实时荧光PCR法快速检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株

目的建立一种敏感、特异、快速的实时荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株的方法,为临床治疗提供指导。方法设计引物和TaqMan-MGB探针,利用TaqMan-MGB探针技术,建立实时荧光定量PCR法。检测临床HBV-YMDD变异标本36份和野生型HBV标本20份,并将其YMDD变异结果与DNA测序结果进行比较。结果该方法检测灵敏度为101拷贝/μl;特异性为100%;最低检测限度为101DNA拷贝/30μl反应体系;实时荧光PCR方法测得YMDD野生株20份,变异株36份,与DNA测序结果完全一致,符合率为100%。结论应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测YMDD变异株基因,具有灵敏、特异和精确等优点,对临床监测拉米夫定耐药具有重要意义。     

血清HBV-DNA与HBV免疫学标志物相关性研究

目的探讨荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术定量检测HBV-DNA与乙型肝炎病毒(HBV)血清学标志物之间的相关性。方法采用ELISA和FQ-PCR法对250例乙肝患者进行HBV-M以及HBV-DNA定量检测。比较不同乙肝病毒血清学标志物阳性组合HBV-DNA阳性情况。结果HBsAg( )HBeAg( )HBcAb( )血清中HBV-DNA阳性率和含量最高,血清中HBeAg与HBV-DNA含量密切相关,但部分HBeAg阴性或HBeAb阳性患者也有较高的HBV-DNA阳性率及含量。结论荧光定量PCR法检测血清中HBV-DNA含量可以准确地反映病人体内病毒的感染和复制情况,可准确地为临床提供科学的诊断依据。     

HBVDNA定量与乙肝病毒标志物及肝功能的相关性分析

目的 探讨HBVDNA定量检测结果与乙肝病毒标志物及肝功能指标的关系。方法 对697例乙肝患者血清标本采用实时荧光定量聚合酶链反应法(FQ-PCR)检测HBVDNA含量,时间分辨免疫荧光法(TRFIA)检测乙肝病毒标志物含量,并同步进行肝功能监测。结果 结果显示HBsAg、HBeAg与HBVDNA的相关系数分别为0.313、0.516,P<0.05,HBsAg、HBeAg与HBVDNA呈正相关。HBVDNA与肝功能损害指标ALT、AST、PAB、ALB、TBIL、PT不存在相关性,P>0.05。结论 乙肝病毒标志物定量检测结果与HBVDNA载量之间及各病毒标志物之间存在一定的相关性,HBsAg、HBeAg是反映乙肝病毒复制的指标之一,但不能用病毒量的多少来判断肝功能受损的程度。     

乙型肝炎病毒基因组C区启动子突变位点新型检测方法的建立、验证及初步应用

目的利用错配扩增和荧光PCR技术,建立一种针对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因组C区启动子(basal core promoter,BCP)1762/1764突变位点的新型检测方法,并对该方法进行验证及临床评价。方法根据NCBI登录的HBV A-H型基因序列(以GenBank号为AB033556.1的C基因型作为标准参考序列)合成野生型和突变型标准品序列,测序后连接至pMD-18T载体上,构建质粒标准品,设计引物、探针及合适的突变检测体系,确定检测的线性范围;对建立的方法进行灵敏度、重复性、特异性、稳定性验证;分别用本实验建立的ARMS-PCR法和基因Sanger测序法(金标准)检测132份慢性乙型肝炎患者血液样本的基因位点是否发生突变,并分析ARMS-PCR法的灵敏度和特异度。结果 ARMS-PCR法能检测1×102~1×109 copies/ml的野生型和突变型质粒;野生型和突变型样本检测的Ct差值(ΔCt)在7以上,且能检出最低达1%突变含量的混合质粒和样本;该方法灵敏度较高,重复性、特异性、稳定性良好;其检测132份慢性乙型肝炎患者血液样本1762/1764位点突变阳性率为41.7%,明显高于Sanger测序法检测结果(P0.05)。结论建立的ARMS-PCR法能很好地用于评估乙肝患者患肝癌的风险,且较Sanger测序法检测精度更高,更适合于临床推广。     

慢性乙型肝炎患者血清前S_1抗原与HBV DNA的相关性及临床意义

目的 探讨慢性乙型肝炎患者血清前S_1抗原与HBV DNA的相关性。方法 采用ELISA及荧光定量PCR法检测180例慢性乙型肝炎患者血清前S_1抗原及HBV DNA含量。结果 前S_1抗原阳性者108例,HBVDNA阳性者130例,130例,HBV DNA阳性率显著高于前S_1抗原阳性率(P<0.05);130例HBV DNA阳性者中,前S_1抗原阳性者80例;108例前S_1抗原阳性者中,HBV DNA阳性者80例。结论 前S_1抗原与HBV DNA的联合检测及动态观察慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA水平的变化,有助于临床诊断、疗效观察及预后判断。     

巨细胞病毒感染PCR检测方法的建立

目的建立检测巨细胞病毒污染的PCR检测方法,并制备检测试剂盒。方法采用TaqMan探针,选择保守序列CMV-pp65设计引物,荧光定量病毒载量;对试剂盒进行敏感性、重复性和特异性等测试;对31份临床阳性血清标本和106份正常献血者血浆标本进行检测,并与国内同类试剂盒进行比较。结果该试剂盒检测线性定量范围可达202~3.6×109copies/ml,敏感性为360copies/ml,CV值在1%左右,特异性高,临床标本检测的符合率为100%。本试剂盒与国内已上市试剂盒比较,具有较好的相关性、更高的敏感性和更宽的定量检测范围。结论制备的试剂盒特异性和敏感性均较高,适用于临床上的病毒检测。     

胃癌相关miRNAs的筛选及其作用靶点的验证

目的筛选胃癌中相关miRNAs,并验证其作用靶点。方法应用基因芯片技术检测3份正常胃组织标本、24份胃癌组织标本、胃癌细胞SGC7901和正常胃黏膜细胞GES-1中328个miRNAs的表达情况。采用实时荧光定量PCR对结果进行验证,并用基因克隆和Western blot方法分析miR-9的作用靶点。结果共有26个miRNAs在胃癌标本(包括24份胃癌组织和SGC7901细胞)中异常表达。其中19个下调,7个上调。实时荧光定量PCR检测出miR-9在胃癌标本中的表达水平显著下调,该结果与基因芯片检测结果一致。miR-9与RAS癌基因家族成员RAB34的表达呈负相关。结论已初步筛选了胃癌相关miRNAs。miR-9可能是胃癌中的标记性miRNAs之一,RAB34是其作用靶点。     

长春地区丙型肝炎病毒的基因分型及其与肝脏疾病的相关性

目的分析长春地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型的分布及其与HCV RNA含量、感染途径、肝病程度的相关性。方法采用荧光定量PCR和型特异性引物PCR对82份抗-HCV阳性病人的血清标本进行HCV RNA检测及HCV的基因分型,并分析基因型与感染途径、HCV RNA含量和肝病程度的相关性。结果78份HCV RNA阳性血清标本中1a型占5.1%、1b型占48.7%、2a型占33.3%、2b型占11.6%、3a型占1.3%,未发现混合型。血源性与非血源性感染患者间HCV基因型构成比差异无统计学意义。基因1b型的HCV RNA含量高于2a型,且差异有统计学意义。HCV感染的不同程度肝病患者的基因型分布差异有统计学意义,基因1b型比率显著高于其他基因型。结论长春地区丙型肝炎病毒基因型流行株为1b和2a型;HCV基因型与感染途径无明显相关性;基因lb型的病毒含量明显高于2a型;HCV基因型与慢性丙型肝炎的严重程度及肝硬化、肝癌的产生有一定的相关性。     

FQ-PCR联合Sanger测序法检测结直肠癌患者表皮生长因子受体、KRAS及BRAF基因突变

目的建立实时荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)联合Sanger测序法快速检测结直肠癌患者表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、KRAS和BRAF基因突变的方法。方法根据结直肠癌中EGFR、KRAS和BRAF基因常见突变类型设计引物及其TaqMan探针序列,以提取的86份结直肠癌患者肿瘤组织DNA为模板,进行FQ-PCR扩增,PCR产物经SAP酶和EXOⅠ酶作用后,收集酶切产物,进行测序PCR扩增,扩增产物经乙醇/醋酸钠法纯化后进行测序,测序结果采用Bioedit软件进行分析;检测EGFR、KRAS及BRAF基因突变,并与FQ-PCR法检测KRAS12/13密码子突变进行比较。结果成功建立了FQ-PCR联合Sanger测序法检测结直肠癌患者样本中EGFR、KRAS和BRAF基因突变的方法,各基因PCR扩增曲线均为标准的"S"型荧光扩增曲线,测序峰图清晰、稳定。86份结直肠癌样本中,EGFR基因突变概率2.3%(2/86),均为第21号外显子点突变,突变类型为L858R和L861Q;KRAS基因突变概率33.7%(29/86),其中第12位密码子突变占79.3%(23/29),突变类型为G12D和G12V,第13位密码子突变占10.3%(3/29),突变类型为G13D,第12和13位密码子同时突变1例(3.4%),第61位密码子未检测到突变,第146位密码子仅检测到2例突变,占6.9%(2/29),突变类型均为A146V;BRAF基因未检测到突变。FQ-PCR法检测KRAS12/13密码子突变概率高于FQ-PCR联合Sanger测序法,但差异无统计学意义(P0.05),两种检测方法的总体符合率为97.7%(84/86)。结论实时FQ-PCR联合Sanger测序法可快速检测结直肠癌患者中EGFR、KRAS和BRAF基因突变,检测方法稳定、可靠。     

两种乙型肝炎病毒核酸定量试剂对315例样本检测结果的比较

目的采用国内和国外乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)定量检测试剂盒检测315份血清样本,比较两种试剂检测能力的差异。方法采用Abbott Architect i2000化学发光检测试剂盒检测315份样本的乙型肝炎血清学五项指标后,再用进口(简称"Roche试剂")及国产(简称"国产试剂")乙型肝炎病毒核酸定量试剂盒进行复检,比较两种试剂检测结果的一致性。结果两种试剂定性结果阳性符合率为60.6%(134/221),阴性符合率为100%(94/94),总符合率为72.4%,检测结果差异有统计学意义(P<0.01);无论对HBsAg阳性或阴性样本,Roche试剂的阳性检出率均明显高于国产试剂(P均<0.01),灵敏度为导致二者检测结果产生差异的主要原因;定量结果相关性和一致性分析表明,两种试剂定量检测结果有较好的一致性。结论不同试剂盒检测HBV DNA灵敏度差异较大,本实验国产HBV DNA定量试剂盒灵敏度较低,质量有待提高。     

乙型肝炎病毒X基因DNA竞争子的构建及鉴定

目的构建乙型肝炎病毒X基因DNA(xDNA)竞争子L180,为竞争PCR定量分析xDNA打下基础。方法以扩增的xDNA片段为模板,用引物1434和Lx PCR扩增竞争子DNA,并将扩增产物克隆到pUCm-T载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,酶切鉴定和测序,筛选阳性竞争子质粒,并建立竞争PCR定量分析xDNA的方法。结果所构建xDNA竞争子L180,经测序及PCR定量分析证实,PCR扩增的产物即为目的xDNA。初步建立了竞争PCR定量分析xDNA的方法。结论已成功构建乙肝病毒xDNA竞争子。     

产气荚膜梭菌β_2毒素基因的克隆及定点突变

目的　克隆产气荚膜梭菌 β2 毒素基因 ,并选择可能影响其生物活性的氨基酸的相关碱基位点进行定点突变 ,构建β2 毒素基因的突变体。方法　利用PCR从C型产气荚膜梭菌基因组DNA中 ,扩增出约 0 7kb的基因 ,将其克隆至pGEM T载体上。经GOLDKEY软件分析抗原表位 ,PCR定点突变技术进行 2 34位半胱氨酸→苷氨酸的定点突变。结果　β2 毒素基因核苷酸序列与报道的一致 ,其突变基因 6 99位核苷酸由T→G。结论　已成功克隆了 β2 毒素基因 ,并准确实施了预期定点突变。     

Enhanced Levels of Interleukin-8 Are Associated with Hepatitis B Virus Infection and Resistance to Interferon-Alpha Therapy

The objective of this study was to analyze the expression levels of IL-8 in serum and liver tissues from patients with chronic hepatitis B (CHB) infection and to investigate whether IL-8 may antagonize interferon-alpha (IFN-α) antiviral activity against HBV. IL-8 expression in serum was determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), and fluorescence-based quantitative real-time PCR (RT-qPCR) was used to measure IL-8 mRNA in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in patients with CHB. IL-8 protein expression was detected in liver biopsy tissues by immunohistochemistry. In addition, the differences in serum IL-8 and PBMCs mRNA levels were also observed in patients with different anti-viral responses to IFN-α. Compared to normal controls, serum IL-8 protein and mRNA levels were increased in CHB patients, IL-8 levels were positively correlated with the severity of liver inflammation/fibrosis. Moreover, serum IL-8 protein and mRNA levels were positively correlated with serum alanine aminotransferase (ALT) level and negatively correlated with serum prealbumin (PA) level. IL-8 expression was mainly located in portal area of liver tissues and was increased with the severity of liver inflammation and fibrosis stage. The expression serum and mRNA levels of IL-8 in the CHB patients with a complete response to IFN-α are significantly lower than that of the patients with non-response to IFN-α treatment. It is suggested that IL-8 might play important roles in the pathogenesis of CHB. Moreover, interferon resistance may be related to the up-regulation of IL-8 expression in the patients did not respond to IFN-α treatment.     

重组细胞中鼠细小病毒检测方法的建立及初步应用

目的建立生物技术产品用重组细胞中鼠细小病毒(Murine minute virus,MMV)污染的检测方法,并进行验证及初步应用。方法以NB324K细胞为指示细胞,建立MMV感染性检测方法,并以不同CCID50的MMV分别感染NB324K细胞,验证方法的灵敏度;通过设计针对编码非结构蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)保守序列的引物和探针,建立用于重组细胞中MMV检测的实时荧光定量PCR,并对其线性、特异性、精密性、灵敏度、最低检测限及试验可行性和干扰性进行验证;将NB324K细胞感染试验与荧光定量PCR法相结合,建立NB324K细胞感染-PCR法,并通过对大量样本的检测,分析荧光定量PCR法和NB324K细胞感染-PCR法的可行性。结果 NB324K细胞感染试验的灵敏度为0.2 CCID50;荧光定量PCR检测方法最佳线性范围为1×108～1×104拷贝/μl,R2达0.99以上,特异性良好,与其他种属的细小病毒均无交叉反应,试验内和试验间Ct值的变异系数(CV)均小于5%,试验内病毒定量拷贝数的CV在20%～30%之间,试验间病毒定量拷贝数的CV在20%～50%之间,灵敏度为5×103拷贝/μl,最低感染性病毒颗粒检测限为2 CCID50。该方法能够用于细胞样品中MMV的检测,部分样品基质对病毒的检测具有一定的干扰性。NB324K细胞感染-PCR法的灵敏度为0.02 CCID50,检测时间可缩短为96 h,与荧光定量PCR法分别对47份样品进行检测,结果均为阴性。结论成功建立了MMV荧光定量PCR检测方法和NB324K细胞感染-PCR法,可应用于重组细胞中MMV污染的检测,为进一步提高生产用重组细胞的安全性奠定了基础。     

成骨不全症患者LEPRE1基因突变位点的筛查

目的对COL1A1和COL1A2基因突变检测为阴性的成骨不全症患者进行隐性致病基因LEPRE1的筛查。方法采集成骨不全患者外周血样,提取基因组DNA,PCR扩增LEPRE1基因,直接测序法进行突变检测;采用PolyPhen、Align GVGD和SIFT突变功能预测软件分析突变对蛋白功能的影响。结果检测到1例成骨不全症患者在LEPRE1基因第5号外显子发生碱基GGA>AGA,发现甘氨酸被精氨酸替换的1个杂合突变位点(c.1045G>A,p.Gly349Arg);其母亲和外祖父有相同杂合突变,家庭其他成员和200份健康对照样本未检测到该突变;PolyPhen、Align GVGD和SIFT软件预测结果表明,p.Gly349Arg突变很可能影响蛋白的正常功能。结论 LEPRE1基因c.1045G>A突变很可能是成骨不全症潜在的致病突变位点。     

A Rapid and Specific Real-Time PCR Assay for the Detection of Clinically Relevant Mucorales Species

Infections triggered by filamentous fungi placed in the order Mucorales, phylum Zygomycota, can cause serious harm to immunocompromised patients. Since there is lack of a standardized PCR (polymerase chain reaction) assay for early diagnosis of this fungal infection, this work was aimed to develop a new PCR assay able to detect the presence of Mucorales genera in clinical specimens. Here, we describe a novel diagnostic TaqMan MGB probe assay for precise and rapid detection of the most common clinical species of Mucorales. Zygomycete-specific oligonucleotides were designed to specifically amplify and bind highly conserved sequences of fungal 28S rRNA gene. Additionally, we succeeded in differentiating Mucorales species (i.e., Rhizopus, Lichtheimia, Mucor, and Rhizomucor) in artificially infected serum samples, suggesting that the quantitative capability of this real-time PCR assay could potentially optimize the diagnosis of mucormycosis.     

HBsAg缺失型乙型肝炎病毒复制细胞模型的建立及其对乙型肝炎病毒复制的影响

目的体外构建HBsAg缺失型乙型肝炎病毒(HBV)复制细胞模型,并探讨HBsAg对HBV复制的影响。方法定点突变pch9质粒上HBV 1.1倍体基因S蛋白表达区,构建HBV1.1倍体HBsAg突变质粒,并进行测序鉴定;将鉴定正确的突变质粒瞬时转染HepG2细胞,设未突变pch9质粒转染细胞作为对照,采用ELISA法检测转染72 h的细胞培养上清中HBsAg的表达;Southern blot及Real-time PCR法检测转染72 h的细胞内HBV DNA的复制水平。结果定点突变质粒经测序证实构建正确;突变质粒转染72 h的细胞培养上清中HBsAg A450值为(0.06±0.003),表达呈阴性,对照细胞A450值为(1.82±0.010),表达呈阳性,转染突变质粒72 h的细胞内HBV DNA条带浓度明显高于转染未突变质粒的细胞;转染突变质粒的细胞内HBV DNA绝对拷贝数分别为9.33×106、5.26×106,约为转染未突变质粒(6.91×105)的7.6～13.5倍。结论已成功构建了HBsAg缺失型HBV复制细胞模型,为HBV DNA复制及相关研究提供了实验依据;推测HBsAg是HBV DNA形成的自限性因素,能够负调控HBVDNA复制。     

Combination of MiR-378 and MiR-210 Serum Levels Enables Sensitive Detection of Renal Cell Carcinoma

Serum microRNAs are emerging as a clinically useful tool for early and non-invasive detection of various cancer types including renal cell carcinoma (RCC). Based on our previous results, we performed the study to analyze circulating serum miR-378 and miR-210 in patients with various histological subtypes of RCC. RNA was purified from blood serum samples of 195 RCC patients and 100 healthy controls. The levels of miR-378 and miR-210 in serum were determined absolutely using quantitative real-time PCR. Pre- and postoperative levels of both microRNAs were compared in 20 RCC patients. Significantly increased serum levels of both miR-378 and miR-210 enabled to clearly distinguish RCC patients and healthy controls with 80% sensitivity and 78% specificity if analyzed in combination (p < 0.0001), and their levels significantly decreased in the time period of three months after radical nephrectomy (p < 0.0001). Increased level of miR-378 positively correlates with disease-free survival (p = 0.036) and clinical stage (p = 0.0476). The analysis of serum miR-378 and miR-210 proved their potential to serve as powerful non-invasive diagnostic and prognostic biomarkers in RCC.