代谢工程改造大肠杆菌发酵生产β-烟酰胺单核苷酸

为实现大肠杆菌高效生产β-烟酰胺单核苷酸（β-nicotinamide mononucleotide,β-NMN）,设计模块化代谢改造策略。首先,对烟酰胺（nicotinamide,NAM）和β-NMN支路代谢涉及的8个酶进行失活,减少底盘细胞对前体和产物的额外消耗。其次,通过引入NAM输入蛋白（Bc NiaP）、β-NMN输出蛋白（Bm PnuC）、5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶（5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate?synthetase,Prs）和烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide?phosphoribosyl?transferase,Nampt）,敲除调节蛋白PurR,工程菌N12’摇瓶发酵可积累0.34 g/L的β-NMN;此后,比对筛选发现Comamonadaceae?bacterium来源的Nampt活性较高且对底盘细胞负担较小;通过进一步强化Bm PnuC和Prs的表达水平,工程菌N18摇瓶发酵β-NMN产量提高至1.36 g/L。最后,利用发酵罐分批补料发酵38 h,β-NMN产量达到10.2 g/L,NAM到β-NMN的摩尔转化...     

烟酰胺磷酸核糖转移酶在大肠杆菌中的表达及催化合成烟酰胺单核苷酸

烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphate ribose transferase,Nampt)是生物酶法合成烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide ribotide,NMN)中重要的酶,催化烟酰胺(Nicotinamide,NAM)和磷酸核糖焦磷酸(Phosphoribosyl pyrophosphate,PRPP)合成NMN。本研究将来源Meiothermus ruber的Nampt在大肠杆菌系统进行胞内表达,表达产物经纯化后进行酶学性质分析,并进一步将其用于催化合成NMN。将重组菌株在16℃低温下进行摇瓶水平诱导21 h,收集发酵菌体并进行超声破碎,破碎后上清利用Ni-NTA螯合亲和层析的方法进行纯化,SDS-PAGE结果显示表达与纯化后的产物大小约55 ku,与预期的蛋白分子量相符。重组Nampt的最适反应温度为45℃,最适p H为6。酶动力学分析显示,该酶对底物NAM催化的Km、Vmax、kcat分别是0.39μmol/L、3.20μmol/(mg·min)、1.391/s。使用该酶催化生产NMN,通过反应中补加一次底物PRPP,反应10min产物NMN产量可达30 mg/L。本研究成功表达一个酶学性质和热稳定性优良的Nampt,并将其应用在单酶催化生产NMN时有较高的产量和生产效率,为生物酶法合成NMN的应用研究奠定了基础。     

大肠杆菌分泌表达烟酰胺单核苷酸合成途径酶及催化体系优化

烟酰胺单核苷酸（NMN）是具有重要医用价值的NAD+前体,通过信号肽PelB实现大肠杆菌BL21(DE3)分泌表达催化NMN合成的烟酰胺磷酸核糖转移酶（Sfnampt）、磷酸核糖焦磷酸激酶（Tkprs）和核糖激酶（Erbks）。对三酶的酶学特性分析显示,Sfnampt、Tkprs和Erbks的最适反应温度分别为45、50和37 ℃,最适pH值分别为7.5、8.5和5.5。热稳定性分析发现,Sfnampt在35 ℃热稳定性良好而在40~55 ℃较差;Tkprs在40~60 ℃热稳定性良好;Erbks在25~40 ℃热稳定性良好而在45 ℃较差。酶动力学分析可知,Sfnampt、Tkprs和Erbks的Vmax分别为0.65 μmol/(L•min)、2.37 μmol/(L•min)、12.58 μmol/(L•min),Km分别为2.87 μmol/L、25.48 μmol/L和74.13 μmol/L,Tkprs、Erbks与已表征的Prs、Rbks相比底物亲和力好。将分泌表达的三酶用于催化合成NMN,温度37 ℃、pH值8.0为较优催化条件。底物ATP以及酶Sfnampt在反应体系中为关键因素,经底物和酶配比优化后,使用三酶经过7 h催化可获得5.50 μmol/L的NMN。该研究在大肠杆菌系统成功实现了NMN合成途径酶的分泌表达,为NMN合成提供了新思路。     

烟酰胺单核苷酸的生理功能及其在药品和食品中的应用

烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide,NMN）是辅酶I-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）合成的关键中间体,有α和β两种异构体存在形式,其中β异构体是NMN的活性形式,存在于多种生物内。研究发现,NMN对肠道健康、心脑血管疾病、神经退行性疾病、延缓衰老等有较好的作用,此外,NMN还可以通过参与调节机体的内分泌,增加胰岛素的分泌,进而防治肥胖和糖尿病的发生。目前,在美国和日本均已允许NMN作为食品原料进行食品生产。人们对含有NMN成分的保健产品需求也日益增加,因此,NMN已经成为保健品、食品原料等领域研究的热点,其市场份额也在迅速增加。文章系统地综述了NMN的基本性质、生理作用、保健功能及其在药品、食品上的应用,旨在为NMN的开发和应用研究提供理论参考。     

β-烟酰胺单核苷酸对生理机能影响的研究进展

我国处于亚健康状态的超重或肥胖人群与老龄化人口数量都在逐年上升。在衰老和肥胖过程中,细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD＋）水平会发生系统性下降。NAD＋是细胞能量代谢、调节细胞机能、影响衰老的关键靶点,因此,通过补充NAD＋前体以改善生理机能、延缓衰老已经成为目前研究热点。β-烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide,NMN）是动物体内NAD＋代谢的中间产物,也是目前最直接高效的NAD＋补充前体。但是NMN对生理机能存在多方面多器官的复杂影响,而且人体临床试验与动物实验结果并不一致,服用量也尚未确定。本文综述到目前为止NMN的动物实验和人体临床试验结果,旨在探究补充NMN对动物、人体生理机能的影响、机制及其适宜剂量和不良反应,以期为未来NMN研究与应用提供思路。     

β-烟酰胺单核苷酸跨境产品中NMN含量的测定

本文基于高效液相色谱法,通过优化色谱条件和样品前处理条件,建立了一种测定β-烟酰胺单核苷酸(NMN)胶囊和NMN片剂基质中NMN含量的检测方法,并进行方法学验证.结果表明,本方法在5～500μg/mL范围内有较好的线性关系,方法检出限(LOD,S/N=3)为1.0 mg/kg,定量限(LOQ,S/N=10)为3.0 m...     

基于混菌耦合发酵策略合成3′-唾液酸乳糖

唾液酸乳糖在婴幼儿配方奶粉产业展现出潜在、广阔的市场前景,但是目前缺少有效、廉价的合成方法.针对该问题,首先构建了2株工程菌JM109(DE3)/pET28a-neuA和JM109(DE3)/pET28a-nst,分别用于合成胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸(cytidine 5′-monophosphate N-acet...     

烟酰胺单核苷酸分子印迹微球的制备及其吸附性能研究

以烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide, NMN)为模板分子,α-甲基丙烯酸为功能单体,N,N′-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂,采用沉淀聚合法制备NMN分子印迹微球。对分子印迹微球制备工艺进行优化,当模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比为1∶2∶10、乙腈-水(体积比3∶1)用量12 mL、聚合温度60℃时,制备的分子印迹微球吸附效果最好。静态吸附结果表明,所制得的分子印迹微球对NMN有较强的吸附能力;动态吸附结果表明,该分子印迹微球在60 min左右达到吸附平衡、对NMN的吸附过程更符合准二级动力学方程。该分子印迹微球用于固相萃取西兰花提取液中的NMN时,展现了较高的应用性能,对NMN分子印迹微球的制备优化和应用具有参考和指导意义。     

双菌共固定化耦合催化发酵生产红色染色剂的研究

根据微生物的协同作用理论。采用酿酒酵母与红曲双菌共固定化耦合发酵生产红曲色素。实验结果表明：红曲霉菌与酿酒酵母菌体量配比为4：1时,固定化细胞双菌耦合发酵产红曲色素是红曲霉菌单菌固定化发酵产色素量的约1．6倍。     

超高效液相色谱-串联质谱法测定蜂王幼虫中烟酰胺单核苷酸的含量

建立了超高效液相色谱-串联质谱快速测定蜂王幼虫中烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)的方法.样品经乙醇和水提取后,采用Waters X Select HSS T3(2.1 mm×100 mm,2.5μm)色谱柱进行分离,串联质谱多反应监测模式定量分析.该方法中NMN在50～1...     

双菌混合发酵纳豆工艺优化

利用水解圈菌落直径比值(C/H)、菌株生长曲线、发酵纳豆激酶酶活和挥发性盐基氮含量,筛选出两株较优纳豆菌;再以纳豆激酶酶活和挥发性盐基氮含量为指标,对双菌株发酵纳豆工艺条件进行优化。结果表明,双菌株发酵制备纳豆最优工艺条件为菌种比例(m_N5∶m_N3)4∶1,接种量9%,发酵时间25 h,发酵温度35 ℃。此条件下制备的纳豆激酶酶活可达481.84 U/g,与单菌发酵相比提高了36.8%,挥发性盐基氮含量为205.21 mg/100 g,与单菌发酵最高值相比降低了42.3%。     

双菌微囊化发酵耦合泡沫分离强化乳链菌肽生产的工艺

本研究拟通过共培养乳酸链球菌与酿酒酵母解除产物抑制效应,并将泡沫分离耦合于微胶囊固定细胞发酵强化乳链菌肽（Nisin）的生产。采用液芯微胶囊固定乳酸链球菌和酿酒酵母细胞,并对海藻酸钠和壳聚糖浓度进行优化。结果表明,以乳糖为底物碳源,乳酸链球菌与酿酒酵母的初始接种比例102:1时,共培养发酵液中Nisin效价高达3436.3 IU/mL。海藻酸盐-壳聚糖-海藻酸盐（ACA）液芯微胶囊的制备条件为海藻酸钠浓度15 g/L和壳聚糖浓度5.5 g/L。在微胶囊固定细胞发酵与泡沫分离耦合时间为21 h,分布器孔径180 μm,气体体积流率40 mL/min条件下,Nisin的富集比和回收率分别为5.8和63.1%,总效价为3973.2 IU/mL。本研究建立的双菌微囊化发酵-泡沫分离耦合工艺能够有效解除产物抑制和菌体细胞损失,为高密度、连续发酵生产Nisin奠定了理论基础。     

基于耦合发酵策略的乳酰-N-三糖Ⅱ模块化合成研究

母乳寡糖在调节婴儿肠道菌群和保障婴儿健康方面都有积极的作用。乳酰-N-三糖Ⅱ(lacto-N-trioseⅡ, LNTⅡ)是母乳寡糖的核心结构单元。目前合成LNTⅡ的方法存在价格昂贵、操作繁琐等缺点。该研究以乳糖和N-乙酰氨基葡萄糖为底物用三菌株耦合发酵策略合成LNTⅡ。首先构建用于合成N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸(N-acetylglucosamine-1-phosphate, GlcNAc-1-P)模块的Escherichia coli JM109(DE3)/pET28a-nahK工程菌,优化发酵条件后,GlcNAc-1-P最高产量为16.88 g/L,转化率为70.05%。然后构建分别包含agx1、agx2、pmglmU基因的3株工程菌,并筛选出E.coli JM109(DE3)/pET28a-agx1,其合成尿苷二磷酸乙酰氨基葡萄糖(uridine diphosphate acetylglucosamine, UDP-GlcNAc)的能力最优,在优化的生产体系中UDP-GlcNAc的最大产量为24.78 g/L。最后构建工程菌E.coli JM109(DE3)/pET28a-lgtA并与E.coli JM109(DE3)/pET28a-nahK、E.coli JM109(DE3)/pET28a-agx1耦合发酵合成LNTⅡ,通过优化三菌株耦合发酵体系,LNTⅡ产量达到3.03 g/L,比优化前提高近4倍。该文基于三菌株耦合发酵策略实现了LNTⅡ的合成,这种策略具有通用性强、简便快捷和成本低廉的优点,将为母乳寡糖的规模化生产提供一种新方法。     

乳酸的发酵与提取耦合工艺

本文提出了利用木炭吸附固定化乳酸菌发酵,耦合离子交换树脂从发酵液中分离出乳酸的新工艺。此方法成功的消除了产物乳酸对乳酸菌生长和发酵的抑制作用,使发酵时间由72小时缩短到48小时,乳酸的体积生产率由1.3g/h.L上升到1.79g/h.L     

羊乳双菌发酵饮料酒的研究

选用双菌种发酵制备羊乳发酵饮料酒,确定了该饮料酒的的最佳发酵条件。其中,酵母菌最佳发酵条件为:酵母菌添加量0.12%、发酵温度28℃、加糖量10%、发酵时间26h;乳酸菌最佳发酵条件为:发酵时间8h、发酵温度42℃、乳酸菌添加量0.10‰。采用上述工艺条件发酵得到的羊乳发酵饮料酒,外观澄清透明、香气饱满,风味纯正。     

花生粕双菌液态发酵的工艺研究

以水解度(DH)为指标,对米曲霉AS3.951与枯草芽孢杆菌1.398混合液态发酵热榨花生粕的各种影响因素进行了研究,确定了最优的发酵工艺条件:温度为30℃,接种比例米曲∶枯草为3∶1,接种量为固态物料的10%,固态物料中花生粕含量为70%、麸皮为30%,两菌种接种时间差为3h,发酵培养基料液比为1∶16,发酵的时间为56h。本工艺条件的水解度达37.11%,氮溶解指数高达92.52%,制得的发酵液具有纯正的发酵风味及鲜味,且无苦味。      

双菌混合发酵生产豆豉的条件优化

在单因素试验基础上,采用正交试验优化纳豆枯草芽孢杆菌BN-05和毛霉菌MS-7双菌混合发酵工艺条件,以蛋白酶活力为考察指标,得出最佳的发酵条件为培养温度30℃,接种量6%,培养时间20 h,菌种配比2∶1,蛋白酶的活力为235.68 U/g,在此发酵条件下产品的氨臭味明显减少,有淡淡的香味。     

混菌发酵纳豆的工艺研究

为改善纳豆风味,该研究以市售大豆为原料,采用纳豆发酵粉和乳酸菌粉混合发酵,并以感官评分、挥发性盐基氮含量和纳豆激酶活力为考察指标,采用单因素试验和正交试验对纳豆发酵工艺进行优化。结果表明,混菌发酵纳豆最优发酵工艺为菌粉比例（乳酸菌∶纳豆芽孢杆菌）1.0∶1.5,发酵温度40 ℃,发酵时间27 h。在此最优发酵工艺下,纳豆感官评分为9.0分,挥发性盐基氮含量为11.02 mg/100 g,纳豆激酶活力为438.90 U/g,此时纳豆色泽鲜亮,氨臭味明显降低,拉丝状态好,纳豆品质明显优于市售纳豆。     

固态基质CO_2循环气载乙醇发酵分离耦合过程的研究

对固态基质CO2 循环气载乙醇发酵分离耦合过程进行了初步研究。实验结果表明 ,利用固态基质CO2 循环气载乙醇发酵分离耦合可以分离得到乙醇 7 2 % ,淀粉转化率达到 84 0 % ,并可有效地控制发酵温度     

海藻糖合酶基因工程菌的高密度发酵策略

探讨海藻糖合酶基因工程菌高密度发酵过程中的一些影响因素,为海藻糖合酶基因工程菌实现工业化生产提供理论依据.