过量表达purC基因对Lactococcus lactis NZ9000酸胁迫抗性的影响

通过在乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000中过量表达嘌呤代谢途径中编码磷酸核糖基氨基咪唑-琥珀酰胺合酶的pur C基因,测定了重组菌株在酸胁迫条件下的存活率,经p H 4. 0胁迫培养4 h后,重组菌株的存活率为对照菌株的83. 2倍。采用ATP测定试剂盒和高效液相色谱分别考察菌株胞内ATP和氨基酸含量。结果表明,重组菌株在酸胁迫条件下维持了更高的胞内ATP和氨基酸(天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸和γ-氨基丁酸)含量,分别通过为细胞提供能量和消耗胞内质子的方式,帮助乳酸乳球菌抵御酸胁迫。研究发现,在乳酸乳球菌中过表达pur C基因能够明显提高菌株的酸胁迫抗性,同时为进一步通过改造嘌呤代谢途径提高乳酸菌酸胁迫耐受性提供了新的思路。     

多重胁迫对嗜盐四联球菌CGMCC 3792存活率及细胞成分的影响

本研究以嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus CGMCC 3792)为实验菌株,考察了单因素(酸、热、盐)胁迫和交互保护对其存活的影响。结果表明,T.halophilus CGMCC 3792在p H4.0和45℃预适应处理60 min后细胞对酸致死胁迫(p H2.5,60 min)的存活率分别提高了10.6倍和8.8倍。此外,还考察了酸胁迫对细胞膜不饱和脂肪酸和胞内氨基酸含量的影响,结果表明,酸预适应后再经酸致死胁迫导致细胞膜不饱和脂肪酸18∶1n-9和18∶2n-6,9含量增加,分别是直接经酸致死胁迫的2.3倍和2.0倍;同时,分析胞内氨基酸含量,胞内谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸浓度分别是直接经酸致死胁迫的2.5倍、2.4倍、2.2倍和2.7倍。研究结果将有助于进一步解析嗜盐四联球菌环境胁迫抗性的生理机制。     

乳酸乳球菌硫胺素转运蛋白ThiT提高酸耐受性的机制

碳代谢引起的酸积累严重影响了微生物细胞的代谢活性。为提高细胞在酸性环境下的耐受性,通过过量表达硫胺素转运蛋白ThiT,研究了重组菌株的酸胁迫耐受性,并在此基础上通过比较转录组学对照菌株和重组菌株在正常和酸胁迫条件下关键基因的转录水平进行了研究。结果表明,经过酸胁迫（pH 4.0） 处理后,重组菌株的最大存活率优势是对照菌株的16.2倍。转录组学的分析发现,过表达ThiT转运蛋白可提高细胞对碳水化合物的转运能力,从而为细胞抵御酸胁迫的耐受性提供更多的能量;此外寡肽、甜菜碱等相关转运基因的显著上调可帮助细胞抵御酸胁迫的损伤。作者探究了在乳酸乳球菌中过表达ThiT转运蛋白提高细胞酸胁迫耐受性的具体作用机制,为ThiT蛋白在其他工业微生物中的应用提供了理论基础。     

乳酸菌在大豆黄浆水中发酵条件的优化

以乳酸乳球菌乳亚种为发酵菌株,大豆黄浆水为培养基质,产酸量、pH值为考察指标,探讨不同发酵温度、发酵时间、种子液接种量、葡萄糖添加量对乳酸乳球菌乳亚种在黄浆水中发酵产酸的影响。在单因素试验的基础上,采用均匀设计法对其发酵条件进行优化,并对产酸量进行二次多项式逐步回归分析。结果表明,乳酸乳球菌乳亚种在黄浆水中最适发酵条件为发酵温度35℃、种子液接种量9%(V/V)、发酵时间68h、葡萄糖添加量5%(m/V)、初始pH 6.2,该条件下产酸量达0.791 3g/100mL,pH为3.40。     

表达外源谷氨酸脱羧酶基因对重组乳酸乳球菌胁迫抗性的影响

通过在乳酸乳球菌（Lactobacillus lactis）NZ9000外源添加一定浓度的γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid,GABA）和表达可以合成GABA的谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase,GAD）两种方式,研究L. lactis NZ9000在酸胁迫和冷冻胁迫下的表现。结果表明：外源添加GABA的手段对于L. lactis NZ9000在酸胁迫和冷冻胁迫下的生长没有明显帮助。与之相反,通过逆转录-聚合酶链式反应克隆茶树中的CsGAD,构建pNZ8148-CsGAD表达载体,可获得高效表达GAD的基因工程重组菌L.?lactis?NZ9000/pNZ8148-CsGAD。经2?ng/mL乳酸链球菌素（Nisin）诱导8?h后,高效液相色谱检测表明重组菌合成GABA能力提高5?倍以上。生长曲线测定结果表明,正常培养条件下,重组菌到达对数生长平台期的时间较对照菌延长,到达稳定期的最大生物量（OD600?nm）提高至对照菌的1.5?倍;在pH?4.0的酸性培养条件下,对照菌基本不生长,而重组菌仍保持一定的生长力。低温胁迫实验结果表明,培养至稳定期后期的乳酸菌抗冻能力和存活率均要高于对数期中期和稳定期前期2?个培养阶段,且不同培养阶段中,重组菌的存活率均高于对照菌1～2?个数量级。综上所述,重组的L.?lactis?NZ9000/pNZ8148-CsGAD能够通过食品级异源表达CsGAD产生的GABA显著提高乳酸菌抗酸和抗冷冻胁迫的能力。本研究为探索研究乳酸菌抗胁迫机理、改良乳酸菌生长状态以利于其工业化用途的扩展提供了参考。     

酸胁迫条件对粪肠球菌Gr17代谢合成细菌素的影响

目的:粪肠球菌Gr17分离自中国传统发酵酸鱼，可以代谢合成新型广谱IIa类细菌素enterocin Gr17，有作为发酵食品功能性菌株的巨大应用潜力，然而该菌株应用于实际发酵环境时会面临各种胁迫条件，酸胁迫是其中主要的胁迫因素之一。本研究旨在探讨不同酸胁迫条件对菌株Gr17生长及代谢合成细菌素的影响。方法:在筛选可正向影响细菌素合成的酸胁迫条件参数基础上，测定该条件下细菌素生物合成相关基因的表达水平变化，分析其影响机制。结果:与正常生长条件pH 7.0相比，在pH 4.5~6.5的酸胁迫条件下，菌株Gr17的菌体密度会随pH值的下降而降低；pH 5.0～6.5的酸胁迫条件可明显正向提高细菌素的分泌合成量，其中pH 5.5的酸胁迫条件最为明显。在此条件下，细菌素生物合成相关ABC转运系统as-48H、as-48G、as-48F、as-48E基因表达在处理时间48 h内没有显著变化，种内群体感应调控系统自诱导肽基因entIP在8 h时表达量明显提高，双组分基因entPK、entR以及细菌素编码基因entGr17在12 h时表达量明显提高。结论:基于以上结果，推测pH 5.5的酸胁迫条件可以促进自诱导肽的分泌表达，正向调控种内群体感应系统，从而增加细菌素的合成。本研究结果对于从分子水平上全面揭示实际发酵环境中乳酸菌细菌素的合成调控行为，最大限度地提高产细菌素乳酸菌在发酵生产中的应用价值具有重要的科学和现实意义。     

酸和盐胁迫对乳酸菌活性的影响

该研究以13株食品常见乳酸菌为研究对象,考察酸和盐胁迫对其活性的影响,探究这13株乳酸菌的最适酸、盐生长条件及耐酸、耐盐能力。结果表明,适当的低盐浓度（1%、2%）对部分乳酸菌的生长有促进作用,植物乳杆菌和副干酪乳杆菌的最适盐浓度为1%,保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌的最适盐浓度为2%;盐浓度进一步增大,13株乳酸菌的生长受到抑制;盐浓度为10%时,除戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、嗜热链球菌和乳酸片球菌外,其余9株菌的生长抑制率都＞95%。当pH值为5～7时,13株乳酸菌都生长良好,pH=6时,7株乳酸菌活性均最高;随着酸胁迫的增强,13株乳酸菌生长受抑制程度增大;pH为1～3时,13株乳酸菌的生长抑制率都＞90%,高盐及高酸对9株杆菌的抑制作用强于4株球菌。     

酸胁迫和冷胁迫对鼠李糖乳杆菌的交叉保护作用

选用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)hsryfm 1301为出发菌株,比较15℃低温和pH 4.0酸性条件下,对氧化、酸、渗透压和高温4种常见胁迫的耐受能力,探究低温预处理和酸性预处理对L. rhamnosus hsryfm 1301的交叉保护作用。结果表明,经过低温预处理的L. rhamnosus hsryfm 1301比对照样品在7%NaCl渗透压胁迫下的存活率提高了约高20%;L. rhamnosus hsryfm 1301经过pH4的酸性预处理比对照样品在pH3的酸性胁迫下表现出高约11%的存活率;两种预处理手段对氧化胁迫和高温胁迫均无明显交叉保护作用。     

酸适应海德尔堡沙门氏菌对环境胁迫耐受性分析

目的：研究海德尔堡沙门氏菌（Salmonella heidelberg）低pH值酸适应性及酸适应对细胞其他胁迫环境耐受性的影响。方法：海德尔堡沙门氏菌在pH 5.5酸性培养基中生长2 h诱导酸适应性,以pH 3.0酸胁迫培养基及不同温度、NaCl、胆盐、消毒剂环境的存活率评价其耐受性。结果：pH 5.5酸适应2 h后,海德尔堡沙门氏菌在pH 3.0酸胁迫环境的存活率大幅提高。低pH值酸适应也使海德尔堡沙门氏菌在45、50 ℃高温条件下的存活率显著提高,对4 ℃冷藏环境的耐受性显著低于非酸处理菌株,但对－20 ℃冷冻环境的生存无影响。酸适应海德尔堡沙门氏菌对高渗、胆盐胁迫也表现良好的耐受性,5～10 g/100 mL NaCl溶液处理1 h,酸适应海德尔堡沙门氏菌的存活率大于60%,在1～10 g/100 mL胆盐溶液的存活率比对照组高3.8 倍。海德尔堡沙门氏菌酸适应性也使其对消毒剂的敏感性发生变化,酸适应性海德尔堡沙门氏菌在10～25 mmol/L H2O2溶液的存活率显著高于对照菌株,最高达3.1 倍;但对NaClO、乙醇消毒剂的耐受性显著降低,高质量浓度下二者无显著差异。结论：海德尔堡沙门氏菌在低pH值酸性条件生长一段时间会诱导产生酸适应性,还会协同提高其对高温、高渗、胆盐、H2O2胁迫环境的交叉抗性;但对4、－20 ℃低温、NaClO、乙醇等杀菌、保藏措施敏感性提高。     

塔城地区酸马奶中耐乙醇乳酸菌的筛选与鉴定

以新疆塔城地区酸马奶为研究对象,采用传统方法初步筛选出乳酸菌共53株,通过生理生化试验,确定有乳酸杆菌24株,乳酸球菌29株,以不同体积分数乙醇溶液进行胁迫12 h。结果表明,乙醇对菌株的生长有抑制作用,筛选出对乙醇耐受性较强的菌株,其中菌株S7-1、S7-2、SMN3-3、SMN10-1、SNT16可耐受体积分数13%的乙醇胁迫。通过总DNA序列分析,确定菌株SMN3-3为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）,菌株SMN10-1为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）,菌株S7-1与S7-2为面包乳杆菌（Lactobacillus crustorum）,菌株SNT16为乳酸片球菌（Lactobacillus fermentum）。     

基于CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌进行绿色荧光蛋白标记

乳酸乳球菌是治疗剂在体内运送的良好载体,研究其在体内的真实运送情况需对其进行标记。该实验利用CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000进行增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)标记,用于研究乳酸乳球菌在体内的运送,评价其作为益生菌的功能。基于该实验室已构建的乳酸乳球菌CRISPR/Cas9编辑质粒pLL25构建重组质粒pYSH,其上携带eGFP及同源臂,电转入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中,将基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldh)替换为绿色荧光蛋白基因,从而使Lactococcus lactis NZ9000获得标记,表达绿色荧光蛋白。对绿色荧光标记的Lactococcus lactis NZ9000突变株,酶标仪定量分析eGFP的表达强度。荧光强度定量分析结果表明,在乳酸乳球菌不同生长阶段,eGFP基因均能稳定表达。     

基于CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌进行绿色荧光蛋白标记

乳酸乳球菌是治疗剂在体内运送的良好载体,研究其在体内的真实运送情况需对其进行标记。该实验利用CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000进行增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)标记,用于研究乳酸乳球菌在体内的运送,评价其作为益生菌的功能。基于该实验室已构建的乳酸乳球菌CRISPR/Cas9编辑质粒pLL25构建重组质粒pYSH,其上携带eGFP及同源臂,电转入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中,将基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldh)替换为绿色荧光蛋白基因,从而使Lactococcus lactis NZ9000获得标记,表达绿色荧光蛋白。对绿色荧光标记的Lactococcus lactis NZ9000突变株,酶标仪定量分析eGFP的表达强度。荧光强度定量分析结果表明,在乳酸乳球菌不同生长阶段,eGFP基因均能稳定表达。     

乙酰丙酸对沙门氏菌诱导性耐酸响应

本实验探究了鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和德尔卑沙门氏菌（S. Derby）在pH值为6.0、5.4的乙酰丙酸、L-乳酸、醋酸和盐酸条件下酸适应后产生的耐酸性。结果表明,酸化剂对沙门氏菌抑菌效果为：乙酰丙酸＞醋酸＞L-乳酸＞盐酸。pH 5.4时,沙门氏菌的诱导耐酸显著高于pH 6.0（P＜0.05）;与其他两种有机酸处理组相比,乙酰丙酸诱导的细菌耐酸性最弱且不同pH值之间差异显著（P＜0.05）。有机酸处理的沙门氏菌细胞内pH值与对照组相比存在差异,其中pH 6.0时乙酰丙酸处理组的鼠伤寒沙门氏菌的细胞内pH值显著高于德尔卑沙门氏菌（P＜0.05）。结果表明沙门氏菌经pH 6.0和pH 5.4的酸适应后会产生耐酸性,而细胞内pH值的变化和诱导耐酸密切相关。     

外源添加单一氨基酸对桑葚酒风味品质的影响

为探究外源添加氨基酸在改善桑葚酒风味品质中的影响,在桑葚果汁中分别添加400 mg/L的异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）和缬氨酸（Val）制备桑葚酒,并分析桑葚酒理化指标、挥发性风味物质和感官品质。结果表明,与对照相比,外源添加单一氨基酸可显著增加桑葚酒的挥发性风味物质含量（42.38～84.58 mg/L）（P＜0.05）,添加Ile显著增加活性戊醇、乙酸活性戊酯含量,添加Leu显著增加异戊醇、乙酸异戊酯含量,添加Phe显著增加苯乙醇和乙酸苯乙酯的含量,添加Val显著增加异丁醇和乙酸异丁酯含量,添加四种氨基酸都能增加辛酸乙酯的含量（P＞0.05）;添加Phe可提高桑葚酒花香,添加Ile、Leu或Val提高果香,添加四种氨基酸的桑葚酒的口感评分均显著提高（P＜0.05）。     

东北酸菜中乳酸菌的分离鉴定与耐酸性菌株的筛选

为筛选出高耐酸性乳酸菌,通过形态学观察和随机扩增多态性DNA标记分析技术,对自然发酵酸菜中分离纯化的乳酸菌菌株进行初步鉴别,随后利用16S rDNA序列同源性分析进行种属鉴定,并筛选在pH 3.0条件下存活率较高的菌株。结果表明,72 株分离乳酸菌包括62 株乳杆菌和10 株乳球菌,其中有21 株菌的指纹图谱不相同,经鉴定,分别为乳肠球菌（Enterococcus lactis）、弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）、米曲霉乳杆菌（L. oryzae）、短乳杆菌（L. brevis）、副干酪乳杆菌（L. paracasei）、棒状乳杆菌（L. coryniformis）。pH 3.0条件下存活率在75%以上的菌株有8 株,管家基因rpoA序列同源性分析结果表明高耐酸性的两株菌株为植物乳杆菌（L. plantarum）,为开发功能性乳酸菌食品提供了一定理论支持。     

基于非靶向代谢组学分析酿酒酵母甲酸胁迫的响应和耐受性机制

采用液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MC)的非靶向代谢组学,探究酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)响应甲酸胁迫的代谢机制.主成分分析和正交偏最小二乘判别分析等多元统计结果表明,甲酸处理后酿酒酵母中发生显著变化(P＜0.0...     

醋酸对巴氏醋杆菌生长和代谢活性的影响

醋酸对微生物具有较高的毒性,醋酸菌具有特殊的机制能够耐受较高浓度的醋酸,常用于醋酸的发酵生产。本论文以巴氏醋杆菌AC2005为研究对象,研究了醋酸对菌体生长、葡萄糖代谢和胞内ATP浓度的影响。与不含醋酸条件下相比,培养基中加入1%(V/V)的醋酸,菌体的生物量增加了92%,单位菌体葡萄糖消耗速率增加了13%,细胞代谢活性增加了120%,代谢产物中丙酮酸浓度增加了约46%,柠檬酸和琥珀酸的浓度分别降低了80%和46%,胞内ATP浓度增加了171%。进一步利用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)的方法分析了蛋白表达情况,发现加入醋酸后细胞内与三羧酸循环相关的蛋白明显上调。结果表明,醋酸菌可以通过提高菌体代谢活性,增加胞内ATP浓度,从而耐受较高浓度的醋酸。     

H+-ATPase activity in Bifidobacterium with special reference to acid tolerance

The acid tolerance of 17 strains of nine species of bifidobacteria was compared using brief exposures to acidic conditions (pH 2-5). In addition, because it has been hypothesized that the acid tolerance of bifidobacteria depends on H+-ATPase activity, the activity of this enzyme in various strains and species was compared. In general, the acid tolerance of bifidobacteria was found to be weak, with the exception of Bifidobacterium lactis and Bifidobacterium animalis. High numbers of all strains of B. lactis and B. animalis survived exposure to pH 3-5 for 3 h. The H+-ATPase activity of the acid-tolerant strains B. lactis LKM512 and JCM 10602T, and B. animalis JCM 1190T, JCM 1253, JCM 7117, and JCM 7124 was higher at pH 4 than at pH 5. In contrast, the H+-ATPase activity of nonacid-tolerant strains was lower at pH 4 than at pH 5.