北部湾茅尾海副溶血性弧菌的分离鉴定与致病性分析

为解析北部湾海域及水产品中副溶血性弧菌的多样性特征与安全风险,本研究采集了北部湾茅尾海养殖区域海水和水产经济动物样品,利用硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(TCBS)对所采样品进行海洋弧菌的分离和纯化,共分离获得109株疑似弧菌菌株。通过16S rDNA和特异功能基因toxR的PCR扩增并测序鉴定,共检出副溶血性弧菌20株,检出率为18.3%。此外,通过系统发育分析还发现副溶血性弧菌的toxR和tdh基因序列都存在水平基因转移现象,呈现出较大的多样性。对20个副溶血性弧菌菌株的毒力基因tdh进行分析,结果表明有4株携带了tdh毒力基因,检出率为20%,易引起食物中毒,对公共卫生造成的威胁较大。因此,本研究建议采用PCR技术开展副溶血性弧菌特异种属基因和毒力基因检测,准确评估北部湾区域海水及其水产品的卫生安全性,降低爆发水产养殖业病害和食源性疾病的风险。     

肉骨粉中沙门氏菌及副溶血性弧菌的分离与鉴定

采用传统生化鉴定及血清学方法,联合半自动细菌鉴定仪及噬菌体方法,从FEPAS测试样品肉骨粉中成功分离鉴定出沙门氏菌和副溶血性弧菌,并结合食品微生物学检验实践,对分离鉴定过程进行了总结分析。     

PCR-焦磷酸测序检测副溶血性弧菌研究

目的：建立用DNA碱基序列检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP )的方法。方法：根据副溶血性弧菌toxR基因设计扩增引物和测序引物,先用PCR特异性地扩增目的片段,再制备单链模版在测序引物引导下用焦磷酸测序法检测DNA碱基序列,检测的序列为CCAA GGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTTT,则判断为副溶血性弧菌。结果：扩增引物和测序引物表现出良好的特异性,PCR扩增结果,20株VP均扩增出大小137bp的DNA片段,而创伤弧菌等对照菌株未扩增出DNA条带。焦磷酸测序结果,20株副溶血性弧菌均测出与预期相符的DNA碱基序列,而其他对照菌株未测出DNA 碱基序列或检测结果与测序引物后的序列不匹配。VP标准菌株ATCC 17802试验菌株发生A-T突变,密码子CCU变成CCA,而两个密码子都是脯氨酸的密码子。结论：建立的方法特异性高, 整个试验可在21h-27h完成,是快速检测VP有效手段。     

副溶血性弧菌鉴定能力验证样品的制备

目的 研制适用于副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus,VP)能力验证(PT)项目的VP菌及干扰菌的冷冻干燥样品,建立有效的样品制备与评估流程.方法 通过不同比例混匀的VP和干扰菌拟态弧菌(Vibrio minicus,VM)经冻干后在鉴定培养基上菌落生长优势比,确定制备PT样品的混合菌VP和VM的浓度比例;通过系统抽样和鉴定以评估样品的均一性;通过观察样品在180 d保存期内菌量的变化情况以评估样品的稳定性;根据188间检测实验室反馈的鏊定结果以评估和计算样品的实际合格率.结果 选择5 000:1比例制备的VP和VM混合PT样品能在鉴定培养基有效分离两种菌落;抽检的40份样品均能有效鉴定,显示PT样品具有较好的一致性;通过保存温度和时间的稳定性实验显示,PT样品在36℃下能稳定保存5d,冻干后PT样品于4℃保存180 d后VP菌仍能检出;188家参与实验室检测结果显示,PT样品合格率为97.3％.结论 本研究制备的冻干PT样品及实验流程控制适用于副溶血性弧菌及类似的微生物鉴定能力验证项目.     

水产品、环境及临床副溶血性弧菌分离株几个主要生化指标的差异

比较了3 种不同来源的副溶血性弧菌的溶血实验、脲酶实验、枸橼酸盐利用实验和阿拉伯糖利用实验4 种生化性状,临床分离株的溶血实验阳性率最高,超过90%,水中分离株接近80%,食品分离株不足50%;临床分离株的脲酶实验阳性率接近10%,其它2 种来源的副溶血性弧菌未发现阳性菌株;临床分离株和水中分离株枸橼酸盐利用实验的阳性率均超过90%,食品分离株仅达到70%;临床分离株和食品分离株阿拉伯糖利用实验的阳性率在90%左右,水中分离株为80%.     

水产品、环境及临床副溶血性弧菌分离株几个主要生化指标的差异

比较了3种不同来源的副溶血性弧菌的溶血实验、脲酶实验、枸橼酸盐利用实验和阿拉伯糖利用实验4种生化性状,临床分离株的溶血实验阳性率最高,超过90%,水中分离株接近80%,食品分离株不足50%;临床分离株的脲酶实验阳性率接近10%,其它2种来源的副溶血性弧菌未发现阳性菌株;临床分离株和水中分离株枸橼酸盐利用实验的阳性率均超过90%,食品分离株仅达到70%;临床分离株和食品分离株阿拉伯糖利用实验的阳性率在90%左右,水中分离株为80%。      

一起副溶血性弧菌食物中毒分离株的特征分析

目的 分析2017年广州市一起副溶血性弧菌食物中毒分离株的特征.方法 采用血清型鉴定,药敏实验,毒力基因(tdh、trh、tlh)、toxRS/new基因、orf8基因的聚合酶链式反应(PCR)检测,脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)进行分析.结果 14株副溶血性弧菌血清型鉴定为O8∶K21,药敏试...     

基于特异性基因的副溶血性弧菌快速分离鉴定

副溶血性弧茵(Vibrio parahaemolyticus)是海洋环境中常见的食源性致病菌.采用自行设计的改良初筛方案结合tlh、toxR这2种特异性基因的2次筛选开发了一种副溶血性狐菌的快速分离鉴定方法.应用该法从海水、海泥及3种海产品中分离得到了19株副溶血性孤菌,再经16S rDNA测序对分离鉴定结果的特异性进...     

实时荧光PCR方法检测副溶血性弧菌的研究

建立了一种快速检测副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus,VP）的荧光PCR（Real time polymerase chain re-action）方法。首先,从GenBank中获得副溶血性弧菌种特异性基因不耐热溶血毒素基因tl和直接耐热溶血素毒素基因tdh,用Primer Express2.0设计引物和Taqman荧光探针,在Roche荧光PCR上进行荧光PCR扩增,荧光曲线表明该荧光PCR可特异性地检测副溶血性弧菌,而大肠杆菌等其他14种细菌和空白对照都是阴性;检测方法灵敏度达10cfu/reaction。本研究建立的荧光PCR检测副溶血性弧菌的方法快速、特异性强,灵敏度高,稳定性好,可检测出总的和带tdh毒力基因的副溶血性弧菌,适合于大批量样品的检验,可广泛用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

副溶血性弧菌16S rRNA基因序列变异规律分析

通过对副溶血性弧菌16S r RNA基因序列进行深度分析,研究其序列变异特点,为开发新的分型溯源靶点奠定基础。对111株分离自生鲜水产品的副溶血性弧菌16S r RNA基因测序,与Gen Bank中已有的副溶血性弧菌16S r RNA基因标准序列比对分析,对变异度比较大的序列建立了系统发育树,深入分析了基因的变异规律,并使用ERIC-PCR方法加以验证。不同副溶血性弧菌菌株16S r RNA基因变异主要集中在可变区V1和V2区,50~270 bp的区域内有38个碱基的相似度小于30%,103个碱基的相似度在30%~100%。另外,在V3区和V8区也各有1个碱基有比较明显的差异。副溶血性弧菌16S r RNA基因序列具有一定的变异性,该结果为副溶血性弧菌菌株分型溯源分析提供新的靶点奠定研究基础,同时为其微进化研究奠定理论基础。     

牦蛎食品中副溶性弧菌的分离与鉴定

从出口水产食品牦蛎样品中检测副溶血性弧菌.应用细菌形态学观察、嗜盐性试验、细胞色素氧化酶试验、靛基质试验、赖氨酸脱羧酶试验、精氨酸双水解酶试验、V-P试验、蔗糖分解试验、O/F试验等鉴定疑似副溶血性弧菌菌株.结果表明经相关试验证明,从牦蛎样品分离出的菌株为副溶血性弧菌.结论从水产食品牦蛎中分离出2株副溶血性弧菌.     

副溶血性弧菌拮抗菌的筛选鉴定及抑菌物质特性研究

为获取既可抑制食源性致病菌又可抑制水产致病菌的益生菌株,以人畜共患致病菌副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus ATCC17802)为指示菌,采用点种法初筛以及打孔扩散法复筛,得到1株来源于上海东海海水的H19菌株,其抑菌物抑菌圈直径达(17.16±0.28)mm。通过形态观察及16SrDNA序列分析可知,菌株H19为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis H19,GenBank登录号:MG383451)。将菌株H19进行抑菌谱试验,探究菌株H19抑菌物的理化性质,并且抑菌物通过硫酸铵沉淀及不同孔径透析袋截留粗提,粗提物经蛋白酶处理及Tricine-SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳可知,该抑菌物具有广谱抑菌活性,既可抑制革兰氏阳性菌又可抑制大部分革兰氏阴性菌,且具有较好的热、pH以及紫外线稳定性,该抑菌物可能为2种新型抗菌肽,分子量分别在6.5~9.5kDa以及27.0~35.0kDa。由此可见,枯草芽孢杆菌H19所产抗菌肽具有防治食源性疾病以及水产疾病的应用潜力。     

副溶血弧菌的磁珠捕获及检测

建立结合免疫磁珠和PCR快速检测副溶血性弧菌的新方法。本研究选用副溶血弧菌作为抗原免疫日本大耳兔制备了多克隆抗体,用ELISA法检测抗体效价。利用辛酸硫酸铵沉淀结合逆向吸附对多抗血清进行纯化,经SDS-PAGE和斑点杂交检测验证纯化后抗体的特异性。将纯化后的抗体偶联于羧基化修饰的纳米磁珠表面,用来进行菌体的捕获。结果表明,抗体的效价达到106,纯化获得只与副溶血弧菌发生反应的高纯度抗体。制备的免疫磁珠捕获率在55%～70%之间,且稳定性较好,盐离子浓度（3.5%NaCl、4.5%NaCl）对捕获率的影响不大,在pH5～9之间,磁珠捕获差异也较小。在对纯培养物的检测实验中,本方法最低检测限为102cfu/mL;而在鱼肉糜样本中的检测限为103cfu/mL,且样品中高浓度杂菌的存在不影响检测灵敏度。免疫磁珠结合PCR用于副溶血性弧菌的检测具有很高的灵敏度和特异性,具有广阔的前景。      

纳豆菌的分离、鉴定及其副溶血弧菌拮抗作用

从纳豆和纳豆菌制剂中分离、纯化得到9个芽孢杆菌菌株,经生理生化实验鉴定其中6株为纳豆芽孢杆菌。首先采用琼脂扩散法研究纳豆菌在不同温度（37、32、28℃）和不同发酵时间（12、24、36、48h）的发酵液对副溶血弧菌的拮抗作用。然后,选择优势菌株BN-5在28℃时与副溶血弧菌共培养,以研究纳豆菌对副溶血弧菌生长的影响。结果表明,37℃纳豆菌发酵液均有明显抑菌效果,抑菌效果随发酵温度的降低和发酵时间的延长而迅速减弱;纳豆菌初始浓度/副溶血弧菌初始浓度≥100时,在24h以内可以有效抑制弧菌生长。      

亚致死热损伤和复苏状态的副溶血性弧菌特性

目的:研究副溶血性弧菌亚致死损伤和复苏后的生长特性和蛋白质、核酸损伤情况,并观察损伤后细菌的形态特征,检测损伤和复苏菌株的生理生化特性和致病基因。方法:对副溶血性弧菌VpBJ1.1616和VpBJ1.1997的亚致死热损伤和复苏后菌株的生长曲线进行测定,菌液离心后上清液测定OD260nm和OD280nm用以检测核酸和蛋白质流失情况,扫描电镜观察各状态下细菌的形态特征,并对正常状态、亚致死损伤状态和复苏后的副溶血性弧菌进行了生理生化和致病基因的检测。结果:损伤后的菌株迟滞期长、核酸蛋白质流失与正常细菌有显著差异(p<0.05),而复苏与正常菌株生长情况相近,且VpBJ1.1616的核酸蛋白质物质流失与正常细菌没有明显差异(p>0.05)。损伤的副溶血性弧菌表面有明显地破损,某些生理生化特性发生了不可逆的改变,但是致病基因与正常菌株基本相同。结论:通过对损伤和复苏后各种特性的检测,为研究副溶血性弧菌亚致死损伤状态和食品安全控制提供理论依据。      

双重DPO-PCR检测副溶血弧菌和霍乱弧菌

根据副溶血弧菌collagenase基因和霍乱弧菌omp W基因,分别设计特异性DPO（dual priming oligonucleotide）引物,建立一种快速检测这两种弧菌的多重DPO-PCR方法,并对其特异性和灵敏度进行了评价。结果显示,设计的DPO引物特异性较强,副溶血弧菌和霍乱弧菌DNA可分别扩增出307 bp与463 bp的特异性条带,检测灵敏度均达0.1 ng/μL。该检测方法对退火温度不敏感。利用该方法对69株疑似弧菌菌株进行鉴定,结果与生理生化鉴定结果一致。该方法特异性强、灵敏度高,适合于对食品、水产品等中副溶血弧菌和霍乱弧菌的进行快速筛检。      

同时检测海产品中副溶血弧菌和霍乱弧菌的合检方法评价研究

目的建立水产品中副溶血弧菌和霍乱弧菌合检方法,并对合检方法对比进行评价。方法利用副溶血弧菌和霍乱弧菌阳性菌株,制备纯菌液、不同浓度梯度的人工污染样品。通过对30份纯菌液、30份人工污染样品和250份实际样品的检测,将建立的合检方法与行业标准(SN/T 1022-2010进出口食品中霍乱弧菌检验方法和SN/T 0173-2010进出口食品中副溶血性弧菌检验方法)进行比较,对合检方法进行效果评价。结果实验结果表明副溶血弧菌和霍乱弧菌合检方法,与行业标准检测结果完全一致。结论该方法可靠,对实验仪器和操作人员的要求低,具有良好的实用性,适合基础检测实验室。     

副溶血性弧菌噬菌体的分离及其在即食虾中的应用

为了研究噬菌体作为天然生物防控剂应用于食品中的前景,本实验从水产品市场的污水中采用双层平板法分离纯化出一株烈性副溶血性弧菌噬菌体SHOU24,测定其生理特性,并探讨其在即食虾中的抑菌效果。结果表明:该噬菌体只对含有毒力基因tdh的副溶血性弧菌有裂解能力。电镜观察其形态表明该噬菌体属于长尾噬菌体科。SHOU24的最适p H为7~8。在50℃温度以下,存活率很高。抑菌实验结果表明该噬菌体在常温条件下对即食虾中副溶血性弧菌的生长具有良好的抑制作用,能使副溶血性弧菌的菌浓度下降1log CFU/g。本研究为副溶血性弧菌噬菌体SHOU24作为抑菌剂应用于食品中提供了一定的理论基础。