大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子单克隆抗体的制备与鉴定

为制备免疫学特性良好的大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子(Kunitz trypsin inhibitor,KTI)单克隆抗体,以50μg/只的免疫剂量将KTI免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定多抗血清效价和敏感性,选择血清效价和敏感性较优的小鼠进行细胞融合,多次筛选得到稳定分泌KTI单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株,采用体内诱生腹水法制备mAb并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明,1号小鼠经免疫后效价最高且敏感性最好,半数抑制浓度(IC50)为157.33ng/mL,经细胞融合筛选得到4E6-E9阳性杂交瘤细胞株,所制备的抗体效价达到11 638 400,亚型为IgG1型,亲和常数为1.45×108 L/mol,IC50为28.39ng/mL,且特异性强。说明试验所制备的mAb免疫学特性良好,能够为建立灵敏、特异的KTI免疫学检测方法提供良好的抗体保障。     

基于无标记适配体-纳米金比色快速检测四环素类抗生素

该研究以四环素类（Tetracyclines，TCs）抗生素的适配体为识别探针，以纳米金为信号传导元件，构建了一种无标记、简便快速的TCs多残留比色检测方法。在优化条件下将其应用于食品中TCs多残留快速检测，并与国标法（GB 31658.6-2021）对比验证。结果显示，样品经甲醇+乙腈（6:4，V/V）提取后采用该方法进行检测，在适配体浓度为150 nmol/L、NaCl浓度40 mmol/L、反应时间5 min等检测条件下，该比色方法对四种TCs的检测线性范围为0.25~5.0 ng/mL（R>0.981），可视化检测限为0.5~1.0 ng/mL，检测时间约5 min。该方法对四环素、土霉素、金霉素和多西环素具有高的特异性，与氯霉素和庆大霉素等无交叉反应。将方法应用于牛乳中TCs检测，加标回收率为63.52%~102.48%，相对标准偏差2.49%~6.81%。结果表明，该方法具有简便、快速、成本低、灵敏度高等优点，适用于批量样品中TCs的现场快速检测。     

构建氯化血红素/G-四链体DNA酶比色生物传感器检测食品中苏丹红

以苏丹红III核酸适配体为识别元件,以氯化血红素/G-四链体DNA酶为信号探针,结合杂交链反应信号放大策略,构建一种简单、新颖、高灵敏的生物传感器,用于苏丹红比色检测。在优化条件下,对该方法的灵敏度、准确性、特异性进行评估,最后将其应用食品中苏丹红III快速检测,并与GB/T 19681—2005法对比验证。结果显示,在优化条件下,苏丹红III质量浓度在0.5～250 ng/mL范围与450 nm波长处的吸光度呈良好线性关系（相关系数为0.995）,方法检测限为0.09 ng/mL。特异性分析显示,本方法可用于苏丹红I～IV的检测。实际样品分析中表明,食品中苏丹红III加标回收率为84.3%～101.6%,相对标准偏差为4.13%～8.36%,本方法的加标回收率与GB 19681—2005法相比差异不显著（P＞0.05）。该方法操作简便、准确可靠、灵敏度高,适用于批量食品中苏丹红的快速检测。     

基于金纳米颗粒信号放大ELISA检测食品中恩诺沙星

以金纳米颗粒（gold nanoparticles,AuNPs）为信号放大载体,利用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的二抗为信号探针,建立一种基于AuNPs的信号放大酶联免疫检测方法（AuNPs signal amplification enzyme-linked immunosorbent assay,AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA）,检测食品中恩诺沙星（enrofloxacin,ENR）。该方法对ENR的检测限（IC15）为5×10－4?ng/mL,半数抑制浓度（IC50）为0.24?ng/mL,检测范围为0.16～500?ng/mL,与建立的传统ELISA方法（IC50=8.76?ng/mL）相比,显著提高了检测灵敏度,并且该方法与环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星交叉反应率均小于0.1%,具有良好的特异性。该AuNPs-HRP-IgG?ic-ELISA方法的实用性得到了样品添加回收实验和商业化ELISA检测试剂盒的验证,其在牛奶样品中的加标回收率可达80.52%～102.66%,适用于实际牛奶样本中ENR的快速灵敏检测,也为建立其他食品危害物质的精准检测技术开发提供参考。     

基于磁弛豫开关的免疫传感器检测自来水和脱脂牛奶中的雌二醇

目的 建立磁弛豫开关（magnetic relaxation switch,MRS）免疫传感器检测自来水和脱脂牛奶中雌二醇（Estradiol,E2）残留的检测方法。方法 首先通过1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC）和N-羟基丁二酰亚胺（n-hydroxysuccinimide,NHS）反应将雌二醇抗体（E2-Ab）和雌二醇全抗原（E2-BSA）分别偶联在磁纳米粒子（magnetic nanoparticles,MNP）表面,利用透射电子显微镜和动态光散射法等方法对偶联前后状态进行表征,而后添加游离E2于检测体系中与E2-BSA竞争反应1 h,将反应溶液转移到核磁共振管中,使用核磁共振交联密度分析测量仪器对横向弛豫时间（T2)进行测定,进而对E2定量分析。结果 在磁珠偶联抗体（MNP-Ab）浓度为5 μg/mL,磁珠偶联全抗原（MNP-E2-BSA)为50 μg/mL及孵育时间为90 min的优化条件下,该传感方法的横向弛豫时间变化（△T2）与E2浓度的对数在0.01~100 ng/mL的范围内呈良好的线性关系,检出限为0.01 ng/mL。对自来水样品和脱脂牛奶在0.5、5和50 ng/mL添加水平的回收率分别为93.55%~118%和91.25%~107.32%,相对标准差（relative standard deviation,RSD）小于4.82%。结论 该方法快速、准确、灵敏,为食品安全风险因子快速检测提供一种更为有效的手段。     

双抗夹心ELISA检测转Bar基因抗除草剂大豆

为快捷有效地检测转Bar基因抗除草剂大豆,利用已制备的抗除草剂Bar基因编码蛋白,膦丝菌素乙酰转移酶（phosphinothricin acetyltransferase,PAT）单克隆抗体和多克隆抗体,建立PAT蛋白双抗夹心酶联免疫吸附检测方法,对转Bar基因抗除草剂大豆不同组织材料进行定量检测。结果显示,最佳检测条件为捕获抗体质量浓度0.125 μg/mL,包被酶标板,37 ℃孵育1 h后4 ℃静置过夜,检测样品37 ℃孵育1.5 h,检测抗体质量浓度6.25 μg/mL,37 ℃孵育1.5 h;PAT蛋白的最低检测限为0.04 ng/mL,大豆蛋白体系中为8 ng/mL;重复性变异系数小于3%。利用上述检测条件,对实验建立的转Bar基因抗除草剂大豆进行PAT蛋白定量检测,成功地在根、茎、花、叶、种子不同部位检测到该蛋白的表达。     

食用油中苯并（a）芘检测的样品前处理方法——相转移催化皂化法

建立了食用油中苯并（a）芘的相转移催化皂化提取前处理方法,并结合高效液相色谱（HPLC-FLD）进行含量检测。结果表明：该方法检出限为0.2 ng/mL,定量限为0.7 ng/mL,苯并（a）芘平均回收率为96.15%~103.2%,相对标准偏差为2.61%~4.96%。该方法具有降低有机溶剂的消耗、降低检测成本、操作简单、检测时间短等优点,符合快速、便捷、准确及灵敏地检测食用油中苯并（a）芘要求。     

采用QuEChERS结合UHPLC-MS/MS定量分析热加工肉制品中的三种胺类物质

本文采用QuEChERS技术结合超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术建立同时检测丙烯酰胺（AA）、亚硝胺（NAs）和杂环胺（HAAs）含量的方法，用于分析热加工肉制品中产生的胺类物质。结果表明:该方法检测出的三类成分20种胺类物质在相应浓度范围内显示出良好的线性关系（R2>0.991），检测限和定量限分别为0.01~1.6 ng/g和0.03~4.8 ng/g，日内回收率介于66.3%~116.5%之间，日内精密度介于0.78%~9.0%之间。每个胺类物的5×LOQ加标水平计算的日间精度范围为3.4%~9.4%。该方法应用于煎烤的四种肉制品中AA、NAs和HAAs的分析，共检测出9种胺类物质，浓度范围为0.03~31.26 ng/g。     

高效液相色谱-串联质谱法快速分析鱼肉中的类固醇激素残留

建立了一种快速高效的液相色谱-串联质谱法分析鱼肉中类固醇激素。实验优化了色谱分离条件和三重四级杆质谱检测参数。采用Hypersil GOLD C18色谱柱（150 mm×2.1 mm,i.d. 5 μm）,甲醇-水（含0.1%甲酸,V/V,%）为流动相进行梯度洗脱,在20 min内基本实现了大部分物质基线分离;在电喷雾正离子和选择离子对模式下,结合目标物保留时间和特征离子对信息,对16种激素进行定性和定量分析。结果表明,所有化合物具有良好的线性范围（0.10~3000.00 ng/mL）,相关系数R大于0.9987,检测限介于0.05~5.00 ng/mL范围内。鱼肉样品在液氮中研磨成鱼粉,经过固相萃取法净化处理后,测得氢化可的松药物残留为48.00 ng/g。16种激素的回收率介于82.84%~115.10%之间,RSDs值小于9.30%。该法分离能力强、灵敏度高,适用于水产品中类固醇药物的多残留同时测定。     

AAS与ICP-MS法测定花生中镉含量的对比研究

使用石墨炉原子吸收(Graphite furnace atomic absorption spectrometry,AAS)和电感耦合等离子体质谱(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)分别测定5批花生中镉的含量,将测得的结果数据进行对比分析,为花生中镉含量的测定提供实用可靠的检测方法。两种方法测得的花生中镉含量结果相对平均偏差均小于10%;线性范围:石墨炉原子吸收为0~5 ng/mL,ICP-MS为0~50 ng/mL;检出限:石墨炉原子吸收为0.02 ng/mL,ICP-MS为0.004 ng/mL;回收率:石墨炉原子吸收为91.8%~105.7%,ICP-MS为89.8%~95.3%;精密度:石墨炉原子吸收为2.27%,ICP-MS为1.70%。结果表明,两种方法都可以满足对花生中镉含量进行测定,对于同一来源的样品消解液,可以同时采用石墨炉原子吸收和电感耦合等离子体质谱进行测定,均可以保证测定数据的准确性。     

Purification and Quantification of Kunitz Trypsin Inhibitor in Soybean Using Two-Dimensional Liquid Chromatography

Kunitz trypsin inhibitor (KTI) is one of the major antinutritional factors in soybean and results in inhibition of digestion of dietary protein. In this study, we developed a novel strategy to purify and quantify KTI from soybean using two-dimensional liquid chromatography. Lipids from ground soybean were removed using hexane after which the ground soybean was extracted with protein extraction buffer. The crude extract was first purified by weak anion exchange chromatography, and then the fraction containing KTI was further separated by size exclusion chromatography. The fraction containing KTI was collected and analyzed by SDS-PAGE and electrospray ionization mass spectrometry. Results indicated that purified KTI has a molecular mass of 20 kDa and a purity of ~98% with inhibitory activity of 2425 TIU/mg protein. This assay was used for the quantification of KTI in soybean samples. The assay showed concentrations with a range between 7.81 and 500.00 μg/mL and a limit of detection of 0.12 mg/g. The recoveries of KTI in spiked soybean samples were between 82.19% and 86.65%, and intra- and interday precisions (% CV) were less than 7.35% and 8.42%. The developed method was used to analyze soybean samples from different sources and soybean products derived from different processing techniques, which demonstrated that the developed procedure provided an accurate and sensitive tool for separation and quantification of intact KTI in soybean.     

ELISA-Based Detection of Soybean Proteins: A Comparative Study Using Antibodies Against Modified and Native Proteins

Soybean, the world’s primary provider of protein and oil, is widely used in foodstuffs which might pose a serious threat to allergic consumers due to the presence of some allergenic proteins. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is the preferred method for the determination of allergen contamination in foodstuffs. Due to food processing, the antibody–antigen interaction in these routinely used methods are disrupted, therefore leading to erroneous results. A comparison between an ELISA using antibodies against modified soybean proteins and against the Kunitz trypsin inhibitor (KTI) is described. Limits of detection and quantification of 115.6 ng soybean protein/mL and 346.8 ng/mL were obtained for soybean-ELISA and 117.3 ng KTI/mL and 351.9 ng/mL for KTI-ELISA, respectively. Minimal cross-reactivity with other legumes and food ingredients were obtained. The applicability of these ELISAs was evaluated to detect the presence of soybean proteins in cookies. Both matrix interferences and the baking process affected analytical recovery. However, the recoveries were found to be much higher using the soybean-ELISA. The low recovery obtained using the KTI-ELISA might be due to the inability of the antibodies used to recognize the modified proteins. These results indicate that using antibodies developed towards allergens modified through food processing simulating reactions is a better approach to be used in food allergen detection.     

基于适配体-阳离子化合物诱导纳米金聚集比色法快速检测苏丹红

本研究以苏丹红Ⅲ适配体为识别元件,以未修饰的纳米金传感信号,以聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)作为纳米金聚集的诱导剂,构建了一种简单、经济、快速的苏丹红比色检测方法。在优化条件下评估本方法的检测灵敏度、准确性和特异性,最后应用于食品中苏丹红快速检测,并将检测结果与国标法(GB/T 19681-2005)对比验证。结果显示,在PDDA浓度20 nmol/L、适配体浓度5 nmol/L、反应时间4 min等优化条件下,纳米金吸光度比值(A_650nm/A_530nm)与苏丹红Ⅲ浓度呈良好线性关系(R=0.986),线性检测范围为3.13～50 ng/mL,可视化检测限为3.13 ng/mL,检测时间约为5 min。特异性分析显示,本方法对苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ有高的特异性,与柠檬黄、日落黄、分散橙11等无交叉反应。将本方法应用于食品中苏丹红检测,加标回收率为85.4%～102.5%,相对标准偏差为3.37%～6.75%。本方法具有操作简便、快速、结果易读等优点,适用于批量样品中苏丹红的现场快速检测。     

Immunoassays for Bowman-Birk and Kunitz Soybean Trypsin Inhibitors in Infant Formula

ABSTRACT: Because the consumption of soybean inhibitors of digestive enzymes in processed foods may have both beneficial and adverse health-related effects, reliable and rapid analytical methods for these inhibitors are needed. Monoclonal antibody-based sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) were developed for the 2 major soybean protease inhibitors, the Kunitz trypsin inhibitor (KTI) and Bowman-Birk inhibitor (BBI) of trypsin and chymotrypsin. The ELISAs had limits of quantification of approximately 1 and 3 ng/mL for BBI and KTI, respectively, and were used to measure active inhibitors in soy infant formulas. Results were compared with enzymatic analyses and demonstrated that most of the trypsin- and chymotrypsin-inhibitory activities of infant formula were due to constituents other than KTI and BBI. The sandwich ELISA for BBI was also effective in detecting soybean germplasm with atypically low levels of BBI.     

氟乐灵抗体的制备及其酶联免疫分析方法的建立

该研究针对农(水)产品中氟乐灵农药残留的问题,建立了间接竞争酶联免疫分析方法,快速检测氟乐灵农药.利用3,5-二硝基-4-氯-三氟甲苯与仲胺侧链氨基反应合成半抗原2C,采用碳二亚胺法将半抗原2C与牛血清白蛋白/卵清蛋白偶联合成完全抗原.通过免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体PcAb-2C,基于间接竞争酶联免疫分析方法原理对...     

基于单克隆抗体的双酚A半抗原直接包被的酶联免疫吸附法的建立

传统的人工抗原包被酶联免疫吸附法(ELISA)依赖疏水相互作用将人工抗原与酶标板结合,会影响半抗原的呈现与识别,且多采用多克隆抗体为检测抗体,这些均会导致检测灵敏度下降和标准化难度增大。该研究选择双酚酸(BVA)作为双酚A(BPA)的半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原免疫BALB/c小鼠,获得一株可分泌BPA单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株。利用3-氨丙基三乙氧基硅烷硅化处理酶标板,将BVA直接包被在酶标板上,建立了一种基于MAb的半抗原直接包被的BPA间接竞争ELISA法。该检测方法最低检测限IC10为0.29 ng/mL,半数抑制率IC50为5.4 ng/mL,水样中加标回收率为94.04%~102.31%。与人工抗原包被BPA ELISA检测方法(IC10:0.5 ng/mL,IC50:16.65 ng/mL,水样中加标回收率为89.72%~105.25%)相比,检测灵敏度显著性提高。     

液相色谱原子荧光光谱法分析测定水产动物及其制品中不同形态汞的含量

本文建立了液相色谱-原子荧光法测定水产及其制品中汞形态的检测方法,并对实验所用的流动相种类,流速,pH,进样体积,还原剂及载流(HCl)浓度进行优化,在14 min内可以实现无机汞(Hg2+)、甲基汞(MeHg)、乙基汞(EtHg)的分离。三种形态的汞均可以呈现良好的线性关系(r>0.9990),相对标准偏差(RSD)≤ 5.0%,以5、20、100 ng/mL这三个添加量在不同的样品基质中添加混合标准溶液进行加标回收实验,得到三种汞形态的回收率分别为80.1%~95.8%,92.1%~105%,80.3%~97.6%,实验测定检出限分别为0.021、0.014、0.018 mg/kg。用本方法检测鱼肉组织标准物质BCR463和ERM-CE464,测定值与标准值均吻合,进一步验证了本方法的准确性和可靠性。该方法前处理简单,提取效率较高,适用于实际水产及其制品中汞形态的分析测定。     

基于黑磷纳米片的荧光适配体传感器检测雌激素17β-雌二醇

建立一种定量检测雌激素17β-雌二醇（E2）的荧光适配体传感器。以黑磷晶体为原料,利用超声辅助液相剥离技术制备了黑磷纳米片（BPNs）作为荧光受体,基于6-羧基荧光素标记的适配体（FAM-Apt）与BPNs间的荧光共振能量转移机制构建了荧光适配体传感器,对BPNs浓度、FAM-Apt浓度和反应时间进行优化,并对自来水和牛奶样品进行测定。结果表明,该BPNs具有独立的片层结构且粒径均匀;在最优条件下,即BPNs和FAM-Apt的浓度分别为10 μg/mL和7.5 nmol/L时,该传感器对E2检测的线性范围为1.5～60 ng/mL,检测限为1.0 ng/mL。自来水和牛奶样品中加标回收率分别为91.2%～104.8%和87.5%～104.3%;相对标准偏差（RSD）为4.99%～10.53%和4.48%～11.24%。该方法简便、灵敏,30 min即可完成检测,特异性强,能够实现对实际样品中E2的定量检测。     

免疫亲和柱净化-高效液相色谱法检测两种饮料中双酚A含量

建立了免疫亲和柱净化-高效液相色谱荧光检测法(IAC-HPLC-FL)检测豆奶及橙汁饮料中的双酚A含量。采用甲醇提取、离心、磷酸缓冲溶液稀释后,经免疫亲和柱纯化,用1 mL甲醇-水(80:20,体积/体积)洗脱,应用高效液相色谱法检测。以C₁₈柱为分离色谱柱,甲醇-水(60:40,v/v)溶液为流动相洗脱,流速0.4 mL/min,柱温30℃,进样量10 μL,荧光检测器检测,激发波长228 nm,发射波长310 nm。结果表明:在1.0~300.0 ng/mL的浓度范围内,双酚A的浓度与峰面积呈良好的线性关系(相关系数R2=0.9998),检出限定为1 ng/mL。平均回收率为82.5%~104.6%,相对标准差为2.3%~6.4%。分别选取玻璃瓶装和塑料瓶装的豆奶和橙汁饮料进行双酚A含量检测,玻璃瓶装的豆奶和橙汁饮料中双酚A含量均小于检出限1 ng/mL,而某款塑料瓶装的豆奶和橙汁饮料检测出极其微量的双酚A,其双酚A含量分别为1.44、1.57 ng/mL,处于可接受水平。该方法简单快速、灵敏度高、重复性好,能够有效地分离和检测饮料中的双酚A,适用于豆奶和橙汁等饮料中的双酚A的测定。     

除草剂异丙甲草胺特异性抗体制备及免疫检测方法的建立

为检测食品中的异丙甲草胺农药残留,降低其对人体可能造成的危害,本文建立了基于抗体的酶联免疫分析方法。首先以除草剂异丙甲草胺、3-巯基丙酸为原料合成半抗原,经由氢核磁共振和质谱方法鉴定后,通过碳二亚胺（EDC）法将半抗原与载体蛋白偶联制备异丙甲草胺人工抗原,免疫新西兰大白兔获取抗体,通过棋盘滴定确定抗原抗体最佳稀释倍数,ELISA反应的抗体稀释液为PBS（1% PEG 6000）,药物稀释液为PBS（10%甲醇）,在此基础上建立间接竞争ELISA标曲,其IC50为14.64 ng/mL,检测限（limit of detection,LOD）为0.8 ng/mL,线性检测范围IC20~IC80为1.51~141.92 ng/mL。与14种结构类似物进行交叉反应,交叉反应率低于3%。向环境水样中添加异丙甲草胺,回收率为86.60%~102.16%,变异系数（RSD）为7.05%~13.30%。此抗体灵敏度高特异性好,可用于食品和环境中异丙甲草胺的监测。