~(60)Coγ射线照射人血淋巴细胞诱导p53相关基因mRNA表达水平的变化

采用不同剂量(0~10 Gy)60Coγ射线照射人外周血淋巴细胞,通过抽提mRNA,采用real-timePCR检测不同剂量照射后淋巴细胞中GADD45和CDKN1A基因mRNA表达水平的变化。筛选出最佳照射剂量(5 Gy)后,用该最佳照射剂量照射淋巴细胞,检测不同时间点(0~72 h)淋巴细胞中GADD45和CDKN1A基因mRNA表达水平的变化。结果表明,淋巴细胞中GADD45和CDKN1A基因mRNA的表达水平随照射剂量的增加而增加,并呈现出剂量效应关系。在5 Gy最佳剂量照射后,淋巴细胞GADD45基因mRNA表达水平随时间的推移不断增高,在8 h时达到最高,随后开始逐渐降低;淋巴细胞CDKN1A基因mRNA表达水平随时间的推移未见明显变化趋势。淋巴细胞系中GADD45和CDKN1A基因mRNA的表达水平与照射剂量均有较好的剂量效应关系,两者均有可能作为电离辐射的生物剂量计来估算受照剂量水平。     

^60Coγ射线照射淋巴细胞诱导PIG3和GADD45基因mRNA变化

用60Coγ射线照射正常人外周血永生化淋巴细胞系后,初步分析受照细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的改变状况,并探讨上述基因作为辐射生物剂量计的可能性及意义.用60Coγ射线照射淋巴细胞,采用不同剂量(0～10Gy)照射和照射后不同时间点(0～72h)收集细胞,抽提mRNA,用Real-time PCR检测细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的变化.结果表明,正常人外周血永生化淋巴细胞系中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随照射剂量的增高而增加,并呈现出剂量效应关系.5Gy剂量60Coγ射线照射后,淋巴细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随时间的推移不断增高,在8h时均达到最高,随后开始降低.PIG3和GADD45基因对辐射均较敏感,其表达具有良好的剂量效应和时间效应关系,但相比而言,PIG3的表达随照射剂量和照射后时间的变化更加显著,更有潜力作为生物剂量计以满足实际需要.     

辐射诱导Gadd45基因表达作为生物剂量计的实验室评估

为了考察电离辐照后人外周血中Gadd45基因表达的个体差异,评价Gadd45作为基因表达辐射生物剂量计的实用性,采集了27个健康人外周血进行60Co照射,提取白细胞mRNA,以β-actin作为内对照基因,建立了相对标准曲线法实时定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法,并以此方法探索辐照后Gadd45表达的剂量一效应关系.结果表明,0～2.5Gy剂量范围内,Gadd45的mRNA表达水平随照射剂量增加而上调,通过拟合建立了0～2.5Gy剂量范围内,Gadd45/β-actin相对表达量与照射剂量间的剂量-效应直线方程(y=0.216 0.258x,p<0.001,R2=0.650).发现Gadd45 mRNA表达水平在个体间存在一定差异,应用该剂量-效应直线方程,可以对0～2.5Gy照射剂量范围内的血液照射剂量作相对估算.     

~(12)C离子照射对MDM2和GADD45A基因表达的影响

12C离子照射人淋巴细胞株Peng-EBV,剂量率约为0.3~0.5 Gy/min,辐照剂量为0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0 Gy。采用荧光定量PCR技术检测不同剂量点、不同时间点的MDM2和GADD45A基因相对表达水平。结果表明,人淋巴细胞株受照后,MDM2和GADD45A基因相对表达水平整体升高;MDM2基因在0.5~2.0 Gy、照射后2和12小时,以及GADD45A基因在0.7~2.0 Gy、照射后2、12、24和48小时,相对表达水平均有随着照射剂量的增加而上升的趋势。     

辐射敏感基因Pig-a、Gadd45α和Hprt作为潜在生物剂量计的实验研究

为了提高对辐射遗传损伤效应的检测能力,同时建立一种快速简便的生物剂量估算方法,选择Piga、Gadd45α及Hprt 3个基因,运用其m RNA表达水平的变化,筛选可能作为电离辐射生物剂量计的辐射敏感基因。采用RT-qPCR检验非放射从业健康人群(对照组)和放射从业人员(暴露组)外周血中目的基因的相对表达量,分析辐射敏感基因本底表达量的平均值、波动范围和变异系数;应用不同剂量(0 Gy、0.10 Gy、0.25 Gy、0.50 Gy、1.00 Gy、2.00 Gy、5.00 Gy)的X射线照射健康成年人外周血,6 h后用RTqPCR检验目的基因的相对表达量,二项式曲线回归分析存在的剂量–效应关系。结果表明:Pig-a、Gadd45α基因在对照组中本底水平差异较小;Hprt基因本底水平差异较大,变异系数大于20%;Hprt基因在对照组中表达量高于暴露组;Gadd45α基因与Pig-a基因在对照组中的表达量低于暴露组,两组比较有统计学意义(p0.05)。Gadd45α、Pig-a基因表达量的本底水平与照射剂量存在剂量–效应关系,提示Pig-a基因与Gadd45α基因表达量的变化可能作为电离辐射生物剂量计应用。     

~(60)Co γ射线诱导线粒体复合体Ⅰ亚基因表达改变的研究

为探讨电离辐射对人淋巴细胞线粒体复合物Ⅰ亚基因表达的影响,采用1、3、5、8和10Gy~(60)Co γ射线分别照射指数生长期的人淋巴细胞永生化细胞株,8h后利用逆转录PCR(RT-PCR)摸索各基因的最佳实验条件,进而利用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)方法定量检测各基因表达变化,观察辐射对复合物Ⅰ基因表达影响的剂量效应关系;同时以5Gy~(60)Co γ射线照射人淋巴细胞后,分别于不同时间点(0.5、4、8、12、24、48和72h),同样通过RT-PCR和Real-timePCR方法检测各基因表达的变化,观察其时效关系。结果表明,在mRNA水平上,线粒体复合物Ⅰ基因表达总体上调。剂量效应关系方面,ND2基因在8Gy剂量范围内呈现出随剂量增加基因表达增强的趋势;时效关系方面,7种亚基均在5Gy剂量照射后4h左右表达增强最显著,且大部分基因可持续高表达至48或72h左右。说明电离辐射可以诱导人淋巴细胞线粒体复合物Ⅰ基因表达的改变,表达总体上调。     

电离辐射诱导EL-4淋巴瘤细胞G1期阻党政军及相关蛋白的表达

探讨X射线诱导EL－4细胞G1期阻滞及相关蛋白的表达。采用PI荧光标记 ,流式细胞术检测细胞周期的变化。用单克隆抗体免疫荧光标记,流式细胞术检测蛋白表达的变化。结果表明,2．0Gy和4.0Gy照射后12-72h,G1期EL－4细胞百分数显著高于假照射组（P＜0．05－p＜0.001).4.0Gy照射后EL-4细胞p53蛋白表达从照射后2h开始明显增高,持续至照射后24h(p＜0．05－p＜0．001）;p21蛋白表达在照射后2h开始明显增高,持续至照射后48h(p＜0.05-p＜0.001);GADD45蛋白表达在照射后2h开始明显增高,持续至照射后48h(p＜0．05－p＜－0．001）;MDM2蛋白表达在照射后4h开始明显增高,持续至照射后24h（p＜0.05-p＜0.01）。结果提示,中等剂量X射线照射可诱导EL－4细胞G1期阻滞。p53、p21和GADD45蛋白表达在电离辐射诱导EL－4细胞G1期阻滞中起重要作用。     

低剂量γ射线辐照对人淋巴母细胞基因表达转录谱的影响

为探讨低剂量电离辐射生物效应作用机制,本文研究了不同剂量单次辐照后,人淋巴母细胞基因表达转录谱的变化。采用0．1Gy、0．5Gy和1．0Gy剂量的γ射线照射人淋巴母细胞,未照射细胞为对照组。照射后4h提取细胞总RNA,用含有45033个基因的人类全基因组表达谱芯片检测分析。对差异表达基因进行层次聚类分析、基因本体论分析和通路分析,并用实时荧光定量PCR验证。结果表明,3个剂量组均上调表达的基因1330个,下调表达的基因1002个。基因表达量与吸收剂量相关的基因共18个,其中与剂量正相关的基因16个,负相关的基因2个。层次聚类分析结果表明,4个实验组中,0．1Gy和1．0Gy照射组差异表达基因相似程度最高。这些差异表达的基因涉及到多条通路,如细胞周期、p53信号通路、碱基切除修复、RNA转运和内质网蛋白加工等。实时荧光定量PCR检测结果表明,CASP9（caspase9）mRNA在照射后4h随吸收剂量表达变化与基因芯片检测结果一致。基因芯片筛选出的差异表达基因有助于阐明低剂量辐射生物效应作用机理,与辐射剂量相关的差异表达基因有可能成为低剂量辐射暴露的生物剂量计。     

~(60)Coγ射线诱导人淋巴细胞线粒体Cytb、ATPase6和ATPase8基因表达改变的研究

用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)探讨了60Coγ射线诱导人淋巴细胞线粒体Cytb、ATPase6和ATPase8基因表达的改变。以1、3、5、8和10Gy60Coγ射线分别照射指数增长期的人淋巴细胞永生化细胞株,8h后利用逆转录PCR(RT-PCR)摸索各基因的最佳实验条件,进而利用Real-timePCR的方法定量检测各基因表达变化,观察辐射对Cytb、ATPase6和ATPase8基因表达影响的量效关系;同时以5Gy60Coγ射线照射人淋巴细胞后,分别于不同时点(0.5、4、8、12、24、48和72h),通过RT-PCR和Real-timePCR方法检测各基因表达的变化,观察其时效关系。结果发现,在mRNA水平上,线粒体Cytb、ATPase6和ATPase8基因表达总体上调。Cytb和ATPase8基因在8Gy剂量范围内,呈现出随剂量增加基因表达增强的量效关系趋势;观察时效关系,发现5Gy剂量照射后4h左右,3种基因表达增强最显著,且Cytb和ATPase8基因分别持续高表达至48h和72h。因此,60Coγ射线可以诱导人淋巴细胞线粒体Cytb、ATPase6和ATPase8基因表达的改变,总体上呈现表达增强趋势。     

电离辐射诱导EL-4淋巴瘤细胞G_1期阻滞及相关蛋白的表达

探讨X射线诱导EL 1细胞G1期阻滞及相关蛋白的表达。采用PI荧光标记 ,流式细胞术检测细胞周期的变化。用单克隆抗体免疫荧光标记 ,流式细胞术检测蛋白表达的变化。结果表明 ,2 0Gy和 4 0Gy照射后 12 72h ,G1期EL 4细胞百分数显著高于假照射组 ( p <0 0 5- p <0 0 0 1)。 4 0Gy照射后EL 4细胞 p53蛋白表达从照射后 2h开始明显增高 ,持续至照射后2 4h ( p <0 0 5- p <0 0 0 1) ;p2 1蛋白表达在照射后 2h开始明显增高 ,持续至照射后 4 8h ( p <0 0 5- p <0 0 0 1) ;GADD4 5蛋白表达在照射后 2h开始明显增高 ,持续至照射后 4 8h ( p <0 0 5- p <0 0 0 1) ;MDM 2蛋白表达在照射后 4h开始明显增高 ,持续至照射后 2 4h ( p <0 0 5- p <0 0 0 1)。结果提示 ,中等剂量X射线照射可诱导EL 4细胞G1期阻滞。p53、p2 1和GADD4 5蛋白表达在电离辐射诱导EL 4细胞G1期阻滞中起重要作用     

p53及其下游基因在电离辐射诱导小鼠胸腺细胞G1期阻滞中的作用

采用流式细胞术和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测了Ｘ射线全身照射后的昆明系小白鼠胸腺细胞的细胞周期、ｐ５３及其下游基因表达的变化。结果表明：⑴２ＧｙＸ射线全身照射后４ｈ,小鼠胸腺细胞Ｇ１期细胞百分数明显高于假照射组,２４ｈ达峰值,持续至照射后４８ｈ;⑵２Ｇｙ照射后ｐ５３蛋白表达在照射后１～８ｈ明显增高,ｐ２１蛋白表达在照射后４～４８ｈ明显增高,而ＧＡＤＤ４５蛋白表达示未南明显变化;⑶２ＧｙＸ射线照射     

整体照射后胸腺细胞和脾细胞p16基因转录和蛋白表达的变化

研究X射线全身照射对小鼠胸腺细胞和脾细胞p16基因转录及蛋白表达的影响。采用Northern blot检测p16基因转录水平的变化;采用流式细胞术检测蛋白表达的变化。时程结果表明,2.0Gy照射后4-24h,胸腺细胞p16mRNA水平明显增高,8-48h P16蛋白表达显著增高(p<0.05-p<0.01);照射后4-8h脾细胞p16mRNA水平明显增高,24h P16蛋白表达显著增高(p<0.05)。量效结果表明,0.5-6.0Gy照射后,胸腺细胞p16mRNA水平呈剂量依赖性增高,P16蛋白表达在1.0-4.0Gy组明显高于假照射组(p<0.05-p<0.01);脾细胞p16mRNA水平亦增高,但增幅远低于胸腺细胞,P16蛋白表达在1.0-4.0Gy组明显高于假照射组(p<0.05-p<0.01)。X射线全身照射可诱导胸腺细胞和脾细胞p16基因转录及蛋白表达增高。p16表达参与整体照射诱导细胞G1期阻滞的分子调控。     

γ射线照射人肝细胞对BMP信号通路相关基因表达的影响

利用实时荧光定量PCR技术对人肝细胞株受不同剂量(0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 Gy)⁶⁰Co γ射线照后不同时间点(6、12、24 h)的骨形成蛋白(BMP)信号通路相关基因表达的剂量和时间效应关系进行研究。结果显示,不同剂量照后不同时间点,BMP信号通路相关基因骨形成蛋白2(BMP2)、骨形成蛋白7(BMP7)、骨形成蛋白受体1A(BMPR1A)、骨形成蛋白受体1B(BMPR1B)、骨形成蛋白受体2(BMPR2)的溶解曲线均为单峰,均为特异性扩增产物。在不同照射剂量点BMP2的表达水平与照后时间呈正相关;BMP7在0.1、0.2、0.5 Gy的表达水平与照后时间呈负相关,在照后12和24 h的表达水平与照射剂量呈正相关;BMPR1A在0.1、0.2、1.0 Gy的表达水平与照后时间呈正相关;BMPR1B在0.2、0.5、1.0 Gy的表达水平与照后时间呈正相关,在4.0 Gy的表达水平与照后时间呈负相关;BMPR2在照后12 h的表达水平与照射剂量呈负相关。     

辐射小鼠血细胞ATM、CDKNlA、DDB2和GADD45A基因表达分析

观察小鼠全身γ射线辐照不同剂量、照射后不同时间,外周血细胞DNA损伤修复相关蛋白基因表达变化,筛选具有指示生物受照剂量潜力的指标.BALB/c小鼠,以0.8和1.6Gy/min两种剂量率,分别进行0、2、4、6和8Gy不同剂量照射.照射后4、8、12、24和48h眼眶取血,AxyPrep试剂盒抽提全血细胞总mRNA,实...     

电离辐射对小鼠胸腺细胞p16、CyclinD1、CDK4表达的影响

采用流式细胞术 (FCM)检测了不同剂量X射线全身照射后 ,昆明种小鼠胸腺细胞p16、CyclinD1、CDK4蛋白表达的时程变化和量效关系。结果表明 ,2GyX射线照射后 8h小鼠胸腺细胞p16表达明显增高 ,2 4h达到峰值 ,持续至照射后 4 8h ,72h降至正常水平 ;CDK4表达水平在照射后8h明显降低 ,12h降至最低 ,照射后 4 8h恢复近正常水平 ;周期蛋白CyclinD1表达轻度下调。不同剂量 (0 .5 - 4Gy)照射后p16蛋白表达随着剂量的增加而增加 ,2Gy组与假照射组相比显著增多 (p<0 .0 1) ;CDK4蛋白表达在 2Gy照射后明显低于假照射组 (p <0 .0 1) ;CyclinD1表达在 0 .5 - 2Gy照射后可见下降趋势。结果提示 :p16 /CyclinD1/CDK4 /pRb通路在电离辐射诱导胸腺细胞G1期阻滞中可能起着十分重要的作用。     

热休克诱导表达的HSP70对X射线诱发淋巴细胞凋亡的影响

Ficoll法分离大鼠外周血淋巴细胞,于42℃、5％CO2培养箱中热休克处理90mill,采用流式细胞仪检测热休克预处理后恢复不同时间的淋巴细胞中HSP70的表达情况;采用流式细胞术AnnexinV／PI双标法检测经过热休克预处理的淋巴细胞经0．5Gy、1．0Gy、1．5Gy、2．0Gy、2．5Gy、3．0GyX射线辐照后细胞凋亡率的变化。以探讨热休克预处理后淋巴细胞中HSP70的表达情况和HSP70对X射线辐照后淋巴细胞凋亡率的影响。结果显示：1．淋巴细胞经热休克预处理后恢复1h,HSP70表达即有明显增加,4h达到高峰,可持续表达24h。2．热休克预处理诱导表达的HSP70可以抵抗X射线（1．0～3．0Gy）诱导的淋巴细胞凋亡。由此本工作可以得出结论,热休克预处理表达的HSP70可抵抗X射线诱发的淋巴细胞凋亡。     

碳离子辐射对人肝癌细胞SMMC-7721细胞周期和P53、MDM2及P21表达的影响

研究^12C^6＋离子辐照对体外培养人肝癌细胞SMMC-7721细胞周期和P53、MDM2及P21表达的影响。采用0、1．0、2．0、4．0、6．0Gy^12C^6＋离子束辐照细胞,用克隆形成法观察细胞存活情况;同时在辐照24h后用流式细胞仪检测细胞周期的变化,Western-blot检测细胞中P53、MDM2及P21蛋白表达情况。结果发现,重离子辐照后细胞存活率显著下降;1．0Gy、4．0Gy和6．0Gy照射组发生G0／G1期阻滞,而2．0Gy照射组出现G2／M期阻滞;Western-blot结果显示细胞辐照后MDM2的57kD蛋白表达水平无明显变化,而76kD蛋白表达水平随辐照剂量逐渐上升;P53和P21蛋白表达水平随辐照剂量增高。以上结果提示不同剂量的^12C^6＋离子束照射可激活SMMC-7721细胞不同的细胞周期检测点,其中G0／G1期阻滞与P53和P21蛋白以及MDM2截短体76kD蛋白的表达水平升高有关。