ALA-PDT后结肠癌细胞生长抑制及P21、cyclinD1、CDK2mRNA表达的研究

目的：探讨ALA-PDT对结肠癌细胞增殖抑制及以及对P21、cyclinnD1、CDK2的影响。方法：采用MTF法检测PDT后对细胞增殖抑制情况。应用RT-PCR技术检测细胞P21、cyclinD1、CDK2mRNA的含量。结果：PDT后P21mRNA含量较PDT前提高（P〈0．01），而cyclinD1、CDK2mRNA的含量下降（P〈0．01），SW480细胞出现明显的增殖抑制。结论：ALA-PDT对肿瘤细胞的增殖抑制作用与其诱导P21的过表达，进而下调cyclinD1、CDK2的表达有关。     

ALA-PDT后结肠癌细胞生长抑制及P21、cyclinDl、CDK2mRNA表达的研究

目的:探讨ALA—PDT对结肠癌细胞增殖抑制及以及对P21c、yclinDl、CDK2的影响。方法:采用MTT法检测PDT后对细胞增殖抑制情况。应用RT—PCR技术检测细胞P21、cyclinDl、CDK2mRNA的含量。结果:PDT后P21mRNA含量较PDT前提高(P<0.01),而cyclinDl、CDK2mRNA的含量下降(P<0.01),SW480细胞出现明显的增殖抑制。结论:ALA—PDT对肿瘤细胞的增殖抑制作用与其诱导P21的过表达,进而下调cyclinDl、CDK2的表达有关。     

PDT对SW480细胞和转染CD自杀基因的SW480结肠癌周期和凋亡的影响

目的:观察PDT对SW480细胞和转染CD自杀基因的SW480结肠癌细胞周期和凋亡的影响.方法:采用脂质体基因转移技术将CD基因转染SW480结肠癌细胞后,进行PDT处理,用流式细胞仪分析ALA-PDT结合CD/5Fc自杀基因系统对结肠癌细胞周期和凋亡的影响.结果:ALA-PDT可使SW480细胞G1,细胞比率明显降低,S期细胞比率升高;ALA-PDT不会增加SW480细胞凋亡.PDT与5-Fc结合对SW480-CD细胞各周期比率的影响与对照组相似,表明对各期细胞影响度相似;两种方法结合可以明显诱导SW480细胞凋亡.结论:静止期SW480细胞对PDT比较敏感,增殖期细胞相对不敏感.PDT与5-Fc结合对静止期和增殖期癌细胞均有杀伤作用,且可明显诱导细胞凋亡.     

5-ALA光动力疗法对人结肠腺癌SW480细胞的抑制作用

结直肠癌是当前最常见的消化道恶性肿瘤之一，但目前治疗手段单一，迫切需要寻找新的解决途径。第二代光敏剂ALA是一种内源性光敏剂，我们应用ALA—PDT对人结肠癌细胞SW480进行了体外实验性治疗研究。实验表明：ALA孵育的SW480细胞可产生PpⅨ,ALA-PDT可于PDT后早期明显抑制SW480细胞的生长增殖，降低细胞存活率，本实验结果显示ALA—PDT作为一种新型肿瘤疗法具有治疗结肠癌的可行性。     

Survivin-siRNA对骨肉瘤MG-63细胞药物敏感性的研究

目的研究特异性Survivin-siRNA转染骨肉瘤MG-63细胞后对骨肉瘤细胞药物敏感性的影响。方法应用两种特异性Survivin-siRNA（Survivin-siRNA,Survivin—siRNA,）转染骨肉瘤MG-63细胞,RT—PCR检测MG-63细胞Survivin-mRNA表达,流式细胞术检测MG-63细胞的凋亡,MTT法检测顺铂、多柔比星对转染前后MG-63细胞的半数抑制浓度（IC50）。结果特异性Survivin-siRNA转染骨肉瘤MG-63细胞24h后SurvivinmRNA表达水平明显抑制;流式细胞术显示转染Survivin-siRNA的MG-63细胞48h后凋亡率明显高于非特异性siRNA组和空白对照组（F=17．32,P〈0．01）;特异性Survivin—siRNA增强了MG-63细胞对多柔比星的敏感性5倍,增强了MG-63细胞对顺铂的敏感性9倍。结论化学合成的Survivin—siRNA能有效抑制Survivin基因在骨肉瘤MG-63细胞中的表达,并提高MG-63细胞对多柔比星、顺铂的敏感性。     

RNAi沉默整合素连接激酶基因对人膀胱癌BIU-87细胞体内成瘤的影响

目的：研究RNAi沉默整合素连接激酶（integrin-linked kinase,ILK）基因对人膀胱癌BIU-87细胞裸鼠皮下成瘤的影响。方法：构建4条针对ILK基因的特异性miRNA干扰载体和1条阴性对照载体,并利用脂质体转染法将其转染BIU-87细胞,并筛选获得稳定转染细胞株。利用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测抑制效果。将10只裸鼠随机分为2组,皮下分别接种转染组细胞和未转染组细胞,观察瘤体的生长情况,并于接种4周后处死裸鼠,测量其瘤体体积和重量,并将瘤体做HE染色,观察瘤体病理情况。结果：转染组细胞ILK的表达明显受到抑制,以miR-3组的抑制效率最高。裸鼠皮下成瘤实验检测发现：两组均有瘤体形成,未转染组较转染组瘤体生长快,未转染组体积平均为：289.56±36.49mm3,转染组为：56.67±4.32mm3。瘤体重量分别为：1.265±0.02 g和0.518±0.03g。转染组与未转染组相比差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论：利用RNAi技术能有效抑制靶基因ILK的表达,从而降低膀胱癌细胞的体内的增殖能力。     

以叶酸受体为靶向的脂质体介导MYCN基因小干扰RNA体外抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞的增殖

目的以氨基脂为主要成分、叶酸受体为靶向的脂质体包裹MYCN基因小干扰性RNA,研究其体外对神经母细胞瘤LA-N-5细胞MYCN基因表达的抑制及细胞增殖的影响。方法制备氨基脂为主要成分、叶酸受体为靶向的脂质体包裹CY3标记的MYCNsiRNA转染LA-N-5细胞,以每微克蛋白中荧光强度半定量siRNA的转染效果;用定量RT-PCR检测转染前后MYCN基因mRNA变化;MTT法检测细胞增殖受抑情况：结果以100nmol／L终浓度转染LA—N-5细胞后每微克蛋白含siRNA（1808．5&#177;140．2）pg,作用72hMYCN基因mRNA表达显著下降,抑制率79．2％,瘤细胞增殖受抑达66．2％。结论叶酸受体为靶向脂质体介导MYCNsiRNA在体外对LA—N-5细胞MYCNmRNA表达有显著抑制作用,明显抑制LA—N-5细胞增殖,为神经母细胞瘤靶向治疗、基因治疗开辟了新的思路。     

5-杂氮-2’-脱氧胞苷调控UCHL1基因表达对人前列腺癌PC-3细胞增殖及凋亡的影响

目的：探讨5-杂氮-2’-脱氧胞苷（5-Aza—CdR）对人前列腺癌细胞（PC-3）株增殖和凋亡的影响及其可能机制。方法以2．5、5．0、10．0kenol／L的5-Aza—CAR作用于PC-3细胞48h后,采用流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率;逆转录聚合酶链式反应（tiT—PcR）检测UCHL1 mRNA表达;甲基化测序聚合酶链反应（BsP）检测UCHLlCpG岛的甲基化状态;蛋白质印迹法（Western Blot）检测UCHL1蛋白的表达。结果：5-Aza—CAR对PC-3细胞生长有抑制作用;与对照组相比细胞凋亡率明显增高（P〈0．01）;5-Aza—CdR处理细胞后UCHL1的启动子甲基化水平明显降低（P〈0．01）;UCHL1 mRNA表达水平显著上调（P〈0．01）;UCHL1蛋白表达水平上升（P〈0．01）。结论：5-Aza—CAR能诱导前列腺癌PC-3细胞株凋亡的作用,其机制可能是5-Aza—CdR能逆转PC-3细胞UCHLl启动子CpG岛的异常甲基化,诱导mRNA转录和蛋白的表达。     

鼠重组腺病毒介导的骨形成蛋白-9转染大鼠牙囊干细胞的实验研究

目的：探讨鼠重组腺病毒介导的骨形成蛋白9基因转染大鼠牙囊干细胞的可行性及其转染后的成骨作用,以获得可用于牙周骨组织再生工程的基因修饰的种子细胞。方法：取大鼠下颌骨,解剖显微镜下体外分离培养纯化鉴定牙囊干细胞,腺病毒介导的骨形成蛋白9基因转染第三代牙囊干细胞,并设立空白对照组,绿色荧光病毒组（GFP组）。通过观察细胞形态及生长曲线变化,荧光显微镜及RT—PCR检测转染后骨形成蛋白9基因mRNA的表达,碱性磷酸酶及钙茜素红染色测定转染后牙囊干细胞的成骨活性。结果：与未转染对照组比较,转染组细胞转染2周后形成钙化结节,停滞期延长,数量轻度下降,倍增时间延长。牙囊干细胞转染骨形成蛋白9基因后12h后即有荧光表达,转染3,6,9,12d后骨形成蛋白9mRNA均呈阳性表达且逐渐增强,未转染对照组呈阴性。转染组碱性磷酸酶活性随转染时间的延长呈升高趋势,ALP染色及茜素红钙结节染色为阳性：未转染对照组碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色均呈弱阳性表达,转染组显著高于未转染组。结论：鼠重组腺病毒介导的RBMP-9基因可以成功地转染大鼠牙囊干细胞,转染后牙囊干细胞高表达骨形成蛋白9,且具有明显的成骨作用。     

竹红菌乙素光动力对人舌鳞癌Tca8113细胞杀伤作用的初步研究

目的：本文是用实验的方法,初步探讨中药光敏剂竹红菌乙素（HB）在光动力（PDT）作用下,对体外人舌鳞癌Tca8113细胞的杀伤作用。方法：常规培养、选取对数生长期人舌鳞癌Tca8113细胞,用含有竹红菌乙素（HB）浓度分别为0μM、0．25μM、0．5μ／M、1μM、2μM的RPMI-1640培养液孵育细胞4h后,经470nmLED定制多光源半导体激光光照处理（PDT）,能量密度设置分别为0J／CM^2、1J／CM^2、2J／CM^2、3J／CM^2、4J／CM^2。PDT处理后细胞继续孵育24h后,分别在光学显微镜和荧光显微镜下观察细胞形态学变化,并用甲基噻唑四唑法（MIT法）检测竹红菌乙素（HB）对细胞的抑制作用。并分别在激光照射6h及24h后,用流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果：经PDT处理后细胞在光学显微镜及荧光显微镜下均可观察到细胞坏死和凋亡样改变;在一定浓度范围和光照能量密度范围内,竹红菌乙素（HB）在PDT作用下对人舌鳞癌Tca8113细胞生长增殖的抑制和诱导凋亡作用与药物浓度和能量密度成正相关变化。结论：竹红菌乙素（HB）在光动力（PDT）作用下,对人舌鳞癌Tca8113细胞具有显著的杀伤作用,并在一定范围内呈浓度剂量和光剂量正相关依赖性。     

Ras信号通路阻断剂FTI-277抑制HeLa细胞增殖及对cyclin E表达的影响

目的：观察Ras信号通路阻断剂（FTI-277）在人类宫颈癌细胞株HeLa细胞中对细胞周期素E（cyclin E）表达及对HeLa增殖、凋亡的影响情况。方法：采用MTT法观察不同浓度的FTI-277对HeLa细胞的生长抑制作用;流式细胞术（FCM）观察Hela细胞的细胞周期变化;RT-PCR、Western blot法检测FTI-277阻断Ras信号通路前后HeLa细胞cyclin E mRNA及蛋白表达。结果：各浓度范围FTI-277均能抑制HeLa细胞的增殖,且具有剂量依赖性和时间依赖性。流式细胞术分析显示,FTI-277作用后的HeLa细胞明显滞留于G1/S期,且具有时间依赖性。RT-PCR及Western blot结果显示,FTI-277作用前后HeLa细胞cyclin E mRNA表达无明显变化,而蛋白表达水平明显降低。结论：FTI-277可以抑制细胞增殖,Ras信号转导通路可能是通过影响HeLa细胞cyclin E转录后的翻译环节减少其表达。     

姜黄素诱导肺癌A549细胞凋亡

目的：研究姜黄素对A549细胞凋亡的诱导作用,并探讨其可能的分子机制。方法：姜黄素处理A549细胞后,MTT法于不同时间点检测A549细胞的增殖情况;姜黄素处理A549细胞48h后,流式细胞术（Flow CytoMetry,FCM）检测A549细胞的凋亡率;30μmol／L姜黄素处理A549细胞24h、48h、72h后,RT—PCR、Western—Blot检测A549细胞中P53、Bcl2、Bax和cagpase-3基因的表达水平。结果：姜黄素对肺癌A549细胞增殖的抑制作用具有显著的浓度-时间依赖关系,30μmol／L姜黄素可诱导A549细胞凋亡。30μmoL／L姜黄素作用A549细胞24h即可引起A549细胞中P53、Bax和Caspase-3表达水平的上调,48h后可引起Bcl2表达水平的下调,诱导A549细胞凋亡。结论：30μmol／L姜黄素可诱导A549细胞凋亡,其机制可能与促进P53、Bax和Caspase-3基因的表达,抑制Bcl2基因的表达有关。     

靶向YB-1的microRNA表达载体的构建及其对MB-MDA-231细胞增殖的影响

目的：构建靶向YB-1基因的microRNA表达载体,研究其对乳腺癌细胞MB-MDA231增殖的影响。方法：采用microRNA靶基因预测软件预测可能作用于YB-1基因的micro RNA,构建其过表达载体,利用Lipofectamine2000转染细胞MB-MDA231,荧光显微镜下评估转染效果,real-time ...     

三羟异黄酮对光动力疗法中H22细胞VEGF表达的影响

目的探讨光动力作用对肿瘤细胞血管内皮细胞因子表达的影响及三羟异黄酮的干预作用。方法运用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,检测光动力作用后H2 2细胞VEGFmRNA表达的时相变化,比较各组有无显著差异,以及三羟异黄酮干预作用后其表达变化。结果H2 2细胞VEGFmRNA表达在光动力作用后1小时即有明显增加,峰值出现在PDT作用后4小时,各时相点均显著高于对照组(P <0 .0 1) ,三羟异黄酮呈浓度依赖性抑制其表达。结论三羟异黄酮可以抑制光动力作用所致H2 2细胞VEGFmRNA的表达升高。     

提高mdr1基因体外转染骨髓造血细胞效率的实验研究

目的：探讨mdrl基因体外转染兔骨髓造血细胞的条件及转染后在细胞中的功能性表达。方法：秋水仙碱（90ng／ml）筛选含人mdrlcDNA的产病毒包装细胞PA317-HaMDR1／A,制备浓缩病毒上清液并转染兔骨髓单个核细胞;分别用PCR法、免疫组织化学法和柔红霉素（daunorubicinDNR）排出试验检测mdr1基...     

电穿孔法转染原代培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞的条件优化

目的:通过电穿孔法将增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体pEGFP-N1质粒导入原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,探讨影响外源基因电转染效率的参数,如电压、脉冲长度、DNA剂量以及转染后时间长度等.方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒,选择不同的电压梯度、脉冲长度及DNA剂量,采用电转仪将pEGFP-N1质粒导入原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,用荧光显微镜观察转染后不同时间pEGFP-N1瞬时表达情况及细胞存活情况,流式细胞仪检测其转染效率.结果:在电压为250v、脉冲数1、脉冲长度15μs、DNA质粒6μg时,电穿孔法将pEGFP-N1质粒导入瘢痕疙瘩成纤维细胞转染率最高,细胞存活率最高,转染后24h明显表达,48h后表达最强.结论:在适当的电压、脉冲长度下,选择适当的DNA用量,在转染后一定的时间范围内,电穿孔法转染原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞可使目的基因获得较高的转染率,且细胞死亡最少.电穿孔法是研究原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学行为较为理想的转染方法.     

慢病毒载体转染离体兔角膜基质细胞的实验研究

目的：观察慢病毒载体转染离体兔角膜基质细胞的有效性及对细胞活性的影响。方法：转染组用慢病毒携带增强型绿色荧光蛋白（Lentivirus-enhanced green fluorescent proteins,Lenti-EGFP）转染细胞,对照组则加入空白培养液,在不同感染复数（multiplicity of infection,MOI）及感染后不同时间段在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况并计算转染率;RT-PCR检测EGFP mRNA的表达;MTT比色法和流式细胞技术（Flow cytometer,FCM）检测病毒对细胞增殖和凋亡的影响。结果：Lenti-EGFP转染细胞后从48h开始可见绿色荧光,在MOI=500时,转染后第5天转染率可达51%;RT-PCR检测转染组有EGFP的mRNA表达;MTT结果显示在MOI为1~500时,漫病毒不影响细胞的增殖;在MOI=500时,FCM检测慢病毒载体对细胞凋亡无影响。结论：慢病毒载体可以在体外稳定有效转染兔角膜基质细胞且不影响细胞活性,是角膜基质细胞理想的基因转染载体。     

缺氧诱导因子1α对大鼠骨髓间充质干细胞核心结合因子α1表达的影响

目的：研究体外低氧实验中缺氧诱导因子1α（HIF-1α）对大鼠骨髓间充质干细胞核心结合因子α1（Cbfα1）表达的影响。方法：将体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞分别置于常氧（含有5％c02的培养箱中）和低氧（含4％02、5％CO2和91％N2的三气培养箱中）中培养,分别于1d、3d、5d和7d用实时荧光定量PCR检测细胞内HIF-1α和CbfalmRNA的表达水平：用siRNA抑制细胞HIF-1αmRNA表达后用Westernblot法检测HIF-1α和Cbfal蛋白表达。结果：与常氧组相比,低氧组细胞HIF-1αanRNA的表达均增加（1d、3d、5d和7d：P〈0．05）,且3d达到最高峰;细胞CbfalmRNA的表达明显下降,3d尤为明显（P〈0．05）：低氧组细胞转染siRNA干扰HIF-1α表达后,能促进细胞内Cbfcd蛋白的表达（P〈0．05）。结论：低氧微环境抑制骨髓间充质千细胞的成骨向分化,细胞内HIF-1α反向调节Cbfal的表达。     

ALA-PDT通过NF-kB通路调节巨噬细胞极化状态

目的:探讨ALA-PDT对巨噬细胞极化的影响,并探讨相关机制。方法:采用免疫荧光、PCR、WB等试验检测巨噬细胞极化特征蛋白CD86、CD206、iNOS、ARG-1的表达水平变化,NF-kB激活-核转运检测试剂、WB试验检测NF-kB通路激活情况,WB试验检测抑制NF-kB通路后CD86、iNOS蛋白表达水平。结果:免疫荧光、PCR、WB实验结果显示,PDT处理后,巨噬细胞M1特征蛋白CD86、iNOS表达水平增高,M2特征蛋白表达水平下降(P<0.05)。NF-kB激活-核转运检测、WB实验结果表明PDT处理后,NF-kB通路被激活。给予NF-k B通路抑制剂处理,PDT处理后巨噬细胞M1特征蛋白CD86、iNOS表达水平增高现象被抑制。结论:ALA-PDT通过激活NF-kB通路促进巨噬细胞向M1极化。     

毫米波辐照诱导鼻咽癌细胞凋亡及分子机制的实验研究

采用细胞计数、光镜和FOM等方法检测毫米波对人鼻咽癌CNE1细胞增殖、细胞凋亡及相关基因表达的影响,结果发现：波长为7.1mm,频率为42.2GHz,功率密度为1mW/cm^2的毫米波辐照,1次／日,30min／次,照射4次,能显著抑制CNE1细胞增殖和克隆形成;并诱导细胞凋亡,光镜下可见到明显的凋亡细胞,FCM示调亡百分比显著增加。FCM结果表明其增殖抑制作用与P21表达上调及Cyclin D1表达下调有关,其调亡诱导机制可能是非P53依赖的途径,而主要通过上调c-Myc、下调Bcl-2和Fas基因的表达来实现。