三维超分辨显微成像技术的研究进展及展望

超分辨显微成像技术是细胞生物学中研究细胞器结构、相互作用和蛋白质功能的强大工具,其具有突破光学衍射极限的分辨能力,从纳米尺度上为细胞生物学提供了新的分析手段,对生命科学相关领域具有重大意义.然而,受衍射极限的影响,超分辨显微镜的轴向分辨率相比于横向分辨率要更难以提高,这导致实现细胞结构亚百纳米分辨率的三维成像更为困难.从受激辐射损耗显微术和单分子定位显微术这两种主流技术出发,对目前存在的多种三维成像技术进行了原理介绍和特点分析,最后对其未来发展方向进行了展望.     

基于和频效应和环形光的超分辨红外显微成像方法

提出了一种结合和频效应和环形光照明的远场超分辨红外显微成像方法。红外光、不同频率的环形和高斯可见光同时共轴激发样品,当红外光频率等于样品分子某一共振频率时,样品分子吸收红外光到达振动激发态,环形和高斯可见光与共振分子作用分别产生无效和有效的和频信号。利用三束光的矢量光场表达式和模型能级系统的速率方程进行数值模拟发现,当总可见光足够强时,可使总和频信号饱和,环形和高斯可见光与共振分子的作用出现竞争,通过提高环形可见光光子流密度超过饱和光子流密度,并降低高斯可见光光子流密度,可有效地抑制环形区域有效和频信号的产生,从而达到压缩PSF的目的,在物镜数值孔径0.6的情况下,通过数值模拟得到有效和频信号PSF半高宽为56 nm。     

超分辨显微成像技术在细胞器相互作用研究中的应用（特邀）

观察细胞器间动态相互作用,深入分析作用规律,对于揭示生理病理过程现象背后的机制具有十分重要的意义。传统光学显微镜受到由光波波长和孔径造成的衍射极限的限制,无法观测细胞器纳米级精细结构及细胞器间相互作用的动态变化规律。超分辨显微成像技术的出现为细胞器相互作用研究提供了重要手段,在深入揭示细胞器相互作用规律,阐明生理病理现象深层的机制研究中发挥了重要的作用。文中介绍了受激发射损耗（Stimulated emission depletion, STED）显微成像、结构光照明显微成像（Structured illumination microscopy, SIM）、单分子定位显微成像（Single molecule localization microscopy, SMLM）技术,并总结了这三类超分辨显微成像技术在细胞器相互作用中的应用与现状,为超分辨显微成像技术在细胞器相互作用研究中的应用提供思路拓展。最后,对超分辨显微成像技术在细胞器相互作用研究中的优势与不足进行分析总结,展望了超分辨显微成像技术在活细胞内细胞器相互作用成像中的需求发展趋势,为光学与医学及生物学的交叉融合发展提供一定的参考。     

蛋白酶荧光探针及新型显微成像技术的生物医学应用

研究上正常生理条件蛋白酶的活化情况仍然存在很多困难,将蛋白酶荧光探针技术和基于各种光学平台的显微成像技术有机地结合起来,可以最大限度地记录活细胞生理条件下蛋白酶活性变化的时空信息.综述了蛋白酶荧光探针技术及其与该类探针应用相关的新型显微成像技术在生物医学光子学领域的应用进展.     

无衍射光束在生物显微成像中的应用

无衍射光束近年来广受关注，其无衍射、自修复和自加速的传播特性在微观成像应用中显示出潜在的优势。无衍射特性可抑制光束在传播过程中的衍射，有助于提升成像的分辨率。自修复特性可使光束在透过强散射介质后快速恢复波前，提高成像景深和信噪比。自加速特性可增加光场信息的有效探测维度，实现多维重构成像。本综述结合几类生物显微成像技术特点，介绍以贝塞尔光束、艾里光束为代表的无衍射光束在高分辨生物显微成像中的应用研究进展。     

基于金刚石NV色心的超分辨成像技术北大核心CSCD

光学显微镜的出现为细胞等微观结构的研究打开了新的大门,然而衍射极限的限制使得更加精细的结构难以探测。近年来,一些充满创造性的方法突破了衍射极限,达到纳米级分辨率。氮-空位(NV)色心是金刚石中一种常见的发光缺陷,由于其具有明亮而稳定的发光性质和较长的电子自旋相干时间而被广泛应用于量子计算与量子测量中;同时,NV色心在超分辨成像技术中也发挥着巨大作用,通过与各种超分辨成像显微镜的结合,实现了对NV色心的纳米级分辨率成像,而且进一步实现高空间分辨率的量子传感。本文简单介绍了NV色心的结构与性质,以及各类成像技术的基本原理;对NV色心与超分辨成像结合的各项技术实验成果进行了归纳与比较,并对其应用进行了总结与展望。     

单分子三维取向超分辨成像技术进展（特邀）

超分辨显微成像技术自诞生以来,凭借其优异的纳米级空间分辨率,已成为生命科学研究中精准揭示复杂生命现象的重要成像技术。其中,基于单分子定位的超分辨成像策略,使得定位、观察、研究单个探针分子独特的理、化、光学性能成为可能。偏振作为荧光信号的一个重要特性,近年来伴随着单分子三维取向成像技术的发展,逐步在单分子成像和超分辨领域中展示出诸多新颖且重要的应用特性。本文总结了单分子三维取向超分辨成像技术的最新进展,介绍并分析了两类主要的单分子三维取向荧光显微技术——基于荧光吸收与辐射偏振调制的单分子三维取向成像方法以及利用点扩散函数工程将单个荧光分子的三维取向信息编码到荧光图像上的成像策略。此外,还探讨了应用于活细胞或单颗粒的其他类型的超分辨取向成像技术。最后,针对单分子三维取向超分辨成像技术发展与应用前景面临的挑战,进行了总结与展望。     

超分辨荧光显微镜中的解卷积技术及应用（特邀）

超分辨荧光显微镜突破了光学衍射极限造成的空间分辨率限制,使得生物学家能够在生命体和细胞具有活性的状态下,对其功能与结构进行高精度动态记录,有望揭示更多重要的生命现象细节。然而,由于超分辨荧光显微技术的成像视场、深度、分辨率、速度等不易兼得,所以解卷积作为一种最有效且直接的求解逆问题的框架,被广泛应用于增强超分辨显微镜的时空分辨率。研究人员聚焦于通过相应算法设计实现高质量显微图像的重建,在一定程度上克服了超分辨荧光显微镜的硬件限制,可以更好地恢复生物信息。本文首先介绍了解卷积方法的基本原理及其发展历程,接着列举了不同解卷积技术在不同模态下的重建原理和效果以及这些技术在生物学上的应用,最后总结了基于深度学习的解卷积方法在超分辨荧光显微镜技术上的最新进展和未来的发展潜力,并对包括傅里叶环相关的定量评估图像重建质量的方法的最新进展进行了阐述。     

超分辨成像方法研究现状与进展

光电成像系统受到衍射极限和像元分辨率的制约,但研究者们从未停止过脚步来突破这一限制。本文介绍了近年来开展的各种超分辨成像方法和技术,包括应用于荧光显微成像的受激发射损耗技术、结构光照明技术、光激活定位技术与随机光学重构超分辨成像技术;可应用于显微系统、光存储与眼底成像的光瞳滤波技术与径向偏振光超分辨聚焦技术;应用于空间探测的合成孔径技术、光子筛成像技术、超振荡透镜技术、亚像元技术与焦平面编码技术。主要讨论了以上超分辨方法的原理、实现手段与目前发展水平。     

基于结构照明的超分辨荧光显微成像重建算法

由于具有低光毒性、高速宽视场以及多通道三维超分辨成像能力,超分辨结构照明显微术(SR-SIM)特别适合用于活细胞中动态精细结构的实时检测研究。超分辨结构照明显微图像重建算法(SIM-RA)对SR-SIM的成像质量具有决定性影响。本文首先简要介绍了超分辨显微术的发展现状,阐述了研究SR-SIM图像重建算法的必要性;然后介绍了SR-SIM的成像原理,并重点介绍了SR-SIM图像重建算法,包括SR-SIM中频繁使用的去卷积重建算法、SR-SIM校准与重建过程中参数值获取的算法,以及目前发展的超分辨结构照明显微图像重建算法,并介绍了SR-SIM工具箱;最后总结了当前发展超分辨结构照明显微图像重建算法需解决的5个问题。     

超分辨成像中荧光分子定位算法性能比较

超分辨成像已成为活细胞结构和功能成像的关键工具,荧光分子定位是超分辨成像过程中不可缺少的步骤。从超分辨成像角度研究各种荧光分子定位算法性能具有重要的意义。选择5种典型的荧光分子定位算法:质心法、广义质心法、高斯拟合、解线性方程组和极大似然法,以定位精度和定位时间来评价所选择算法的性能。结果表明,1)高斯拟合、极大似然法和广义质心法能高精度对荧光分子定位,不受荧光分子所在子区域提取的影响;2)质心法和解线性方程组法能应用于图像在线分析,但定位精度较低,受子区域提取影响较大;3)当两个荧光分子位于一个衍射斑时,采用这5种算法的定位精度都会急剧下降。     

亚20nm荧光超分辨显微技术研究进展（特邀）

荧光超分辨显微技术自20世纪90年代诞生以来,经历了多代创新与发展,其空间分辨率已经远超衍射极限,横向分辨率能够达20 nm以下,可以实现分子尺度的生物成像与动态追踪。新一代超高分辨率显微技术的产生得益于传统超分辨技术的深度发展和结合创新。详细介绍横向分辨率在亚20 nm尺度的新一代荧光超分辨显微技术,并阐述其与传统超分辨原理的联系与区别。此外,针对分辨率的限制因素,就光学系统、扫描策略和样品制备等方面进行探讨,并展望高分辨率荧光显微技术在生物医学领域中的应用前景和发展方向。     

超分辨光学显微成像的新武器——镧系离子掺杂上转换纳米荧光探针（特邀）

超分辨荧光成像技术因其能够突破光学衍射极限的限制,为生命科学研究带来全新的观察尺度而获得了诺贝尔化学奖。但是,传统的超分辨荧光显微镜需要极为复杂的光学系统来突破衍射极限,通常伴随着明显的光毒性和低时间分辨率,昂贵的造价以及日益复杂的操作限制了其在生物医学领域中的推广应用。因此,全球各大研究团队都在积极寻求具有近红外、高亮度和抗光漂白的替代荧光探针,并通过改善成像装置与算法,进一步拓展超分辨显微技术的应用范围。稀土元素纳米材料由于其独特而优异的物理化学特性,如显著的反斯托克斯光谱位移、无背景噪声、抗光漂白、光稳定性、低毒性和高成像穿透能力等,持续受到化学、物理学和材料学领域的广泛关注,是近期兴起的一种稳定性优异的无机荧光探针。本文首先简要介绍了上转换纳米颗粒的发光机制,然后讨论了纳米结构材料中实现光子上转换的主要限制。此外还介绍了镧系元素掺杂上转换纳米粒子在超分辨生物成像、分子检测等领域的应用,以及介绍了包括降低激光功率要求和耦合技术难度、提高激光直扫成像分辨率与速度、提高多路复用成像效率等应用技术优势。最后重点介绍了颗粒合成方面的主要挑战、可行的改进措施以及对未来发展的展望,为稀土纳米...     

光片荧光显微成像技术的发展及应用（特邀）

近几十年来,光片荧光显微镜作为荧光显微技术的一种革新,显著提升了生命科学研究中对组织与细胞结构和功能的高时空分辨率成像能力。相较于传统的落射荧光显微技术,光片显微镜通过选择性逐层照明生物样本,大大提高了光子利用效率,降低了光毒性,并显著提升了成像速度。光片显微镜问世以来,其在生命科学研究中的应用范围逐渐拓宽,从胚胎学、神经科学到肿瘤研究等多个领域均有所涉及,不仅可用于观察细胞和组织的基本结构,还可用于实时监测生物过程中的动态变化。同时,其跨尺度的特点使其适用于从宏观到微观的多个尺度上的观察。本文综述了光片显微镜在高通量成像、超分辨成像以及易用性方面的应用及发展,旨在为生命科学研究人员提供全面的了解和参考,推动光片显微镜在更多领域的应用和发展。     

受激辐射损耗超分辨成像技术研究

受激辐射损耗显微成像(STED)是一种超分辨荧光显微成像技术,它能够突破传统光学衍射极限的限制,把远场光学分辨率提高到百纳米以内,被广泛应用于生物医学等领域,是目前光学显微成像领域研究的热点之一。采用了一种基于超连续谱皮秒脉冲白激光光源的STED显微系统,实现超分辨成像。并从精密合束、脉冲延迟和损耗光残留光强几个方面探讨系统优化,从而获得最佳的成像效果。对直径约25 nm荧光微球成像实验的数据表明:该系统成像分辨率可达约60 nm,分辨能力远远高于衍射极限。另外,系统成功实现了对核孔复合物、微管和微丝等一系列生物样品的超分辨成像,共聚焦成像中某些模糊不清的结构在STED成像中清晰可辨。