大肠杆菌肉碱脱水酶基因的克隆、测序及高效表达

［摘 要］目的 克隆并表达大肠杆菌肉碱脱水酶基因。方法 用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱脱水酶基因caiB，测定其DNA序列，将caiB基因重组到T7启动子控制下的表达载体pET－28a（＋）中，构建表达质粒pETCaiB，转化大肠杆菌BL21（DE3），用1mmol/L异两基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达。结果 克隆得到的肉碱脱水酶编码基因 caiB长度为 1221bp，与文献报道值相比,DNA序列有26个不同，氨基酸序列只有一个不同，即302位的丙氨酸变为苏氨酸。重组菌经IPTG诱导，可高效表达，SDS－PAGE分析表达蛋白相对分子质量约43000，表达产物含量占菌体总蛋白45％以上。结论 得到了高效表达肉碱脱水酶的重组菌，为制备L-肉碱创造了条件。     

甘油脱水酶α亚基基因的克隆、表达及纯化

目的克隆甘油脱水酶α亚基基因,构建表达载体,表达并纯化融合蛋白。方法采用PCR技术克隆甘油脱水酶α亚基gldA基因,并将其重组到含组氨酸标签的表达质粒pET-32a(+)中。将重组质粒经热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经金属螯合层析柱纯化,并进行Western blot分析及活性检测。结果重组表达质粒pET/gldA经酶切鉴定及序列分析,证明构建正确。转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达,融合蛋白相对分子质量约81000,与预期大小一致。经Western blot分析,纯化蛋白能与6-Histidine抗体产生特异性免疫反应。α亚基经检测,未显示活性。结论已成功获得甘油脱水酶α亚基蛋白,为进一步研究其生物学性能奠定了基础。     

巴斯德梭菌甘油脱水酶基因的克隆表达、纯化及酶学性质的研究

用聚合酶链反应(PCR)技术,从巴斯德梭菌(C lostridium pasteurianum)扩增出甘油脱水酶基因(dhaBCE),在大肠杆菌中高效表达,SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)电泳结果显示,分别有相对分子质量为66、21、16 kD三条特异性蛋白表达条带。用金属镍亲和层析及S-300H凝胶层析将重组蛋白进行分离纯化,所得纯酶的比活为4.26 U/mg。重组酶的最适反应温度42~44℃,最适作用pH=9.10~9.50,它对三个底物结构类似物的米氏常数(Km)值分别是:1,2-丙二醇0.38 mmol/L,甘油0.29 mmol/L,1,2-乙二醇2.0 mmol/L;对辅酶B12的Km值为0.22μmol/L。     

丁酸梭杆菌VPI 3266甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的克隆、表达

对丁酸梭杆菌VPI 3266的1,3-丙二醇代谢途径关键酶甘油脱水酶(DhaB)与1,3-丙二醇氧化还原酶(DhaT)进行了研究。甘油脱水酶基因dhaB全长3315bp,编码两个蛋白亚基,分别为甘油脱水酶的核心酶和脱水酶的再激活酶。前者全长2367bp,编码788个氨基酸,后者全长918bp,编码305个氨基酸。通过构建重组质粒,使其在大肠杆菌中实现了活性表达。1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT全长1166bp,编码388个氨基酸,属于NADP依赖的离子激活的醇脱氢酶家族III。通过IPTG诱导,在大肠杆菌中实现了高效表达,酶活达到5.2U/mL。并通过Ni亲和柱获得了电泳纯的蛋白。蛋白相对分子质量为4.19×10⁴。该酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为10.0,在pH值8.5~10.0范围内比较稳定,在45℃保温2h,酶活还残存50%。该酶以1,3-丙二醇为底物,在生理条件下的V_max和K_m分别为29.2U/mg和19.8mmol/L。     

人肌红蛋白基因的克隆、表达及其抗体制备

目的克隆、表达人肌红蛋白基因,并制备人肌红蛋白多克隆抗体。方法应用RT-PCR方法从人骨骼肌总RNA中扩增肌红蛋白基因(hMb)编码序列,克隆入原核表达载体pRSETc中,并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达。表达产物经亲和层析和凝胶层析纯化。纯化蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,并用Westernblot检测其特异性。结果测序表明RT-PCR所得的肌红蛋白基因hMb序列与GenBank(NM203377)中报道的序列一致。该基因在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化,获得电泳纯的蛋白。重组人肌红蛋白的表达水平达12.8%。每升发酵液中可获得纯化的目的蛋白6.438mg。Western blot分析表明该蛋白为融合有6个His的hMb蛋白。ELISA法测得抗体效价为1∶12800,Western blot证实其具有较好的特异性。结论已成功克隆人肌红蛋白基因,在大肠杆菌中获得了可溶性表达,并制备了抗人肌红蛋白的多克隆抗体。     

人热休克蛋白70基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆人热休克蛋白70(HSP70)基因,构建其原核高效表达载体。方法将PCR扩增的HSP70基因克隆到原核高效表达载体pET-28b中,转化大肠杆菌JM109。挑选阳性克隆,提取质粒pE28b70F,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达目标蛋白。结果在大肠杆菌中成功表达了HSP70,表达量约占细菌总蛋白的22·3%,其中可溶性目标蛋白占上清总蛋白的12%。Westernblot表明该目标蛋白具有与鼠抗人HSP70单抗特异结合的抗原活性。通过Ni2+-NTA亲和柱,从1L诱导产物中纯化出约1520mg重组蛋白,纯度在80%以上。结论已成功表达HSP70,为进一步研究其生物学功能和作用机制奠定了基础。     

中国人MBL基因编码区的克隆与原核表达

目的克隆中国人MBL基因编码区序列,并在原核细胞中表达。方法提取肝总RNA,RT-PCR扩增MBL编码区序列,并克隆到pGEM-T-easy载体上,再亚克隆到pET-30(a)上。诱导表达重组MBL,并通过SDS-PAGE检测表达情况,表达蛋白经初步纯化后,用ELISA及点杂交试验检测其免疫原性。结果克隆得到长747bp的MBL编码区序列,与GenBank中的MBL序列同源性在99%以上。重组MBL相对分子质量约为36000,以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白量的20%左右,表达蛋白经初步纯化,纯度可达95%以上。ELISA检测显示重组MBLA490值与阴性对照差异有显著意义(10倍以上),点杂交检测结果为阳性。结论已成功克隆中国人MBL基因的编码区序列,并在大肠杆菌中表达,表达产物与天然MBL具有相似的免疫原性。     

HIV-1 Vif基因的克隆与原核表达

目的克隆HIV-1Vif基因编码区序列,并在原核细胞中表达。方法构建原核表达载体pMRI,将Vif基因序列克隆至该载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,菌体裂解后获得特异性表达蛋白,用组氨酸标签特异性亲和树脂分离纯化该蛋白,并经SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果表达质粒pMRI-Vif经双酶切,可见约600bp的Vif基因片段,测序结果证明质粒构建正确。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了可溶性Vif蛋白,纯化后经凝胶自动扫描分析,纯度达85%以上,蛋白浓度约为1g/L。纯化产物具有良好的抗原特异性。结论在大肠杆菌中高效表达了可溶性Vif蛋白。     

人体β-防御素-3突变基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的对人体β-防御素-3基因进行定点突变,并在E.coli中表达。方法从人正常皮肤组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增编码β-防御素-3成熟肽的cDNA,测序正确后,设计含突变位点的引物,用PCR重叠延伸法对β-防御素-3成熟肽cDNA进行定点突变,将突变产物克隆至pUC18,并在E.coli中融合表达。结果测序结果表明,经RT-PCR所得的β-防御素-3成熟肽序列与GenBank中报道的序列完全一致。经过突变,β-防御素-3成熟肽第29位谷氨酰胺密码子由CAG突变为精氨酸密码子CGA,其余核苷酸序列均未发生变化。将突变β-防御素-3基因在E.coli中诱导表达后,可见突变β-防御素-3蛋白表达。结论已成功克隆并表达了β-防御素-3突变体基因。     

布鲁菌BP26基因的克隆、表达及纯化

目的克隆布鲁氏菌BP26基因,并在大肠杆菌中高效表达及纯化BP26蛋白。方法提取布鲁氏菌基因组DNA,用PCR扩增出BP26基因,并克隆到pMD18-T载体上,测序正确后,再亚克隆至pET-28a(+)载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经组氨酸结合树脂柱纯化,并对纯化后的表达产物进行Western blot鉴定。结果重组质粒pETBP26经Nde I与Sal I酶切后,可见大小分别为5400和700bp的片段,与理论值相符。转化大肠杆菌BL21(DE3)后,37℃诱导4h,经SDS-PAGE分析,高效表达出带有His-tag标签的融合蛋白BP26,纯化后的蛋白纯度达96%,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性。结论已成功克隆了BP26基因,且表达并纯化了布鲁氏菌BP26蛋白。     

木瓜凝乳蛋白酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的构建木瓜凝乳蛋白酶(CP)的表达载体,并在大肠杆菌中表达。方法从生番木瓜中提取mRNA后进行反转录,得到木瓜凝乳蛋白酶的cDNA,PCR产物克隆到pET22-b(+)载体中,重组质粒转化至大肠杆菌BL21,进行诱导表达及表达产物的检测。结果表达产物的SDS-PAGE显示单一条带,相对分子质量约为26000。Western blot表明表达产物可与抗木瓜凝乳蛋白酶特异性抗体结合。结论CP基因已成功在大肠杆菌中克隆表达,为进一步纯化和动物实验奠定了基础。     

大肠杆菌丙酮酸脱氢酶的克隆与表达优化

为了在大肠杆菌中表达大肠杆菌丙酮酸脱氢酶,用PCR法从大肠杆菌总DNA中克隆了pdc基因,将其插入载体pGEX-KG后转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下实现了表达.通过对表达条件的优化,在TB M9(1∶1)培养基中,33℃下使用终浓度0.5 g·L-1的乳糖诱导4 h,重组大肠杆菌丙酮酸脱氢酶的表达量可占全菌蛋白的45%左右,比未优化前提高了约20%,同时大大降低了成本.     

重组人BAFF_(134～285)的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的克隆人TNF家族的B细胞激活因子(BcellactivatingfactortotheTNFfamily,BAFF)胞外区cDNA,并进行高效表达和纯化。方法提取人新鲜扁桃体组织总RNA,经RTPCR扩增编码人BAFF胞外区134～285氨基酸残基cDNA,经序列测定后,克隆至pQE80L载体中,并转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达及Ni2+NTA柱层析纯化目的蛋白,最后经SDSPAGE和Westernblot检测。结果RTPCR扩增得到了459bp的cDNA片段,序列分析与GenBank中报道的编码人BAFF134～285的cDNA序列一致,SDSPAGE及Westernblot证实表达蛋白确实为6×HisBAFF134～285融合蛋白,并存在于包涵体中。结论利用大肠杆菌可高效表达rhBAFF134285,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。     

汉坦病毒SEO型S基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的构建汉坦病毒SEO型S基因原核表达载体。方法应用RT-PCR方法扩增汉坦病毒SEO型的YZG-Changchun株S基因,克隆至pMD18-T载体中,经酶切鉴定及PCR分析后,定向克隆入原核表达载体pET-28a中,转化E.coliRosetta,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析外源蛋白的表达情况。结果表达载体经双酶切和测序证明构建正确。IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导4.5 h时,S基因在原核细胞中得到了高效表达,表达的蛋白占菌体蛋白总量的37%,纯化后的蛋白具有良好的抗原活性。结论已成功构建了汉坦病毒SEO型S基因原核表达载体,并得到高效表达。     

大肠杆菌色氨酸操纵子基因的克隆与表达

目的克隆并表达大肠杆菌色氨酸操纵子基因,提高其酶活性。方法利用PCR方法,从大肠杆菌31884基因组中直接克隆出色氨酸操纵子,并将其连接到原核表达载体pET-22b(+)中,构建重组质粒pET-22b(+)-Trpoperon,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析,并测定酶活性。结果凝胶电泳可见PCR扩增产物大小约为7000bp,SDS-PAGE鉴定目的蛋白分别得到了表达,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性分别比对照提高了2.7和3.2倍。结论已成功构建了重组表达质粒pET-22b(+)-Trpoperon,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性在大肠杆菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定了基础。     

人白细胞介素18的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的　在大肠杆菌中高效表达IL 18。方法　从人外周血中提取RNA ,用RT -PCR方法得到IL 18的cDNA ,双酶切将其插入pET 2 3(b) + 载体中 ,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性菌落 ,提取质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达。结果　所获得人IL 18克隆 ,经测序与GenBank报道的完全一致。所表达的产物经SDS -PAGE显示在相对分子质量 2 0 0 0 0处出现一条特殊条带 ,与预期的分子量一致。结论　已成功获得了人IL 18克隆并在大肠杆菌中表达     

人Leptin基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆Leptin基因,构建其重组表达菌株,并对表达产物进行免疫学鉴定。方法利用RT-PCR方法从脂肪细胞RNA中扩增出人瘦素前体(pre-Leptin)的cDNA片段和去信号肽序列的Leptin成熟基因片段,并插入pET32a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达重组人瘦素(rh-Leptin)的菌株。结果DNA序列分析显示获得的pre-Leptin和成熟基因片段的序列与预计序列一致,菌株诱导后经SDS-PAGE检测,rh-Leptin表达量达菌体总蛋白的40%以上。Western blot分析显示重组Lep-tin具有免疫学活性。结论已获得高效表达Leptin的重组菌株。     

鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的　以鸡脾细胞mRNA为模板扩增编码鸡IL 18成熟蛋白的cDNA ,并在大肠杆菌中进行表达。方法　用PHA和LPS激活的AA肉鸡脾细胞 ,提取mRNA ,以RT PCR法扩增出编码鸡IL 18成熟蛋白的cDNA并测序 ,与pET 2 8b载体构建重组质粒 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS中表达 ,用SDS PAGE检测表达产物。结果　所克隆的核苷酸片段包含了鸡IL 18全部成熟蛋白编码基因 ,其大小为 5 0 7个核苷酸 ,编码 16 9个氨基酸 ;构建的重组表达载体在大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS中表达出相对分子质量为 190 0 0的重组蛋白。结论　已成功克隆和表达了鸡IL 18成熟蛋白基因。     

人巨细胞病毒gp52蛋白基因片段的克隆及表达

目的为获得高表达人巨细胞病毒 ｇｐ５２蛋白基因的工程菌。方法通过计算机分析,筛选出巨细 胞病毒蛋白ｇｐ５２中优势抗原决定簇,用ＰＣＲ技术扩增克隆了含强抗原决定簇的基因片段。将克隆的基因片段插 入表达载体ｐＥＴ２８（ａ）内,转化大肠杆菌ＢＬ２１,经Ｓｅｐｈａｒｅｒｙ１ Ｓ－２００分子筛及Ｎｉ－ＮＴＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ螯合层析进行纯化。结 果获得的工程菌所表达的 ｇｐ５２蛋白片段相对分子质量约为 ２１ ０００,约占菌体可溶性蛋白的 ２８％。获得的表达蛋 白纯度达９５％,电泳显示单一条蛋白带,ＥＬＩＳＡ分析证实有较强的抗原性和较好的特异性。结论本研究对人巨细 胞病毒感染,尤其是对孕妇及献血员等感染的检测有重要意义。