驴乳外泌体中miRNA的测序与分析

为探究驴乳外泌体中微小RNA(miRNA)的种类和功能性,利用Illumina测序技术对驴乳外泌体中非编码小RNA(sRNA)进行测序分析,鉴定其中的miRNA并以人乳外泌体miRNA作为对照组进行生物信息学分析。驴乳外泌体中sRNA在质量控制之后,长度主要分布在18～22 nt,在其中共鉴定到212个miRNA,其中包括16种已知miRNA和196种新miRNA。基因本体论富集分析发现,驴乳外泌体miRNA的功能性与人乳相似,构成细胞、细胞器等组分;具有结合和催化活性等功能;参与细胞代谢、生物调节等过程。京都基因与基因组百科全书通路富集分析发现,驴乳外泌体miRNA参与醛固酮的合成与分泌、Hedgehog信号、线粒体调节、癌症等通路。     

山羊乳及绵羊乳外泌体miRNAs表达谱的分析与差异比较

为揭示山羊乳和绵羊乳外泌体的潜在功能差异，对山羊乳和绵羊乳外泌体进行提取和鉴定，利用Illumina平台对羊乳外泌体中非编码小RNA(sRNA)进行高通量测序，并对微小RNA(miRNA)表达谱和功能进行注释。在山羊乳外泌体中鉴定出161种已知miRNAs序列和5种新型miRNAs序列；绵羊乳外泌体中鉴定出80种已知miRNAs序列和7种新型miRNAs序列，其中miR-148a、miR-26a和let-7b在2种羊乳样本中表达量较高。miR-151只在山羊乳外泌体样本中检出。通路富集发现山羊乳miRNAs靶基因分子功能集中在结合和催化活性等方面，而绵羊乳外泌体miRNAs靶基因具有肠菌素结合的功能，且对宿主发育具有一定促进作用。结果提示山羊乳和绵羊乳来源的miRNAs可能具有某些共性和独特的靶基因类型，可能在缓解病原微生物感染、炎症、抑制癌细胞增殖迁移等方面发挥不同功能。上述miRNAs测序与分析研究可为羊乳外泌体的后续功能开发提供参考。     

内源性n-3多不饱和脂肪酸对下丘脑神经干细胞来源外泌体miRNA的调节

目的：通过培养fat-1转基因小鼠下丘脑神经干细胞获取外泌体并提取总RNA进行高通量测序,研究内源性n-3多不饱和脂肪酸（n-3 polyunsaturated fatty acids,n-3 PUFAs）对丘脑神经干细胞来源外泌体miRNA的调节作用,探究n-3 PUFAs抑制下丘脑炎症及肥胖的作用机制。方法：分别培养fat-1转基因小鼠与野生型C57BL/6小鼠下丘脑神经干细胞,从细胞培养上清液中收集外泌体并提取总RNA,经高通量测序后利用生物信息学技术对差异表达的miRNA进行分析及靶基因预测,对靶基因进行基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析后,利用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR）进行相对表达量的测定。结果：与野生型C57BL/6小鼠相比,fat-1转基因小鼠下丘脑神经干细胞来源的外泌体miRNA具有特异表达谱,且具有显著差异表达的miRNA靶基因处于下丘脑炎症、脂肪酸代谢等通路中关键位置。经qPCR验证,差异表达的miRNA关键靶基因表达均受到调控。结论：内源性n-3 PUFAs水平的增加可以调节下丘脑神经干细胞外泌体中miRNA的表达,进而调控炎症反应与脂质代谢相关基因的表达,从而发挥抑制下丘脑炎症、抵抗肥胖的作用。     

n-3多不饱和脂肪酸对小鼠血液外泌体中miRNA的调节和抑制肥胖作用

目的：研究体内n-3多不饱和脂肪酸（n-3 polyunsaturated fatty acids,n-3 PUFAs）含量的增加对小鼠体质量和血液中外泌体miRNAs表达的影响,探讨n-3 PUFAs通过外泌体抑制肥胖的作用机制。方法：利用能自发生成n-3 PUFAs的fat-1转基因小鼠和同窝野生型小鼠（对照）,通过高脂饮食（high-fat diet,HFD）建立肥胖动物实验模型,测定小鼠体质量。提取小鼠血浆中的外泌体并鉴定;分离外泌体内的RNA,构建文库并进行miRNA高通量测序。根据测序结果通过生物信息学方法分析找到其调控的靶基因和相关联的通路,发现miRNA-靶基因互作关系。验证miRNA与肥胖的关联度以及在肥胖中所发挥的作用。结果：fat-1转基因小鼠体质量明显低于野生型;外泌体提取鉴定成功;miRNA高通量测序结果显示,不同小鼠组间进行对比时,差异表达显著（P＜0.05且差异倍数（fold change,FC）≠1）的miRNA有46 个;生物信息学分析发现6 个重要miRNA（mmu-miR-665-3p、mmu-miR-122-5p、mmu-miR-122-3p、mmu-miR-194-5p、mmu-miR-34c-5p、mmu-miR-223-3p）落在脂肪酸代谢通路以及内吞通路关键位置,功能与脂质代谢和肥胖相关,所对应的靶基因分别为Fads1、Elovl2、Elov6、Hadha、Scad1、Scad2、Hsd17b12、Acot2、Acot4和Arf6、H2-T-ps、Arrb1、Ist1、H2-T10、Wwp1、Snx4、IL2rb、Mvb12b、Rab11、fip3、Kif5a、Nedd4l。结论：n-3 PUFAs含量的增加能够有效降低小鼠的体质量,抑制肥胖。n-3 PUFAs能够调节血液中外泌体内miRNA的表达,其中具有显著差异性的miRNA与肥胖有关,其相关的靶基因集中在脂质代谢相关的分子通路中,提示可能是n-3 PUFAs降低体质量抑制肥胖机制之一。     

基于RBL-2H3模型分析过敏反应效应细胞激活的差异基因

构建IgE介导的大鼠嗜碱性粒细胞（rat basophilic leukemia，RBL）-2H3作为过敏反应细胞模型，并利用转录组测序分析比较RBL-2H3细胞激活前后的转录组基因差异，富集相关信号通路。IgE介导的RBL-2H3细胞激活后，过敏介质和细胞因子分泌显著提高；转录组测序得到RBL-2H3细胞激活前后的232 个差异表达基因，其中有127 个（54.74%）可进行基因功能注释；RBL-2H3细胞激活主要影响肿瘤坏死因子、丝裂原活化蛋白激酶、Janus激酶-信号转导与转录激活子、Toll样受体等信号通路，涉及的转录因子有MAP3K8、Nfkbia、Junb、Jun、Fos等。本研究建立了IgE介导的过敏反应体外细胞模型，并且通过对效应细胞转录组信息的全面分析和潜在靶点及信号通路的富集为过敏性疾病的防控治疗提供参考。     

不同泌乳期人乳外泌体miRNA表达谱的研究

采用超高速离心法从人乳中提取出囊泡结构物质，从粒径、形态和外秘体特异性标记蛋白3个方面来确定提取的物质为外泌体。采用高通量测序得到不同泌乳期外泌体中microRNA(miRNA)的表达谱。对表达谱进行分析，在人乳外泌体中共检出852种miRNA，有283种miRNA在早、中、晚3个泌乳期中均有所表达。其中，表达量排名前10位的miRNA占到总量的50%以上。在外泌体中高表达的miRNA(占总外泌体miRNA表达量2%以上的)并没有受到泌乳期的显著影响；而在外泌体中低表达的一些miRNA(占总外泌体miRNA表达量0.01%以下的)容易受到泌乳期的显著影响。此外，发现在人乳外泌体中有88种miRNA与炎症相关，其中有65种在不同泌乳期均稳定表达。综上，人乳外泌体可能具有调控炎症的功能，本研究为更好地研究不同泌乳期人乳外泌体生理功能提供基础数据。     

基于转录组学分析驴油生酮饮食下CT26+结肠癌肿瘤的变化

该研究旨在通过转录组测序技术筛选出驴油生酮饮食（Donkey Oil Ketogeni Diet，DOKD）影响CT26+结肠癌肿瘤生长的相关基因，挖掘对DOKD响应的基因及其代谢通路，为解析驴油生酮饮食抑制肿瘤生长的机制提供依据。该研究选取一致性较好的CT26+结肠癌BALB/c模型小鼠，随机分为2组，每组3个重复，分别饲喂驴油生酮饮食（DOKD）与正常饮食（ND）。饲喂10 d后处死摘取肿瘤组织，测量肿瘤的重量及体积，并利用RNA-Seq技术和生物信息分析方法进行转录组测序及结果分析。DOKD组与ND组小鼠体重无显著差异，肿瘤明显小于ND组。与ND组相比，DOKD组共18个基因差异表达，其中12个DEGs上调，6个DEGs下调。这些DEGs注释到170条GO条目，其中生物过程（BP）类别124条，细胞组成（CC）类别2条，分子功能（MF）类别44条；涉及18条KEGG通路，主要富集在IL-17信号通路、趋化因子信号通路、细胞因子受体相互作用信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等重要通路。此外，该研究通过Western blot进一步研究了TLR4/NF-κB信号通路在在肿瘤中的作用。综上，DOKD对CT26+结肠癌肿瘤有明显抑制作用，该作用可能与IL-17信号通路、趋化因子信号通路、细胞因子受体相互作用信号通路、TNF信号通路等通路密切相关。     

牛乳来源外泌体的生物学功能研究进展

外泌体是由细胞分泌到细胞外的一种胞外囊泡,装载了许多有着特定功能的活性物质,包括核酸、脂质和蛋白质等。绝大多数的活细胞都能够分泌外泌体并且将其所携带的内容物传递至靶细胞发挥特定的作用。而牛乳所分泌的外泌体已被证实对人体先天免疫、肠道发育等方面具有积极功效。同时,牛乳来源的外泌体也被证实会对罹患肥胖、II型糖尿病等慢性疾病的发展带来潜在的风险。本文对牛乳外泌体的组成、形成途径以及外泌体对人体有益的功能特性和潜在的一些风险进行综述,期望为国内牛乳来源外泌体的研究提供参考。     

基于转录组测序分析葡萄籽原花青素对HepG2细胞基因及其相关功能的影响

目的:基于转录组测序分析葡萄籽原花青素对HepG2细胞基因及相关功能的影响,明确原花青素处理HepG2细胞的关键基因及代谢通路。方法:通过转录组测序,筛选差异基因,基因功能注释和KEGG通路的富集分析,进行葡萄籽原花青素处理细胞后的转录组学研究。结果:葡萄籽花青素处理HepG2细胞后主要富集到的生物学过程为细胞过程、代谢过程、生物调控过程、免疫系统过程、繁殖调节、生长调节。细胞凋亡的12个关键差异基因与TNF、p53、MAPK、PI3K-Akt、NF-κB信号通路密切相关。结论:细胞凋亡与TNF信号通路、p53信号传导途径、PI3K/Akt信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路密切相关。     

基于Illumina Hiseq高通量测序红曲霉转录组学分析

分别以铵态氮、亚硝态氮为氮源培养安卡红曲霉（Monascus anka）GZUM-25，采用Illumina二代测序平台（Illumina Hiseq）对红曲霉GZUM-25进行转录组测序分析，分析不同氮源条件下调控红曲霉菌丝生长和产色素的差异表达基因，并对基因进行GO功能富集及KEGG通路富集分析。结果表明，从铵态氮和亚硝态氮培养下的安卡红曲霉GZUM-25基因组中共获得95个差异表达基因，其中，上调基因有37个，下调基因有58个。差异表达基因主要富集的功能为生物学过程、细胞组分和分子功能，富集的通路为磷酸肌醇代谢、淀粉和蔗糖代谢、苯乙烯降解、氨基苯基酸酯降解。     

不同灭菌方式对商品乳外泌体完整性的影响

选取了市面上常见的不同品牌的巴氏灭菌牛乳和超高温灭菌牛乳（n=3）,采用差速超速离心法提取牛奶中的外泌体,对提取的外泌体进行透射电镜观察（transmission electron microscopy, TEM）,粒径分析（nanosight analysis, NTA）以及WB分析外泌体膜表面标志性蛋白的表达情况。研究结果表明,不同的灭菌方式对商品乳外泌体的形态,粒径范围影响不大,但可使外泌体标志蛋白发生变性、聚集和糖基化。结果显示,工业加工方式破坏了乳中外泌体的完整性,对外泌体的生物活性也将产生影响,对成年人摄取商品乳对健康的潜在影响需进一步的研究。     

单增李斯特菌感染RAW264.7细胞转录组差异表达分析

为了探讨单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）感染前后RAW264.7细胞基因表达谱变化,筛选关键功能基因和通路,为探究其致病机制奠定基础,本研究以感染复数（MOI）10的LM 感染RAW264.7细胞6 h后,提取细胞RNA进行转录组测序,选取感染组与对照组相比差异倍数≥1.5且P<0.05的差异表达基因进行GO和KEGG富集分析,并通过RT-qPCR验证部分差异基因。转录组结果显示RAW264.7细胞在感染LM前后有1 782 个基因差异表达,其中上调为989,下调为793。GO分析结果主要涉及免疫系统过程、免疫反应、细胞程序性死亡调控等。KEGG分析结果显示,显著富集的通路有细胞因子-受体相互作用、肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路等。RT-qPCR验证试验结果显示,随机选择的11 个显著差异基因表达倍数趋势与测序结果一致。该研究为进一步深入研究LM的致病机制奠定了基础。     

牛乳外泌体对动物双歧杆菌F1-3-2生长及益生特性的影响

采用超速离心法从牛乳中分离提取外泌体,通过免疫印迹法、纳米颗粒追踪技术、透射电镜对牛乳外泌体进行鉴定。评价了牛乳外泌体对动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)F1-3-2生长及益生特性的影响。结果表明,牛乳外泌体促进了动物双歧杆菌F1-3-2的生长,提高了其耐酸、耐胆盐等肠胃环境耐受性,增加了菌体的黏附性。此外,牛乳外泌体增强了动物双歧杆菌F1-3-2的抗炎特性,炎症因子TNF-α、IL-1β水平显著下调。该研究为牛乳外泌体作为新型益生元的应用开发奠定了基础。     

食用玫瑰花水提物对大鼠肠道微生物和基因表达的影响

利用16S rDNA测序方法研究大鼠灌胃玫瑰水提物对肠道微生物的影响,结合转录组测序结果探讨玫瑰水提物对机体的功能作用。选用6周龄SD大鼠,灌胃蒸馏水作为对照组,实验组分别灌胃低、中、高剂量玫瑰水提物,每组8只。结果表明:低、中、高剂量玫瑰水提物均对正常大鼠血脂和生长发育指标无显著影响;不同组别的大鼠粪便中普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和盲肠内容物中普雷沃氏菌属(Prevotella)含量差异明显,均为高剂量组<对照组<中剂量组<低剂量组;与对照组相比,不同剂量的玫瑰水提物均显著影响大鼠肝脏的转录组学,低剂量玫瑰水提物有101个差异表达基因,显著富集于抗原加工和提呈(ko04612)通路;中剂量组也有101个差异表达基因,主要集中在抗原加工和提呈、TNF信号通路(ko04668)等4条通路高剂量组有76个差异表达基因,主要集中在抗原加工和提呈、MAPK信号通路(ko04010)等6条通路不同剂量之间也有明显变化。这说明玫瑰水提物对大鼠肠道普雷沃氏菌属影响较大,同时也显著影响肝脏免疫应答。提示玫瑰水提物可通过干预肠道微生物多样性进而影响机体健康,并具有潜在的诱导肿瘤细胞衰老和提高机体免疫功能的作用。     

高通量测序技术探究驴乳粉对皮肤细胞的影响

基于RNA-seq技术探究驴乳与角质形成细胞和成纤维细胞的相互作用。驴乳分别与角质形成细胞、成纤维细胞共孵育后,采用RNA-seq筛选差异表达基因（DEGs）,进行GO和KEGG富集分析。驴乳作用角质形成细胞后共筛选出819个DEGs,其中420个上调基因,399个下调基因。GO富集分析显示,差异表达基因参与与表皮发育、角质细胞分化、角化等生物学过程。KEGG富集分析显示,驴乳作用角质形成细胞涉及的分子机制包括IL-17信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、金黄色葡萄球菌感染等。驴乳作用成纤维细胞后共筛选出507个DEGs,其中298个基因上调,209个基因下调。GO富集分析显示,驴乳参与成纤维细胞的细胞黏附的正调控、脂质定位的调节、脂质转运的调节等生物学过程;KEGG结果显示,驴乳作用成纤维细胞涉及的分子机制包括细胞因子-细胞因子受体相互作用和c GMP-PKG信号通路等。为阐明驴乳对皮肤细胞功能的分子作用机制提供了科学依据。     

2种不同牛乳外泌体提取方法的比较研究

目的比较研究2种不同的牛乳外泌体提取方法。方法分别采用超速离心法和蔗糖密度梯度离心法从牛乳中提取外泌体,利用透射电镜、动态光散射仪、纳米颗粒追踪仪、免疫印迹等技术对牛乳外泌体进行全面的鉴定表征。结果利用上述2种方法提取获得的牛乳外泌体呈现双层膜的杯托状结构,总体粒径分布在30～200 nm之间且外泌体中常见的特异标记蛋白CD9、CD81、TSG101均存在,不存在污染蛋白Calnexin。结论超速离心法与蔗糖密度梯度离心法均可从牛乳中提取获得结构完整的外泌体,与超速离心法相比,通过蔗糖密度梯度离心法可获取杂质较少、粒径分布更集中的牛乳外泌体,但该法耗时长、外泌体浓度较低。     

蛹虫草转录组分析及类胡萝卜素生物合成相关基因的挖掘

基于培养基显著影响蛹虫草类胡萝卜素的生成，采用高通量测序技术探究不同培养基培养的蛹虫草菌丝（CM10_RL和CM10_WL）的转录组差异，经生物信息学分析挖掘蛹虫草类胡萝卜素的生物合成相关基因。结果表明，样品CM10_WL的类胡萝卜素含量显著高于样品CM10_RL的类胡萝卜素含量；相对于样品CM10_RL，在样品CM10_WL中检测到318 个上调表达基因和618 个下调表达基因。基因本体论功能富集结果表明差异表达基因（differentially expressed gene，DEG）主要富集在代谢过程、细胞膜、催化活性条目中。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集结果表明DEG主要富集在代谢途径。蛹虫草转录本与KEGG数据库中的类胡萝卜素生物合成途径比对结果表明基因CCM_06728和CCM_09155参与类胡萝卜素的生物合成。本研究为进一步阐明蛹虫草类胡萝卜素的生物合成途径奠定基础。     

乳源外泌体对微生物的作用

外泌体是纳米级(直径40~160 nm)的胞外囊泡,在细胞信号转导、免疫应答和抗原递呈过程中发挥作用,并存在于多种体液,包括血清、唾液、尿液、脑脊液和乳液等。乳外泌体携带蛋白质、miRNA等多种功能分子,很多与人体免疫功能相关。摄取乳液后,乳外泌体中的内容物可被人体肠道吸收,从而发挥健康作用。本文总结国内外有关乳源外泌体与微生物关系的研究报道以及本团队的研究成果,阐述外泌体的生物发生过程,主要组成成分,外泌体与病原微生物感染的关系以及乳外泌体对肠道微生物的作用,为研究乳外泌体对人体的营养和健康功效提供参考。     

杜氏盐藻胞外多糖抗肿瘤活性及其机制研究

海藻多糖是海藻中最重要的药理活性物质之一,已成为肿瘤治疗中新的药物资源,然而,大多数微藻多糖的抗癌机制尚待阐明。为了探究杜氏盐藻胞外多糖(DsEPS)的抗肿瘤机制,本文研究了其对宫颈癌细胞(Hela)的毒性及生长的抑制作用,并利用转录组分析揭示其抗肿瘤活性作用机制。结果表明,DsEPS可抑制Hela细胞增殖,降低细胞活力,改变细胞形态。转录组分析显示,对照组和多糖组之间存在2032个差异表达基因,其中1132个上调,900个下调。基因功能富集分析结果表明,差异表达基因显著富集细胞凋亡和肿瘤相关生物过程,参与了多种癌症和凋亡相关信号通路,包括MAPK信号通路,TNF信号通路,VEGF通路,Ras信号通路等。最后构建蛋白互作网络,并从PPI网络中发现了度中心性最强10个的hub基因。本研究表明,DsEPS有抗肿瘤活性,并初步探明了其抗肿瘤机制,为以后进一步研究提供有效参考。     

基于网络药理学和分子对接探讨毛建茶干预高脂血症的作用机制

本研究旨在运用网络药理学方法和分子对接技术综合解释毛建茶干预高脂血症的核心成分和作用机制。利用中药系统药理学数据库和分析平台筛选得到毛建茶中8 个活性成分和160 个干预高脂血症作用的靶点，构建“毛建茶-活性成分-交集靶点-高脂血症”网络。基因本体通路分析和京都基因与基因组百科全书通路富集分析结果显示，毛建茶干预高脂血症主要涉及肿瘤坏死因子信号通路、胰岛素抵抗和过氧化物酶体增殖物激活受体等信号通路；分子对接及可视化分析结果表明，毛建茶核心成分与关键靶点间均能稳定结合。综上，毛建茶通过多成分-多靶点-多通路协同作用干预高脂血症，研究结果可为代用茶植物资源的开发与利用提供理论依据。