氢氧化铝佐剂对肠道病毒71型灭活疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的影响

目的评价氢氧化铝佐剂对肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)灭活疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的影响。方法用含铝佐剂及无佐剂EV71灭活疫苗免疫BALB/c小鼠,并设生理盐水对照组。于加强免疫后7 d采血,进行小鼠脾单个核细胞(Mononuclear cell,MNC)的分离及CD8+T细胞的去除,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测经EV71疫苗原液或VP2-36刺激后的小鼠脾MNC分泌IFNγ水平;应用液相芯片技术(LUMINEX)检测经EV71疫苗原液刺激后的小鼠脾MNC分泌IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-10水平;采用体外微量中和试验法检测小鼠血清中和抗体效价。结果 BALB/c小鼠经2次免疫后,铝佐剂疫苗组小鼠脾MNC的IFNγSFC值显著高于无佐剂疫苗组(P均<0.05);铝佐剂疫苗组分泌IL-6和IL-10水平显著高于无佐剂疫苗组(P均<0.05);铝佐剂与无佐剂疫苗组小鼠血清EV71中和抗体阳转率均达到100%,铝佐剂疫苗组诱导的中和抗体效价显著高于无佐剂疫苗组(P<0.01)。结论 EV71灭活疫苗可诱导BALB/c小鼠产生特异性IFNγ、IL-2、IL-6和IL-10应答,铝佐剂可同时增强EV71灭活疫苗的Th1和Th2类免疫应答。     

肠道病毒71型灭活疫苗诱导小鼠细胞免疫抗原表位的筛选

目的筛选肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)灭活疫苗免疫小鼠后诱导的细胞免疫抗原表位,探讨EV71疫苗诱导的细胞免疫应答机制。方法以EV71 BJ08株(C4基因型)病毒结构蛋白氨基酸序列为模板,合成覆盖EV71 VP1～VP3的256条合成肽(每条肽12个氨基酸),分别以其为刺激物(80μg/ml),采用ELISPOT法测定EV71灭活疫苗免疫小鼠脾单个核细胞(Mononuclear cell,MNC)诱导IFNγ分泌的斑点形成细胞数(Spot-forming cell,SFC),筛选细胞免疫抗原表位。从脾MNC中去除CD4+或CD8+T细胞及封闭MHCⅡ类分子或MHCⅠ类分子,分析抗原提呈途径。结果通过对256条合成肽的筛选,获得3条可刺激小鼠脾MNC高水平分泌IFNγ的合成肽。以3条合成肽作为刺激物时,小鼠脾MNC分泌IFNγSFC均值(单针免疫组:22.3、12.8、17.4;两针免疫组:29.3、44.1、28.5)较乙肝表面抗原对照肽S28-3(9单针:2.1;两针:5.2)显著升高(P0.01)。当MNC中去除CD4+T细胞或封闭MHCⅡ类分子后,IFNγSFC均值显著下降(P0.05);而去除CD8+T细胞或封闭MHCⅠ类分子时,IFNγSFC均值未见显著性差异(P0.05)。结论已成功筛选出3个EV71细胞免疫抗原表位,分别位于VP1、VP2和VP3区域,3条合成肽均属MHCⅡ类限制性多肽。     

Al(OH)_3佐剂对不同抗原含量肠道病毒71型灭活疫苗免疫效果的影响

目的分析Al(OH)3佐剂对不同抗原含量肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗免疫效果的影响。方法将ICR小鼠随机分为9组,每组8只:常规剂量(160 EU/0.1 ml EV71)、1/2剂量(80 EU/0.1 ml EV71)、1/5剂量(32 EU/0.1 ml EV71)无佐剂及佐剂[Al(OH)31.0 mg/ml]疫苗组,并设佐剂、生理盐水及空白对照组,分别于0、28 d经肌肉免疫小鼠,分别于初免及加强免疫后28 d,经尾静脉采血,分离血清,采用体外微量中和试验法检测小鼠血清中和抗体效价,流式细胞仪检测IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A、IL-10、IFNγ及TNF水平。结果初免后28 d,1/2剂量疫苗组中佐剂组小鼠血清抗体阳性率明显高于无佐剂疫苗组,差异有统计学意义(P<0.05),其余各组间差异无统计学意义(P>0.05);加强免疫后28 d,常规剂量疫苗组中,佐剂及无佐剂组小鼠血清抗体阳性率均为100%,抗体GMT分别为1∶152.2和1∶139.6,1/2剂量疫苗组中,佐剂组小鼠血清中抗体GMT与无佐剂组相比,差异有统计学意义(P<0.05),其余组间抗体阳性率及抗体GMT差异均无统计学意义(P>0.05)。常规剂量、1/2剂量、1/5剂量疫苗组,均诱导产生IL-6、IL-10、IFNγ及TNF 4种细胞因子,与佐剂对照组和生理盐水对照组相比,差异有统计学意义(P﹤0.05),未检测到IL-2、IL-4、IL-17A。结论 EV71灭活疫苗可诱导小鼠产生IL-6、IL-10、IFNγ、TNF 4种细胞因子及特异性的抗EV71抗体,加入佐剂后免疫效果更好。     

重组弓形虫磷酸甘油酸变位酶2联合白细胞介素-2或干扰素γ诱导小鼠的脾淋巴细胞免疫应答

目的观察重组弓形虫磷酸甘油酸变位酶2(Recombinant Toxoplasma gondii phosphoglycerate mutase 2,rTgPGAM2)联合白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)或干扰素γ(Interferonγ,IFNγ)滴鼻免疫小鼠诱导的脾淋巴细胞免疫应答,探讨IL-2和IFNγ的佐剂效应。方法将48只BALB/c小鼠随机均分为6组:rTgPGAM2组(30μg)、IL-2组(500 IU)、IFNγ组(1 000 IU)、rTgPGAM2(30μg)+IL-2(500 IU)组和rTgPGAM2(30μg)+IFNγ(1 000 IU)组和对照组(20μl PBS),免疫途径均为滴鼻免疫,共免疫3次。末次免疫后第14天,颈椎脱臼处死小鼠,CCK-8法检测各组小鼠脾淋巴细胞增殖活性,ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中IL-2、IFNγ、IL-4和IL-10水平。结果经rTgPGAM2刺激后,与对照组比较,各免疫组小鼠脾淋巴细胞刺激指数(Stimulation index,SI)均显著高于对照组(P<0.05或P<0.01),rTgPGAM2联合IL-2或IFNγ组显著高于rTgPGAM2组(P<0.01或P<0.05);经ConA刺激后,仅IL-2组SI显著高于对照组(P<0.01)。各免疫组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IL-2和IFNγ含量均显著高于对照组(P<0.05或P<0.01),rTgPGAM2联合IL-2或IFNγ组显著高于rTgPGAM2组(P<0.01或P<0.05);rTgPGAM2组及其联合IL-2或IFNγ组IL-4含量显著高于对照组(P<0.05);而IL-10的含量,只有IFNγ组和rTgPGAM2+IFNγ组显著高于对照组(P<0.05)。结论 rTgPGAM2联合IL-2或IFNγ鼻内免疫小鼠诱导的脾淋巴细胞免疫应答优于rTgPGAM2单独免疫,表明IL-2和IFNγ具有良好的佐剂效应,IL-2的佐剂效应更佳。     

水油微球/BCG复合佐剂对结核杆菌融合蛋白PstS1-LEP免疫原性的影响

目的探讨水油微球与热灭活BCG(heat-killed BCG,HKBCG)或无细胞BCG(acellular BCG,ABCG)复合佐剂对结核杆菌融合蛋白PstS1-LEP免疫原性的影响。方法制备水油微球/HKBCG、水油微球/ABCG复合佐剂PstS1-LEP疫苗,经皮下注射免疫BALB/c小鼠3次,间隔2周,末次免疫后2周采血,处死小鼠并无菌摘脾;ELISA法检测小鼠血清抗Pst S1-LEP的IgG、IgG1和IgG2a抗体,ELISPOT法检测小鼠脾淋巴细胞经PstS1-LEP刺激分泌IFNγ、IL-4和IL-17的斑点形成细胞数(spots forming cell,SFC)。结果水油微球/HKBCG、水油微球/ABCG复合佐剂PstS1-LEP疫苗免疫小鼠诱导Pst S1-LEP特异性IgG、IgG1和IgG2a水平比较,差异无统计学意义(P0.05);水油微球/ABCG复合佐剂PstS1-LEP疫苗免疫小鼠的IFNγ-SFC、IL-17-SFC及IL-17-SFC/IL-4-SFC均高于水油微球/HKBCG复合佐剂PstS1-LEP疫苗,而两种疫苗免疫小鼠的IL-4-SFC、IFNγ-SFC/IL-4-SFC和IFNγ-SFC/IL-17-SFC比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论水油微球/ABCG复合佐剂PstS1-LEP疫苗诱导偏向Th1和Th17型细胞免疫,IFNγ-SFC、IL-4-SFC和IL-17-SFC的两两比值显示,水油微球/ABCG复合佐剂PstS1-LEP疫苗更有利于诱导Th17型细胞免疫漂移。     

两种佐剂系统对重组疟疾蛋白疫苗免疫效果的影响

目的比较两种佐剂系统对重组疟疾蛋白疫苗免疫效果的影响。方法将BALB/c小鼠随机分为02、03佐剂组、Pr组和NS组,每组24只。02、03佐剂组、Pr组分别经大腿内侧肌肉注射15μg恶性疟原虫融合蛋白-2.9(combine protein 2.9 of Plasmodium falciparum,PfCP-2.9)+15μg恶性疟原虫环孢子蛋白-2(circumsporozoite protein of Plasmodium falciparum 2,PfCSP-2)+02佐剂系统[75μg BCG-CpG-DNA+0.2 mg A(lOH)3)]、15μg PfCP-2.9+15μg PfCSP-2+03佐剂系统[(50μg PolyI:C+0.2 mg A(lOH)3]和15μg PfCP-2.9+15μg PfCSP-2,NS组注射生理盐水。隔周免疫1次,共5次,于初次免疫2周后每周内眦采血,分离血清,采用ELISA法检测血清IgG值及抗体效价;于2、3、4、5次免疫后2周,无菌取小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,采用ELISPOT法,对分泌IFNγ、IL-2、IL-4的特异性淋巴细胞数量进行检测。结果 02佐剂组小鼠血清IgG抗体效价在2次免疫后2周即可达到1∶105,03佐剂组在3次免疫后1周达到1∶105,而Pr组在5次免疫后2周达到1∶105,4次免疫后02、03佐剂组达到最高值。分泌IL-4的特异性淋巴细胞数,03佐剂组均明显高于02佐剂组、Pr组及NS组,02佐剂组3、4、5次免疫后才明显高于NS组,5次免疫后才明显高于Pr组(P均0.05);分泌IL-2的特异性淋巴细胞数,02佐剂组与03佐剂组比较差异无统计学意义(P0.05),3次免疫后02、03佐剂组均明显高于NS组,且03佐剂组也明显高于Pr组,4次免疫后02、03佐剂组、Pr组均明显高于NS组(P均0.05),但三者之间差异无统计学意义(P0.05);分泌IFNγ的特异性淋巴细胞数,02、03佐剂组、Pr组间差异无统计学意义(P0.05),且03佐剂组在3次免疫后明显高于NS组,而02佐剂组、Pr组在5次免疫后才明显高于NS组(P均0.05);02、03佐剂组分别在3、5次免疫后分泌IL-4的特异性淋巴细胞数量达到最高,且分别在5、3次免疫后,分泌IL-2的特异性淋巴细胞数量达到最高,二者均需5次免疫后分泌IFNγ的特异性淋巴细胞数量才可达到最高。结论 03佐剂系统可更加有效地增强重组疟疾蛋白疫苗的免疫原性,诱导机体产生较强的细胞免疫和体液免疫反应,5次免疫后可达到最佳免疫效果。     

两种方法制备的乙型肝炎疫苗的免疫效果

目的比较原位共沉淀法(以下简称原位法)和直接吸附法制备的乙型肝炎疫苗的免疫效果。方法采用原位法和直接吸附法制备乙型肝炎疫苗。将小鼠随机分为5组,即原位法疫苗组、直接吸附法(本所佐剂)疫苗组、直接吸附法(进口佐剂)疫苗组、佐剂对照组(铝佐剂+PBS)和空白对照组(PBS),分别于0、4、8周经小鼠腓肠肌免疫,0.1 ml/只,按照《中国药典》三部(2010版)进行疫苗吸附完全性试验及疫苗体外相对效力检测。于初免后第1、2、4、8、12、16周,经小鼠尾动脉采血,分离血清,采用ELISA法测定血清中Anti-HBs水平;于初免后第4、8、12周,各组分别取5只小鼠,经尾动脉采血,分离血清,采用流式细胞术,检测血清中T淋巴细胞亚群分布;于初免后第12周,各组分别取5只小鼠,无菌取脾,分离得到脾单个核细胞(mononuclear cell,MNC),采用酶联免疫斑点试验(enzymelinked immunospot assay,ELISPOT)法检测血清中HBsAg特异性IFNγ分泌水平。结果原位法疫苗组、直接吸附法(本所佐剂)疫苗组、直接吸附法(进口佐剂)疫苗组HBsAg吸附效率分别为95%、95%和96%,疫苗体外相对效力分别为2.2、2.1和2.3,均符合《中国药典》三部(2010版)要求。各疫苗组Anti-HBs阳转率均达到100%,随接种剂次的增加,Anti-HBs水平逐渐升高,于初免后第12周达到高峰,第16周出现下降;初免后第8周,原位法疫苗组Anti-HBs GMT高于直接吸附法(本所佐剂)和直接吸附法(进口佐剂)疫苗组,差异均有统计学意义(P0.05),初免后第4、12、16周,差异无统计学意义(P0.05)。初免后第4、8、12周,各组小鼠血清中CD3+CD4+T细胞水平均未见明显改变,第12周,各疫苗组CD3+CD8+T细胞水平均高于免疫前,差异有统计学意义(P0.01)。各疫苗组分泌IFNγ的斑点形成细胞(spot forming cell,SFC)数明显高于铝佐剂对照组和空白对照组;原位法疫苗组与直接吸附法(本所佐剂)和直接吸附法(进口佐剂)疫苗组相比,SFC数差异无统计学意义(P0.05)。结论两种方法制备的乙型肝炎疫苗均具有较好的免疫效果。     

皮内注射用布氏菌活疫苗的免疫学评价

目的探讨布氏菌活疫苗皮内注射小鼠产生的体液免疫、细胞免疫应答及免疫保护力。方法将30只小鼠随机分为3组,每组10只,分别为低剂量组(5×107个/只)、高剂量组(2×108个/只)和生理盐水对照组,3组均经后肢皮内注射布氏菌活疫苗,0.1 ml/只。免疫4周后,摘眼球取血,分离血清,制备脾脏淋巴细胞,ELISA法检测小鼠血清中抗Br-PPD Ig G抗体效价;ELISPOT法检测分泌IFNγ、IL-4的脾脏淋巴细胞数;ELISA法检测体外再刺激后小鼠脾脏淋巴细胞分泌的IFNγ水平;流式细胞术对T细胞亚群进行分类。用羊布氏菌M5弱毒株攻击免疫小鼠,通过脾脏荷菌量评价布氏菌活疫苗的免疫保护作用。结果低、高剂量组小鼠血清中抗Br-PPD Ig G抗体效价均较高,几何平均滴度分别为642和557;低、高剂量组小鼠在Br-PPD抗原刺激下,分泌IFNγ、IL-4的脾脏淋巴细胞数以及脾脏淋巴细胞分泌的IFNγ含量,与对照组相比差异均有统计学意义(P均<0.05);CD4+IFNγ+、CD4+IL-4+比例均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P均<0.05);低、高剂量组小鼠脾脏荷菌量为0,对照组小鼠为(5.13±0.16)log10 CFU。结论采用皮内注射布氏菌活疫苗的方式免疫小鼠后,能获得较强的体液免疫、细胞免疫应答及免疫保护力。     

不同浓度配比的CpG ODN和Al(OH)_3佐剂乙型肝炎疫苗的免疫原性

目的比较不同浓度配比的CpG ODN和Al(OH)3佐剂乙型肝炎疫苗的免疫原性。方法按乙肝表面抗原浓度为20μg/ml,分别加入3个浓度的Al(OH)3(300、400、500μg/ml)和CpG ODN(125、250、500μg/ml)佐剂,按不同配比制备9组不同佐剂浓度的疫苗样品,以不加CpG ODN佐剂的疫苗作为对照。将各组疫苗样品分别按1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256共5个稀释度稀释后,经腹腔免疫BALB/c小鼠,第5周检测血清中抗-HBs水平,计算抗体阳转率及半数有效量(ED50);将各组疫苗样品分别于第0和28天经左前胫肌肉免疫BALB/c小鼠,分别于第1次免疫后第2、4、6、8、10周检测体液免疫应答水平,第5周检测细胞免疫应答水平。结果不同浓度CpG ODN和Al(OH)3的9组疫苗样品免疫小鼠后,ED50均小于0.2,对照组疫苗的ED50为0.235。不同浓度CpG ODN和Al(OH)3的9组疫苗样品小鼠血清抗体滴度均高于对照组,且抗体产生时间略提前;Al(OH)3浓度为400和500μg/ml时,疫苗诱导小鼠产生的抗体滴度与CpG ODN佐剂浓度呈正相关。对照组诱导产生的IFNγ水平均较其他疫苗组低;随着A1(OH)3浓度的升高,同一CpG ODN浓度的疫苗样品诱导IFNγ的水平逐渐下降;相同A1(OH)3浓度下,低浓度CpG ODN组斑点形成细胞数(spot-forming cell,SFC)均值较高,而高浓度组SFC均值较低。结论 A1(OH)3和CpG ODN作为双佐剂系统协同乙型肝炎疫苗,不仅能增强体液免疫应答,还能诱导IFNγ的表达,激活Th1细胞免疫应答,比传统A1(OH)3单佐剂乙型肝炎疫苗更具优势,其中CpG ODN和Al(OH)3浓度均为500μg/ml的疫苗制剂免疫原性最佳。     

布氏菌活疫苗滴鼻免疫小鼠的免疫学评价

目的评价布氏菌活疫苗滴鼻免疫小鼠后黏膜、体液及细胞免疫的效果。方法将60只小鼠随机分为低剂量组(5×107个/只)、高剂量组(3×108个/只)和阴性对照组(生理盐水),均于小鼠清醒状态下进行滴鼻免疫布氏菌活疫苗,剂量为10μl/只(5μl/鼻孔)。免疫30 d后,分离血清,制备脾脏淋巴细胞及肺泡灌洗液。间接ELISA法检测免疫小鼠血清中Ig G抗体效价、肺泡灌洗液中Ig G、Ig A抗体效价及体外再刺激后小鼠脾细胞分泌IFNγ、IL-4水平;ELISPOT法检测分泌IFNγ、IL-4的脾脏淋巴细胞数目;流式细胞术检测T细胞亚群分类。用羊布氏菌弱毒株M5经皮下和滴鼻两种途径攻击免疫小鼠,通过脾脏细菌计数评价布氏菌活疫苗的免疫保护作用。结果低剂量组和高剂量组小鼠血清中Ig G抗体效价及小鼠肺泡灌洗液中的Ig G、Ig A差异无统计学意义(P0.05);低剂量组和高剂量组小鼠在Br-PPD抗原和灭活菌体抗原刺激下,分泌IFNγ的脾脏淋巴细胞数、体外再刺激后小鼠脾细胞分泌IFNγ的水平及脾淋巴细胞中CD4~+IFNγ~+细胞比例均明显高于阴性对照组(P0.05);攻毒试验结果表明,布氏菌活疫苗具有良好的保护力。结论布氏菌活疫苗经滴鼻免疫小鼠后可获得良好的免疫效果和保护力。