光探针;以05008批腮腺炎减毒活疫苗S79株成品作为参考品,将参考品或供试品稀释后,接种于长成单层的Vero细胞中,采用低渗合并冻融法将细胞破碎,吸取上清,进行荧光定量RT-PCR。优化病毒感染时间,并对该方法的特异性、精密性及准确性进行验证。结果病毒感染的最佳时间为18 h;建立的荧光定量RT-PCR法只对腮腺炎减毒活疫苗具有特异性扩增,对灭活的腮腺炎减毒活疫苗、水痘病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、风疹病毒和Vero细胞均无扩增曲线出现;该方法检测4个浓度(1、1:5、1:52、1:53)样品6组数据的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均5%,不同操作人员于不同日期检测4个浓度(1、1:5、1:52、1:53)样品的标准曲线回归方程R2均大于0.97,RSD均5%;该方法与细胞病变法测得的11批腮腺炎减毒活疫苗成品的病毒滴度值之差均≤0.2 Lg CCID50/ml,两组数据差异无统计学意义(P0.05)。结论建立的荧光定量PCR法检测腮腺炎减毒活疫苗感染性滴度特异性较强,精密性和准确性良好,且快速方便,可应用于企业生产过程中的内部质控。     

中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法的建立

目的建立中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法。方法参照已发表的中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)基因序列,针对其结构蛋白基因设计1对特异性引物,提取感染CSBV的囊状幼虫RNA,反转录为cDNA,以其为模板,进行PCR扩增,对检测方法进行优化,验证该方法的特异性及敏感性,并对31份临床样品进行检测。结果所建立的CSBVRT-PCR检测方法特异性和敏感性良好,以含CSBV结构蛋白基因的重组质粒为模板,最低可检出10pgDNA。临床症状诊断和电镜观察均为阴性的22份样品经RT-PCR检测,有2份扩增出目的条带。结论已建立了中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法,为CSBV检测、流行病学调查及动物模型的建立奠定了基础。     

腮腺炎病毒临床口漱液样本的一步法实时荧光定量PCR检测

目的建立腮腺炎病毒(mumps virus,MuV)临床口漱液样本一步法荧光定量PCR检测方法,为腮腺炎的临床诊断及免疫防控提供依据。方法对101份采集自中国南部3个省、自治区(云南、四川、广西)的临床疑似腮腺炎患者口漱液样本,分别采用细胞培养-MuV特异的巢式PCR法及TaqMan探针Real-time PCR法进行检测,比较两种方法检测MuV的灵敏性。结果细胞培养-MuV特异的巢式PCR法共检出31份MuV阳性样本,系统进化分析表明,该31株MuV均属于F基因亚型;TaqMan探针Real-time PCR法共检出41份MuV阳性样本,其中包含了细胞培养-MuV特异的巢式PCR法检出的31份阳性样本,TaqMan探针Real-time RT-PCR法对MuV的检出率(40.59%)高于传统细胞培养-巢式PCR法的检出率(30.69%)。结论 TaqMan探针Real-time PCR法的灵敏性、特异性和简便性均优于传统的细胞培养-MuV特异的巢式PCR法,可应用于腮腺炎的临床诊断及免疫防控。     

乙型脑炎减毒活疫苗对不同基因型乙型脑炎病毒的免疫效果

目的研究乙型脑炎减毒活疫苗免疫人体后对不同基因型乙型脑炎病毒的免疫反应。方法将乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2)免疫8~12月龄健康儿童,采集免疫前及免疫后28 d静脉血,分离血清,采用蚀斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)分别检测血清中对不同基因型乙型脑炎病毒毒株的中和抗体,计算血清中和抗体阳转率。结果乙型脑炎减毒活疫苗免疫后对基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型乙型脑炎病毒毒株均产生了显著水平的中和抗体,血清中和抗体阳转率分别为94%、92%和94%。结论乙型脑炎减毒活疫苗免疫人体后,对不同基因型的乙型脑炎病毒均产生良好的免疫应答。     

人呼吸道合胞病毒荧光PCR检测方法的建立和评价

目的建立人呼吸道合胞病毒(hRSV)荧光PCR(FQ-PCR)检测方法,并确定其最低检出限。方法针对hRSVN基因相对高度保守的序列,采用引物和探针设计软件PrimerExpressv2.0,设计1对特异性引物和1条TaqMan荧光探针,组装成荧光PCR检测试剂。以此试剂检测345份咽拭子样品,与ELISA法检测hRSVIgM抗体比较,确定最低检出限。结果该方法的最低检出限是传统的病毒滴度测定的104.79倍。与IgM抗体检测法相比,对于感染早期患者具有更高的检出率。结论建立的hRSVFQ-PCR检测方法具有简便、快捷的特点,适用于hRSV感染的早期诊断。     

RT-PCR法检测庚型肝炎病毒C(GBV-C)RNA

应用RT－PCR法在非甲～非戊型肝炎患者血清及单采浆站供血员血浆中检测到GBV－CRNA，扩增产物经序列测定进一步确证，在30例非甲～非戊型肝炎患者中阳性率为6．6％；在600例单采浆供血者血浆中阳性率为0．33％。提示GBV－C可能不是非甲～非戊型肝炎的主要致病因子，可能存在GBV－C健康携带者。     

应用HEV RNA RT-PCR诊断戊型肝炎的研究

根据我国HEV基因序列分析，设计引物，检测临床上可疑HE患者25例，82份样品。在患者血清及粪便样品中，HEVRNA的阳性率分别为77．78％和63．16％；临床诊断为HE的20例患者，HEVRNA全为阳性，5例抗HEV阴性而未分型的患者，HEVRNA也为阳性。血中HEVRNA可持续90天，粪便中可持续33天。     

检测戊型肝炎病毒核酸的实时荧光聚合酶链反应法的建立

目的建立一种能快速、敏感地检测戊型肝炎病毒(HEV)核酸的实时荧光聚合酶链反应法(Real-timeRT-PCR)。方法基于HEVORF3保守区序列,设计引物和探针,从22对引物和4条探针中进行筛选,并对选出的引物和探针的浓度、反应体系、反应条件、核酸抽提方法等进行优化。采用常规套式RT-PCR和本研究建立的实时荧光RT-PCR检测不同样品,比较两种方法的特异性和敏感性。结果优化出1对引物和探针的组合。优化的30μl反应体系中,上、下游引物浓度均为0.10mmol/L,探针浓度为0.20mmol/L,Taq酶的浓度为3U,AMV逆转录酶浓度为2U。优化的反应条件为:50℃30min;95℃3min;95℃10s,50℃30s,72℃60s,5个循环;95℃10s,57℃40s,40个循环。初步检测结果显示,该方法与常规套式RT-PCR特异性符合率为100%,两种方法检测HEV1型样品的敏感性均为104,检测人和猪的HEV4型样品时,实时荧光RT-PCR敏感性均为104,明显高于常规套式RT-PCR的103和102。结论所建立的检测HEV核酸的实时荧光聚合酶链反应法具有简便、快速、敏感性较高以及不易被污染等优点,具有一定的临床应用潜力。     

Effect of five kinds of pores shape on thermal stress properties of thermal barrier coatings by finite element method

Thermal ablation is a very important technique to characterize the thermal properties of coating systems. On account of the concentration of thermal stress, thermal barrier coatings (TBCs) often break off from the substrate partly or completely during the thermal erosion. In this paper, the thermal erosion simulation of finite element geometric models based on the possible pore shapes were implemented, especially, the influence of pore shapes on the distribution of coating temperature, X component of stress, Y component of stress, XY-shear stress and von-Mises stress were focused on. The effects of the different porosity of square pore coatings on thermal insulation properties and thermal stresses were discussed in term of the simulation results. The simulation results indicate that different shape pores not only affect the thermal stress distribution above the contact area between the bond coating and top coating surface, but also affect the plastic deformation behavior of TBCs. The micromechanism was discussed in details in this study. The computed results verified that, the computational method can successfully predict thermal shear, crack initiation and normal failure mode of the studied TBCs. All the results are in good agreement with the corresponding experimental findings. The failure mechanism factors in this paper are of great importance to explain the failure micro-mechanism of TBCs.     

五种耐火材料的抗飞灰侵蚀对比试验

为探寻适合在飞灰熔融炉中使用的耐火材料,以提高飞灰熔融炉的使用寿命,采用静态坩埚法,对国内某公司飞灰熔融炉用熔铸锆刚玉砖AZS-41以及有望适用于飞灰熔融炉的高铬砖CRB-86、铬刚玉砖CRCB-30、刚玉砖CB-99和锆英石砖DZB-69进行了抗飞灰侵蚀对比试验,并对侵蚀后试样进行了SEM和EDS分析。结果表明:1)熔铸锆刚玉砖AZS-41因结构致密而具有优异的抗飞灰渗透性,但抗飞灰侵蚀性能差。2)高铬砖CRB-86抗飞灰渗透性较好,因其高含量Cr2O3的存在而具有优异的抗飞灰侵蚀性。3)铬刚玉砖CRCB-30抗飞灰渗透性较差,因高含量且易被飞灰侵蚀的Al2O3的存在而表现出很差的抗飞灰侵蚀性。4)刚玉砖CB-99因显气孔率高,且Al2O3易被飞灰侵蚀,其抗飞灰渗透性和抗飞灰侵蚀性均最差。5)致密锆英石砖DZB-69因结构致密而具有优异的抗飞灰渗透性;但因锆英石相被飞灰中的碱性成分分解以致产生剥落,因此具有较差的抗飞灰侵蚀性。     

我国五大合成树脂市场状况及预测

分析了2010年我国合成树脂的供需现状:2010年前三季度国内五大合成树脂(聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯三元共聚物)产量为27.07 Mt,同比增加23.2%;进口量为12.12 Mt,同比下降7.1%;塑料制品产量40.22 Mt,同比增加20.8%.2010年全年国内五大合成树脂需求增...     

儿童呼吸道易感病原菌多重PCR检测方法的建立

目的建立儿童呼吸道5种易感病原菌多重PCR(Multiplex PCR,mPCR)检测方法,并应用该方法分析北京地区儿童呼吸道易感病原菌菌群分布情况。方法分别设计针对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)自溶素基因(ply)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae,KP)16S核糖体RNA基因(16S rRNA)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)热核酸酶基因(nuc)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,SE)特异性保守基因(SeS)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae,HI)16S rRNA基因的特异性引物,建立mPCR检测方法;验证该方法的特异性及敏感性;并采用该方法对北京地区128例呼吸道感染患儿和80名健康儿童咽拭子或痰标本进行检测,并与传统培养法检测结果进行比对。结果 mPCR法能对同一样品中5种病原菌的DNA模板同时进行PCR扩增;该方法检测5种病原菌之间及与呼吸道其他易感病原之间无交叉反应,敏感性可达5×10-10μg/μl;mPCR法检测128例呼吸道感染患儿的菌群分布情况为:HI 24.22%、SP 15.63%、KP 4.69%,SA 2.34%,未检出SE,与培养法相比,两种检测方法的总符合率为78.91%;感染患儿与健康儿童相比,HI和SP的感染率差异有统计学意义(P<0.01)。结论建立了从呼吸道标本中直接检测多病原儿童易感病原菌的mPCR检测方法,该方法特异性强、敏感性高,为临床正确诊断和治疗细菌感染性疾病提供了参考。     

High solubility of random-sequence proteins consisting of five kinds of primitive amino acids

Searching for functional proteins among random-sequence librariesis a major challenge of protein engineering; the difficultiesinclude the poor solubility of many random-sequence proteins.A library in which most of the polypeptides are soluble andstable would therefore be of great benefit. Although modernproteins consist of 20 amino acids, it has been suggested thatearly proteins evolved from a reduced alphabet. Here, we haveconstructed a library of random-sequence proteins consistingof only five amino acids, Ala, Gly, Val, Asp and Glu, whichare believed to have been the most abundant in the prebioticenvironment. Expression and characterization of arbitrarilychosen proteins in the library indicated that five-alphabetrandom-sequence proteins have higher solubility than do 20-alphabetrandom-sequence proteins with a similar level of hydrophobicity.The results support the reduced-alphabet hypothesis of the primordialgenetic code and should also be helpful in constructing optimizedprotein libraries for evolutionary protein engineering.     

HPLC法测定一种吡啶酮类医药中间体中5种杂质含量

目的 建立1-(4-氨基苯基)-5,6-二氢-3-(4-吗啉基)-2(1H)-吡啶酮(以下简称SM1)中5种杂质的分析方法.方法 采用HPLC方法,色谱柱:Waters SunFire C18(150mm×4.6mm,3.5μm);流动相A:0.03mol·L-1乙酸铵缓冲液-甲醇(75∶25),流动相B:0.03mo...     

浅谈硫酸根离子的两种检测方法

本文通过数次实验,分别用EDTA滴定法和分光光度法测定了油田水以及已知浓度的硫酸根离子。比较两种方法的可操作性、准确性以及优缺点。