基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对阪崎克罗诺杆菌的鉴定及溯源

目的研究不同样品前处理方法对VITEK~?基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(VITEK~?MALDI-TOF MS,以下简称VITEK MS)鉴定阪崎克罗诺杆菌的影响及该方法对阪崎克罗诺杆菌的分型溯源能力,研究VITEK MS与MALDI 7090~(TM)MALDI-TOF/TOF MS(以下简称MALDI 7090)所得图谱的异同。方法选取3种不同样品前处理方法处理18株阪崎克罗诺杆菌野生菌株、2株阪崎克罗诺杆菌标准菌株和2株非阪崎克罗诺杆菌标准菌株,比较VITEK MS鉴定结果与传统鉴定结果的一致性;通过VITEK MS的鉴定结果和图谱的比对,研究不同样品前处理方法对阪崎克罗诺杆菌鉴定的影响;利用VITEK MS质谱图特征峰的聚类分析,对20株阪崎克罗诺杆菌进行溯源研究;同时比较VITEK MS与MALDI 7090所得图谱,研究两者的异同。结果 20株试验菌株的VITEK MS鉴定结果均为阪崎克罗诺杆菌,与传统的鉴定结果一致,并与2株非阪崎克罗诺杆菌标准菌株能明显地区分;3种不同样品前处理方法得到的鉴定谱图与标准谱图比对获得的鉴定结果可信度之间差异无统计学意义(P0.05),但质谱图中质谱峰数量和相对峰强度有明显差异,其中甲酸提取法在2 000~15 000 m/z范围内,相对峰强度5 m V的质谱峰数量达15个以上。在相似水平为80%的条件下,VITEK MS的聚类分析将甲酸提取法的20株阪崎克罗诺杆菌分为5个群,通过聚类分析及菌株来源能够推测阪崎克罗诺杆菌传播途径。VITEK MS和MALDI 7090得到的谱图,两者特征峰的出峰位置与相对峰强度无明显差异。结论 MALDI-TOF MS技术可以准确鉴定阪崎克罗诺杆菌;甲酸提取法更适用于阪崎克罗诺杆菌的MALDI-TOF MS鉴定;MALDI-TOF MS技术对阪崎克罗诺杆菌的溯源研究具有重要价值;VITEK MS与MALDI 7090所得谱图无明显差异。     

河南省市售婴幼儿配方食品中克罗诺杆菌的分子分型及系统发育研究

目的 了解河南省市售婴幼儿配方食品中克罗诺杆菌污染情况、分子分型特征及耐药情况,分析不同菌株间的系统发育进化关系。方法 采集婴幼儿配方食品227份,按照GB 4789.40—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》方法进行克罗诺杆菌的分离鉴定,并用微量肉汤稀释法和脉冲场凝胶电泳(PFGE)对分离株进行药敏实验和溯源分析,采用16S rRNA和多位点序列分型(MLST)方法进行种属鉴定和系统发育进化分析。结果 227份婴幼儿配方食品中检出13株克罗诺杆菌,分别属于阪崎克罗诺杆菌、苏黎世克罗诺杆菌和都柏林克罗诺杆菌。13株克罗诺杆菌药敏结果显示头孢唑啉耐药率达到84.6%(11/13),PFGE分型得到7个带型,MLST共分为6个ST型,其中ST1为优势型别,相同PFGE型的菌株也有相同的MLST型。结论 河南省市售婴幼儿配方食品中克罗诺杆菌污染以阪崎克罗诺杆菌为主,种属和基因型具有多样性,系统进化树分析结果显示MLST能够更好地说明种水平之间的亲缘关系。     

粮食加工品和肉制品中克罗诺杆菌的污染状况及致病性阪崎克罗诺杆菌生物膜形成能力研究

目的 克罗诺杆菌是重要的常见食源性致病菌,了解我国粮食加工品和肉制品中克罗诺杆菌的污染情况及致病性,为食品中该菌的防控提供理论依据。方法 本研究对黑龙江、北京、河北等八个省份的226份食品样品的克罗诺杆菌污染情况进行检测分离,对分离菌株基于重组和修复蛋白(recombination and repair protein gene, recN)基因序列进行种间鉴定,并针对阪崎克罗诺杆菌应用脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)进行分子分型以及对生物膜形成能力进行研究。结果 所有样品中克罗诺杆菌的检出率为18.58%,其中146份粮食加工品中32份检出克罗诺杆菌(检出率21.2%),80份肉制品中有10份检出克罗诺杆菌(检出率12.5%)。种间鉴定显示,94株为阪崎克罗诺杆菌,6株为丙二酸盐克罗诺杆菌,3株为都柏林克罗诺杆菌,3株为尤尼沃斯克罗诺杆菌,9株为苏黎世克罗诺杆菌。PFGE分型结果表明,94株阪崎克罗诺杆菌可被分为49个型别。结晶紫染色实验结果表明所有阪崎克罗诺杆菌均在36 h~60 h时间范围内达到最大菌膜生产量。结论 上述八个省份粮食加工品和肉制品中存在克罗诺杆菌的污染,其中阪崎克罗诺杆菌有多种PFGE带型,且均具有生物膜形成能力,为食品安全风险评估及标准制定提供基础数据,对公众卫生和健康具有重要意义。     

即食食品中阪崎克罗诺杆菌的分离鉴定及分子分型

为了解即食食品中污染阪崎克罗诺杆菌的流行情况,分析我国阪崎克罗诺杆菌主要流行菌株,对即食食品中分离的10株阪崎克罗诺杆菌进行基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、VITEK 2、16s rDNA鉴定,采用多位点序列分型(MLST)方法对分离菌株进行分型,并对PubMLST数据库中322株中国分...     

阪崎克罗诺杆菌的16S rDNA鉴定分型

阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)是一种重要的食源性条件致病菌,易引发新生儿、早产儿、低体重新生儿和免疫力低下的婴幼儿产生严重的脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎。本研究以分离自不同来源、通过生化鉴定的37株阪崎克罗诺杆菌作为研究对象,利用16S rDNA基因测序的方法对阪崎克罗诺杆菌进行鉴定和分型。结果表明:ES4并非为阪崎克罗诺杆菌,说明采用16S rDNA基因测序进行阪崎克罗诺杆菌的鉴定更为可靠;通过构建系统发育树分析,分离菌株位于同一系统发育分支;根据序列同源性比对,可将这一分支下的所有菌株分成7个子群,这表明16S rDNA基因测序可以对阪崎克罗诺杆菌进行分型,进一步揭示其系统发育关系。     

培养条件对阪崎克罗诺杆菌食品分离菌株生物被膜形成的影响

目的研究不同培养条件对阪崎克罗诺杆菌食品分离菌株生物被膜形成的影响。方法从23株阪崎克罗诺杆菌食品分离菌株中筛选5株菌株作为研究对象,利用试管法和96孔微板法检测不同培养条件下阪崎克罗诺杆菌的菌膜形成情况。结果 5株菌株在胰蛋白胨大豆肉汤培养基(triptych soy broth,TSB)中均具有较强的成膜能力;培养基中添加不同浓度的营养因子对阪崎克罗诺杆菌生物被膜的形成影响不同,葡萄糖对5株阪崎克罗诺杆菌食品分离菌株的成膜能力有明显促进作用,乳糖的添加对阪崎克罗诺杆菌生物被膜形成有一定影响,但蔗糖的添加对阪崎克罗诺杆菌生物被膜形成影响不明显;培养基中添加一定浓度的氯化钠可以有效抑制阪崎克罗诺杆菌生物被膜形成;p H对阪崎克罗诺杆菌的成膜能力也有一定影响,中性环境有利于阪崎克罗诺杆菌的被膜形成。结论阪崎克罗诺杆菌食品分离菌株具有形成细菌生物被膜的能力,并且不同培养条件对阪崎克罗诺杆菌生物被膜的形成影响不同。     

部分茶饮料原辅料中优势菌-克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)的分离和鉴定

克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)是新兴的条件致病菌,主要通过污染的婴儿配方奶粉引起2岁以下婴幼儿严重疾病甚至死亡.在对茶饮料原辅料192份样品进行细菌总数测定和优势菌16S rDNA序列分析时,发现2批次绿茶和l批次果葡糖浆中优势菌疑似条件致病菌-克罗诺杆菌,而且其数量较高(4.0× 102cfu/g～104cfu/g).进而通过rpoB序列分析,将4个分离株鉴定为阪崎克罗诺杆菌Cronobacter sakazakii(原阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakii).结果表明在常见的食品原料-果葡糖浆和绿茶中存在克罗诺杆菌的污染,rpoB分型方法在对克罗诺杆菌属细菌的鉴定到种上表现出高度特异性,灵敏而准确.     

克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的分离与鉴定能力验证结果与分析

目的 通过参加“奶粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测能力验证计划”,验证实验室对克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测能力,提高实验室检测技能。方法 依据GB 4789.40-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》中的第一法,对能力验证样品进行检验,对分离出的可疑菌落进行生化鉴定,同时用BIOLOG鉴定系统对可疑菌落进行鉴定。 结果 编号G785和编号V995的两个能力验证样品皆检出克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌) 结论 本次能力验证获得满意结果,证明本实验室具备克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测能力。在本次能力验证实验过程中,在以国标法检测的同时,辅以BIOLOG进行鉴定,与传统生化鉴定结果互为印证,提高了检测结果的准确性,对以后的检测工作具有一定的参考价值。     

阪崎克罗诺杆菌分离菌株的核糖体分型研究

利用Riboprinter对分离到的15株阪崎克罗诺杆菌进行了鉴定及核糖体分型,并利用Bio Numeicrus软件对其结果进行分析,如果按照相似性大于80%计算,根据辛普森方程计算该分型方法的分辨率可达到0.808。结果表明,核糖体分型(ribotyping)是一种适用于阪崎克罗诺杆菌的快速分子分型方法,可将不通来源的阪崎克罗诺杆菌分离菌株区别开来,能够对由该菌引起的食品中毒事件能够进行快速的溯源。     

硫辛酸对阪崎克罗诺杆菌感染能力的抑制作用

硫辛酸是一类天然的类维生素化合物,广泛分布于水果、蔬菜中。为评价硫辛酸对阪崎克罗诺杆菌感染能力的抑制作用,本研究探究了硫辛酸对阪崎克罗诺杆菌泳动及群集运动能力、生物被膜形成能力、黏附及侵入宿主细胞能力以及在巨噬细胞中存活及增殖能力的影响。结果表明,硫辛酸对阪崎克罗诺杆菌3株标准菌株和3株分离菌株的最小抑菌浓度均为5.00 mg/mL,硫辛酸对阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544的亚抑制浓度为30、60μg/mL。亚抑制浓度的硫辛酸可抑制阪崎克罗诺杆菌的泳动及群集运动能力、生物被膜形成能力、黏附及侵入Caco-2细胞能力。此外,硫辛酸可降低阪崎克罗诺杆菌在小鼠巨噬细胞RAW 264.7中存活及增殖的能力。综上,硫辛酸可有效抑制阪崎克罗诺杆菌并降低其感染宿主的能力。硫辛酸有潜力作为膳食补充剂用于预防或控制由阪崎克罗诺杆菌引起的相关食源性疾病。     

免疫富集联合MALDI-TOF MS检测奶粉中阪崎克罗诺杆菌的方法建立

目的:制备高效且特异性好的阪崎克罗诺杆菌抗体及其免疫磁珠,建立免疫富集联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)检测奶粉中的阪崎克罗诺杆菌的方法。方法:制备阪崎克罗诺杆菌混菌抗体及其免疫磁珠,对免疫磁珠分别在纯培养及奶粉基质中的捕获率进行研究,利用MALDI-TOF MS对不同奶粉基质中不同杂菌污染条件下的检测样本进行鉴定并验证免疫磁珠的特异性。结果:阪崎克罗诺杆菌免疫磁珠在纯培养条件及奶粉基质中对4株阪崎克罗诺杆菌及其混菌的捕获率均>80%,联合MALDI-TOF MS鉴定结果显示在奶粉基质中不同杂菌污染条件下具有较好的鉴定结果,即使在高比例（1:100）杂菌污染条件下,仍能准确鉴定奶粉中阪崎克罗诺杆菌,此时检测样品中阪崎克罗诺杆菌浓度仅为20 CFU/mL。结论:本研究建立了一种操作简便、鉴定结果准确的免疫富集联合MALDI-TOF MS检测奶粉中阪崎克罗诺杆菌的方法,为奶粉中阪崎克罗诺杆菌的快速准确鉴定提供了新的方法参考。     

谷类食品中克罗诺杆菌的分离与鉴定

为了解谷类食品中克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)的污染情况。本研究采集了100份谷类食品样品,采用国家标准GB 4789.40-2010分离克罗诺杆菌,并利用基于ITS和Omp A特异基因片段的PCR鉴定方法、16S r DNA基因序列分析等方法对可疑克罗诺杆菌进行了初步的鉴定。结果发现谷类食品中克罗诺杆菌的污染率为21.0%,并分离出21株可疑克罗诺杆菌,其中17株(占总数的81.0%)被初步鉴定为阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii),3株(占总数的14.2%)为都柏林克罗诺杆菌(C.dublinensis),1株(占总数的4.8%)可能为尤尼沃斯克罗诺杆菌(C.universalis)或苏黎世克罗诺杆菌(C.turicensis)。研究结果表明市售谷类食品中存在食源性克罗诺杆菌的污染,应该加强谷类食品中克罗诺杆菌的流行病学监测。     

食品中克罗诺杆菌的分离和鉴定

利用国标方法对食品(蔬菜,熟食和豆制品)进行了克罗诺杆菌的污染情况调查及其分离菌株的鉴定;利用fus A基因对分离的克罗诺杆菌进行了遗传多样性分析,将克罗诺杆菌属的分离株鉴定到种的水平。主要取得了以下结论和认识:139份食品(蔬菜23份,熟食14份和豆制品2份)中有14份样品检出了克罗诺杆菌,检出率为35.9%。蔬菜类检出8份(34.8%),熟食制品检出4份(28.6%),2份豆制品都检出(100.0%);2对14株克罗诺杆菌分离株进行基于fus A基因的系统进行分析,结果显示这些分离株包括C.Sakazakii和C.malonaticus 2个种,其中C.sakazakii有9株,C.malonaticus有5株。     

阪崎克罗诺杆菌耐热性和耐酸碱性的研究

研究阪崎克罗诺杆菌分离菌株对温度及酸碱的耐受性,从而对婴儿配方粉生产过程中的阪崎克罗诺杆菌的污染进行控制。对4株来源不同的阪崎克罗诺杆菌进行不同温度和酸碱条件的处理,并将处理后的菌液涂布于TSA培养基观察菌株的存活情况;以阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544为阳性对照。结果显示,不同来源的菌株对温度及酸碱的耐受性存在一定的差异,这为降低该菌的感染风险提供了依据。     

乳粉中阪崎肠杆菌检测能力验证结果与分析

目的提升实验室检测乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的速度和准确性。方法依据GB4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》和经优化的SN/T1632.3-2013《出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法第3部分:荧光PCR方法》以及能力验证作业指导书对乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)进行检测和结果判断。结果通过实时荧光PCR法的快速初筛,初步判断样品CODE29为阴性,样品CODE95为阳性;再经显色平板分离和VITEK2生化鉴定,结果显示:样品CODE29检出肺炎克雷伯杆菌、弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌;样品CODE95检出阪崎肠杆菌和大肠埃希氏菌。结论本次乳粉样品中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测能力验证结果合格,为提高相关微生物实验室的检测能力提供参考。     

阪崎克罗诺杆菌标准物质研制

目的采用冷冻干燥技术制备均匀性和稳定性符合要求的阪崎克罗诺杆菌标准物质,用于实验室内部质量控制。方法对使用菌株阪崎克罗诺杆菌(45403)的生化特征、16SrRNA序列、质谱特征进行确认。采用冷冻干燥技术制备含量为103 CFU/样品的菌球。参照CNAS-GL29《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》,对20件样品进行均匀性检验,采用单因素方差分析对结果进行统计分析。将样品分别于-20、2、37℃条件下保藏,对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价。组织5家实验室进行协同标定。使用20件婴儿配方乳粉作为基质对阪崎克罗诺杆菌标准物质的使用效果进行确认。结果阪崎克罗诺杆菌(45403)生化鉴定结果、16SrRNA序列的NCBIGenebank比对结果、质谱鉴定结果均为阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)。采用单因素方差分析进行均匀性检验, F=1.067, P=0.442,符合标准物质的要求。于-20℃保藏170 d,于25、37℃保藏14d后,样品仍然稳定。经5家实验室协同标定,样品含量均为103 CFU/样品。20件婴儿配方乳粉作为基质加入阪崎克罗诺杆菌标准物质进行检验,均可以检出。结论阪崎克罗诺杆菌(CMCC45403)的生化特征、16SrRNA序列分析、蛋白飞行质谱特征均符合克罗诺杆菌属的典型特征。均匀性、储藏稳定性、运输稳定性及适用性的验证实验结果均符合标准物质的要求。     

添加扩增内标的PCR方法快速检测食品中的阪崎克罗诺杆菌

为了解决常规PCR方法检测阪崎克罗诺杆菌时因检测过程中环境和食品理化因素的影响而导致的假阴性结果的产生,本研究以细菌16S rRNA基因为扩增内标对照,以阪崎克罗诺杆菌特异性基因grx B为靶基因设计了一对特异性引物,并通过优化PCR反应条件,最终建立了一种添加扩增内标的阪崎克罗诺杆菌PCR检测方法,可以指示PCR过程中因存在DNA聚合酶抑制剂而导致的假阴性结果。通过对20种细菌进行PCR检测显示,该方法对阪崎克罗诺杆菌具有良好的特异性。灵敏度实验结果表明,该检测方法对阪崎克罗诺菌纯DNA模板的检测灵敏度为2.15×102fg/μL,对阪崎克罗诺杆菌纯培养物的检测灵敏度为9.4×103CFU/m L。对人工污染婴幼儿奶粉的检测结果显示,阪崎克罗诺杆菌接种量为0.94 CFU/g的婴幼儿奶粉样品经过8 h增菌培养后,即可检出。食品样品检测结果表明,不添加扩增内标的PCR检测方法中出现的假阴性结果可被本方法检出。该检测方法特异性强、灵敏度较高,能消除阪崎克罗诺杆菌常规PCR检测方法中可能出现的假阴性结果,适用于婴幼儿配方乳粉、乳制品等食品中阪崎克罗诺杆菌的快速检测。     

实时荧光单引物等温扩增检测阪崎克罗诺杆菌方法的建立

目的建立实时荧光单引物等温扩增(SPIA)检测阪崎克罗诺杆菌的方法。方法本文以阪崎克罗诺杆菌Omp A基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,对4株不同来源阪崎克罗诺杆菌和21株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA特异性分析,通过不同浓度梯度阪崎克罗诺杆菌菌悬液灵敏度的检测和添加有阪崎克罗诺杆菌的婴儿配方奶粉样品检出限的确定,评价方法的准确度。结果除4株阪崎克罗诺杆菌外,其他细菌均未出现特异性荧光扩增曲线,具有良好的特异性。在40 min内,实时荧光SPIA检测阪崎克罗诺杆菌纯培养基因拷贝灵敏度为每反应1 copies,相应活菌数为1.6×10-1cfu/ml;对婴儿配方奶粉模拟样品中阪崎克罗诺杆菌的检出限是1.5×100cfu/100 g。结论本研究建立的方法具有灵敏度高、特异性强、耗时短、操作简单等优点,适用于实验室快速检测阪崎克罗诺杆菌Omp A基因。     

婴幼儿乳粉和米粉中阪崎克罗诺杆菌的耐受性研究

以婴幼儿乳粉和米粉中分离到的15株不同基因型的阪崎克罗诺杆菌为材料,研究其对不同温度、酸碱度和微波的耐受性以及对枯草杆菌二联活菌颗粒(商品名:妈咪爱)和产乳酸菌素乳酸菌的敏感程度。采用平板计数法检测阪崎克罗诺杆菌在不同处理后的存活率,衡量菌株的耐受性;采用皿内抑菌法检测妈咪爱和产乳酸菌素乳酸菌对阪崎杆菌的抑制作用。结果表明:70℃处理20 min后,15株阪崎克罗诺杆菌的存活率均低于0.11%,对阪崎克罗诺杆菌的致死作用明显高于50℃和60℃(P0.01)。阪崎克罗诺杆菌经pH 4.0、pH 6.0和pH 8.0条件处理20 min后,部分菌株被致死,pH 4.0时的存活率明显低于其它2组(P0.01)。微波处理2min后,大部分供试菌株的死亡率超过99%,菌株间存活率无显著性差异(P0.05)。产乳酸菌素乳酸菌和妈咪爱对供试菌株均有一定的抑制作用,部分菌株对其的敏感程度具有极显著差异(P0.01)。结论:阪崎克罗诺杆菌的耐受性和敏感程度存在差异,采用适当的条件处理能有效防止阪崎克罗诺杆菌对婴幼儿食品的污染。     

阪崎克罗诺杆菌的ITS序列分析

以分离自不同来源(不同地区乳制品及某一企业婴儿配方乳粉加工生产环境)、经API20E鉴定为阪崎克罗诺杆菌的37株分离株为研究对象,采用ITS序列对其进行鉴定分析。结果表明,ITS序列分析在阪崎克罗诺杆菌鉴定中具有一定的优越性,且研究发现,ITS序列中含有两种功能基因tRNAgul和tRNAile+ala,这为今后阪崎克罗诺杆菌的鉴定及ITS基因的进一步分析提供了可供参考的理论依据。