灭活病毒诱导牙鲆传代细胞差减cDNA文库的构建及分析

以灭活大鳞鲆弹状病毒诱导的牙鲆(Paralichthys olivaceus)传代细胞作为检测子(tester),正常对照细胞作为驱赶子(driver),分别提取mRNA,逆转录合成双链cDNA。经两轮差减杂交,两轮抑制性PCR扩增后,取正向差减的PCR产物与T载体连接,构建抑制差减cDNA文库,随机挑取7400余个克隆,对其中4200多个克隆进行PCR扩增鉴定,发现近4000个克隆中均含有插入片段,大小在250～1000bps之间,进一步对含有插入片段的近4000个克隆进行了斑点杂交筛选,得到近668个可能含有抗病毒或与免疫相关的阳性克隆。初步的结果表明所建立的差减cDNA文库适合进一步克隆鱼类抗病毒相关新基因。     

水稻小GTP蛋白基因Osrab5B基因的克隆和鉴定

用已知遗传图位的BAC克隆片段,对水稻（Oryza sativa)小穗cDNA文库进行筛选,获得一个水稻小GTP结合蛋白（small GTP-binding protein,SGP)的相关序列,序列测定后以该cDNA序列为基础将４个表达序列标记（EST）进行了电子克隆（electronic cloning),根据电子克隆结果设计引物,利用RT－PCR方法获得了一个水稻（Oryza stiva)中尚未鉴定的cDNA克隆Osrab5B,长1016bp。它与龙船海棠属（Mesembryanthemum crystallinum)和百脉根属（Lotus japonicus)命名为rab5B基因（序列登录号分别是AJ006225和Z73939）有着高度同源性（cDNA核苷酸序列ID值分别大于74％和76％）,同属rab家族的一个新的亚族。进而根据Osrab5B的cDNA序列设计引物,扩增得到Osrab5B的基因组克隆,序列分析表明它至少有7个内含子和8个外显子。     

芦荟耐盐差异表达基因文库的构建

为了弄清景天酸植物芦荟的耐盐、耐旱机理，应用抑制性消减杂交技术，构建了库拉索芦荟的盐诱导组织与正常组织差异表达的cDNA消减文库，并做了初步鉴定。分别从库拉索芦荟的正常叶片组织及高盐诱导叶片组织中提取poly(A)^ RNA，依次合成单链及双链cDNA，酶切成平均大小为400～600bp的片段；将高盐诱导组织eDNA分为两组，分别与两种不同的接头连接，再与正常组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR；获得的产物与T／A载体连接构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增。经检验证明，构建的cDNA消减文库具有很强的消减效率，非特异性cDNA片段被有效地消减，而特异表达的cDNA得到富集。所构建的库拉索芦荟高盐诱导组织cDNA消减文库为进一步大批量筛选、克隆高盐特异性表达的未知新基因奠定了基础。     

条斑紫菜锰超氧化物歧化酶基因克隆与序列分析

为研究紫菜抗逆抗病的分子机制,以本实验室建立的条斑紫菜表达序列标签(EST)和全长cDNA富集文库,结合PCR技术,克隆了条斑紫菜编码锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的cDNA及基因组DNA全长序列,并进行了序列特性相关分析.研究结果表明:该基因cDNA序列全长为958个核苷酸,包含一个完整Mn-SOD基因的ORF,编码224个氨基酸和终止密码子;该基因在基因组中序列长度为1416bp,包含4个外显子和3个内含子,这既不同于高等植物的6个外显子和5个内含子,也不同于人的5个外显子和4个内含子;该基因编码区密码子的平均GC含量为60.9%,第三位密码子的GC含量高达84.9%;序列中包含4个与Mn2 的结合位点及一个保守的金属结合结构域,预测分子量为24469.09Da,等电点为5.99;条斑紫菜Mn-SOD与人的相关蛋白具有类似的空间结构,都有6个跨膜α螺旋结构域;由cDNA序列推导的氨基酸序列与莱茵衣藻相似性为57.7%,系统发生分析表明条斑紫菜Mn-SOD与绿藻莱茵衣藻和硅藻海链藻的亲缘关系较近.这是该基因在红藻门中的首次报道.     

利用生物信息数据库克隆玉米基因PIS2与MFSP全长

利用玉米表达序列标签数据库(dbEST)电子克隆了玉米基因PIS2的cDNA全长,并采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术得到了包含该基因完整开放阅读框(ORF)的cDNA序列;借助水稻非冗余核酸数据库联合应用电子克隆技术和RT-PCR技术克隆得到玉米主易化子超家族蛋白基因MFSP的cDNA全长,并进一步利用植物基因组数据库(PlantGDB)快速地获得了该基因的基因组全长序列.研究证实,充分利用分子生物信息数据库,可以简便地克隆得到玉米目的基因的cDNA乃至基因组全长序列.     

新型皱纹盘鲍防御素hd-def的cDNA序列分析、基因组克隆及表达研究

从构建的皱纹盘鲍肝肾cDNA文库中筛选到了鲍防御素基因EST.通过序列分析发现该基因的全长cDNA序列编码66个氨基酸残基,其前体由信号肽、前导肽和成熟肽组成.该前体的成熟肽含42个氨基酸(6个Cys),推测分子量为4323Da,等电点为8.02.氨基酸序列同源性分析表明,该多肽与昆虫防御素的相似性较高,最高可达70%.因成熟肽二级结构具有典型的昆虫防御素结构特征,该多肽应属于抗菌肽中的昆虫防御素亚家族,是一种新型抗菌肽,将其命名为鲍防御素hd-def.采用基因组步移法获得了全长4032bp的基因组序列.分析表明,该基因由3个内含子和4个外显子编码组成;3个内含子大小分别为497bp、2357bp和528bp,其中两个内含子存在于编码信号肽的序列中.用鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激皱纹盘鲍,能诱导hd-def的表达.实验检测了5种组织,发现hd-def基因仅在肝胰腺中表达,具有明显的组织表达特异性;其表达属于诱导型表达,提示该基因可能参与皱纹盘鲍的抗细菌感染.     

条纹斑竹鲨鱼再生肝组织cDNA质粒文库的构建和鉴定

建立了鲨鱼肝脏的部分切除模型,获得了再生2 4h的鲨鱼肝组织,分离了再生肝组织的总RNA ,纯化了mRNA ,利用含BamHI酶切位点的Oligo(dT) 16 为引物合成cDNA第一链,通过末端转移酶在cDNA第一链3’末端加入Oligo(dC)尾,进而以Oligo(dT) 16 和含HindIII酶切位点的Oligo(dG) 10 为引物,通过LD PCR (long distance PCR)方法合成双链cDNA ,将双链cDNA经BamHI和HindIII双酶切,通过T4 DNA连接酶连接到经相同酶切的pUC19载体后构建成cDNA文库。对文库质量的分析结果表明,通过本方法构建的鲨鱼再生肝组织cDNA文库容量至少为4 .92×10 5个/ μgdscDNA ,重组率达96 .7%。对随机提取30个克隆的质粒进行分析,获得了其中2 5个插入片段的序列,未见重复序列,经与GenBank和dbEST数据库比对分析发现新基因在其中占较大的比例(76 % )。鲨鱼再生肝组织cDNA文库的成功构建为进一步通过差异显示技术筛选、克隆肝再生过程中差异表达的相关功能基因奠定了一个良好的基础。     

牙鲆T细胞抗原受体(TCR)β链同源cDNA的克隆

从牙鲆外周血淋巴细胞cDNA文库中克隆TCRβ1319bp同源cDNA序列并对其基因结构进行生物信息学分析。RT-PCR及其编码区为942bp，编码314个氨基酸，编码区包括V、D、J和C区4个基因片段。TCRVβ片段主要包括从2l—115位氨基酸残基的95个氨基酸序列，Jβ区与哺乳动物的Jβ区高度保守，在位于Vβ和Jβ之间的四区中没有发现8碱基保守序列(GGACAGGG），CDR3β氨基酸序列为GTRILYE。牙鲆TCRCβ片段共有179个氨基酸残基，缺失位于四细胞外区和临近区域的2个5—9氨基酸弹性区域。牙鲆TCRCβ片段的铰链区有6个氨基酸残基，缺少半胱氨酸位点，含Lys^271保守位点。经RT-PCR及检测，在脾、外周血和前肾中都发现TCRβ的表达，肌肉和肝中均未克隆到目的片段。     

斜带石斑鱼生长催乳素基因全长cDNA的克隆、表达及其免疫荧光分析

我们从斜带石斑鱼垂体的SMART cDNA质粒文库中筛选到生长催乳素基因(so-matolactin,SL)的全长cDNA片段,其编码区为1644bp,编码231个氨基酸,其中N-端的24个氨基酸肽段为信号肽。运用RT-PCR技术考察了其在石斑鱼不同组织中的mRNA的转录水平,结果表明,该基因在垂体中大量转录,在其他组织中几乎检测不到转录本的存在。选取基因开放阅读框的核苷酸序列插入pGEX-KG载体进行原核表达,在大肠杆菌中表达的融合蛋白的分子量约为50kDa,并以表达的产物为抗原免疫家兔制备了多克隆抗体。采用冰冻切片和FITC标记的荧光染色方法将SL基因初步定位于脑垂体中部,沿着神经组织边缘分布。本研究为深入研究石斑鱼的生长激素／催乳激素家族的进化关系及SL基因的功能奠定了基础。     

真鲷肌肉生长抑素(MSTN)基因的克隆及表达分析

采用同源克隆的策略,设计了3对引物,首次分离、克隆了2820bp的真鲷肌肉生长抑素(MSTN)基因组序列,该序列在GenBank上注册(注册登录号为AY965686).经过剪接、比较,分析了真鲷MSTN基因的序列和结构特征.真鲷的MSTN基因具有3个外显子、2个内含子,整个开放阅读框编码着384个氨基酸,第1个外显子上有一个连续11个Q氨基酸的残基,C-末端具有9个保守的半胱氨基酸及一个RVRR的蛋白酶解加工位点.在第1、第2内含子和3'非翻译区上分别具有一个微卫星重复序列.RT-PCR分析表明,MSTN基因在真鲷不同组织中都有表达,但表达量具有明显的差异;MSTN在肌肉中表达量最高,其次是脑、小肠、头肾、鳃和性腺,心脏、眼睛、肝脏中只有极少量表达,脾脏中没有检测到MSTN的表达.     

小麦与高冰草体细胞杂种耐盐新品系的盐胁迫应答cDNA差异表达分析

用银染DDRT-PCR技术分析了小麦济南177和小麦与高冰草体细胞杂种耐盐品系杂3号在盐胁迫前后基因的差异表达情况。并通过反向Northern杂交筛选,获得27个阳性片段。从中选出10个候选片段进行序列分析,这些序列信息表明,其表达与盐胁迫应答有一定关系。Northern杂交验证了差异片段wrsi-1在耐盐品系杂3号的根中受盐诱导,可能为胁迫早期应答基因。     

抗稻瘟病新基因pi-hit-1的克隆与功能研究

采用差异显示法(DD-PCR)寻找易感稻瘟病的突变品系与野生型对照品系中的差异表达基因。结果发现与野生型对照相比,Rubisco小亚基、pi-hit．1(AF450251)和pi-hit-2(AF448491)基因在易感稻瘟病的突变品系中高表达,pi-hit-1和pi-hit-2是功能未知的新基因。进一步采用电子克隆和RT-PCR方法克隆了pi-hit-1基因的全长eDNA(AF514859),该基因编码的蛋白质属于ATP依赖的Clp蛋白酶家族。分析pi-hit-1基因的组织特异性表达发现,此基因在叶片组织特异表达。进一步设计接种诱导实验研究pi-hit-1基因表达与水稻稻瘟病易感性的关系。在易感稻瘟病的突变品系中pi-hit-1受稻瘟病菌诱导,接种后其表达量明显升高,而野生型对照品系pi-hit-1基因表达在接种前后无明显变化。比较易感稻瘟病的突变品系与对照品系pi-hit-1基因序列差异发现,稻瘟病敏感品系中pi-hit-1基因第一外显子发生缺失突变使pi-hit-1蛋白功能缺失,导致突变品系易感稻瘟病。这些实验结果提示野生型pi-hit-1是稻瘟病抗性基因。     

mRNA差异显示阳性cDNA克隆的快速筛选与鉴定

建立了一种快速筛选差异显示阳性ｃＤＮＡ克隆的方法,该方法利用两轮ＲｅｖｅｒｓｅＮｏｒｔｈｅｒｎ杂交,结合质粒酶切图谱分析,从３０个ＤＤＲＴ差异ｃＤＮＡ片段中筛选鉴定出两个阳性ｃＤＮＡ克隆,对其中一个克隆进行的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析证实了筛选方法的可靠性。     

单向锚定PCR富集扩增在克隆低丰度基因转录本中的应用

利用国际生物信息资源，通过计算机检索寻找与已知功能基因具有高度同源的ＥＳＴｓ，据此设计特异的ＰＣＲ扩增引物，并通过单侧特异引物搭配ｃＤＮＡ分子库载体引物（锚定引物），在低严紧条件下扩增各种组织的ｃＤＮＡ分子库以富集目标片段。继以单向锚定ＰＣＲ扩增产物为模板，用双侧特异引物再次扩增，获得的特异扩增ＰＣＲ产物经测序证实之后，将其用作探针杂交筛选相应的ｃＤＮＡ文库并进而克隆目的基因的全长ｃＤ－ＮＡ。此方法用于三个人类新基因的全长ｃＤＮＡ的分离与克隆，结果全部获得成功。这三个人类新基因分别是Ｈ－ＲａｌＧＤＳ基因、Ｈ－ＣＩＳ基因和Ｈ－Ｓ６ＰＫ基因，它们在ＧｅｎＢａｎｋ数据库的登录号分别是：ＡＦ０２７１６９、ＡＦ０３５９４６及ＡＦ０３７４４７。本文结果提示这一方法对于应用现有的人类基因组生物信息资源，克隆具有重要生物学功能的人类新基因，尤其是克隆呈低丰度的基因转录本全长序列具有较高的实用价值。     

人血小板生成素（hTPO）的cDNA克隆与序列测定

由于人血小板生成素ｃＤＮＡ的阅读框架较长而且序列中无合适的酶切位点，因此，我们利用一个同义突变创造的ＫｐｎＩ酶切位点人为将ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ分成Ｎ－端和Ｃ－端两个片段。首先利用反转录聚合酶链式反应从人胎肝ｍＲＮＡ中分别扩增出两个ｃＤＮＡ片段，于ＥｃｏＲＩ，ＫｐｎＩ位点分别克隆入测序载体ｐＵＣ１９中。     

快速cDNA文库筛选和淀粉合成酶基因的分离与鉴定

建立了一种以PCR为基础的快速筛选cDNA文库的方法。该方法利用96孔板和一对特异的引物,逐级从cDNA文加筛选目标克隆,最终获得目标DNA片段。与同位素杂交筛选方法相比,该方法具有快速、简单、省时等优点,数日内即完成目标片段的克隆;同时,还可极大地降低实验费用,且无需使用同位素。本文利用这一方法从水稻南粳隆;同时,还可极大地降低实验费用,且无需使用同位素。本文利用这一方法从水稻南粳隆;同时,还可极大地降低实验费用,且无需使用同位素。本文利用这一方法从水稻南粳37未成熟种子的cDNA文加筛选出了完整的水稻可溶性淀偻合酶基因cDNA序列。我们认为此方法对于筛选其他类型文库同样有借鉴意义。     

四种生物质废弃物环氧树脂的合成及表征

分别以四种生物质废弃物———木粉、榛子壳、稻草和玉米秆苯酚液化物为原料,与环氧氯丙烷反应,制备出以四种生物质液化物为基材的环氧树脂,采用凝胶渗透色谱(GPC)对比分析了四种生物质液化物及其环氧树脂的相对分子量分布。以聚酰胺(PA-650)为固化剂进行固化,并利用热失重分析(TGA)、差热分析(DSC)和剪切强度测试等手段对固化物的热力学性能进行了测试。结果表明,木粉液化物及其树脂的-Mw和-Mn最高分别为532、759和249、308,木粉基树脂胶粘剂的剪切强度最大为5.7MPa,且它的热稳定性最好。     

用含水冷冻电镜技术测定的水稻矮缩病毒的三维结构

用含水冷冻电镜技术和计算机数据处理方法分别测定了水稻矮缩病毒（ＲＤＶ）完整颗粒和只含内壳层的颗粒的三维结构，其分辨率分别为２．６ｎｍ和３．３ｎｍ。从完整颗粒的结构中可以清晰地看到它的外层和内壳层的双层结构及其内部的ＲＮＡ或非结构蛋白质的电子密度。完整颗粒和内壳层的直径分别为６９．８ｎｍ和５４．０ｎｍ，外壳层和内壳层的厚度分别为６．９ｎｍ和２．５ｎｍ。外壳层表面的三角形剖分数Ｔ＝１３。外壳层由２６０