牛奶主要过敏原β-乳球蛋白的一基因片段的克隆、表达、纯化及抗原性鉴定

目的 克隆并表达牛奶中主要过敏原β-乳球蛋白(β-LG)的一基因片段,并检测其杭原性.方法 利用RT-PCR技术克隆β-LG蛋白基因片段,测序后将目的片段克隆入原核表达质粗pET载体,转化至大肠杆菌origami,经IPTG诱导表达,获得重组β-LG片段蛋白.用Nit~2+亲和层析柱纯化,用Western blot和ELLSA检测重组蛋白与牛奶过敏患者血清IgE的结合活性.结果 克隆获得β-LG片段蛋白,其开放阅读框基因为264 by(含终止密码子),编码87个氨基酸.获得的重组β-LG片段蛋白既以包涵体形式存在又以可溶性形式存在,用可溶性的蛋白进行纯化,经Western blot和ELISA检测具有较好的抗原性.结论 成功地克隆和表达了β-LG的--基因片段,为后续牛奶的免疫原性研究提供参考,也为研制牛奶主要过敏原的单克隆抗体和制备其主要过敏原的检测试剂奠定了基础.     

沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草

  目的  本研究利用dsRNA技术沉默2b基因,获得烟草品种云烟85的T₁代转基因抗CMV株系。  方法  构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b（r）-In-2b（i）,以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草（Nicotiana tabacum）品种云烟85。  结果  抗性筛选获得112株T₀代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T₀代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病。Tas-ELISA检测表明,T₀代抗病烟株的病毒积累量显著低于感病烟株。选取10个T₀代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T₁代抗病性,发现部分T₁代烟株发生一定比例的抗感分离,T₁代抗性株率为46.7%~100%。Real-time PCR检测T₁代烟株,发现T₁代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显著低于感病烟株。  结论  基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系。      

转复制酶基因抗病毒烟草的研究

将携带烟草花叶病毒(TMV)54KD蛋白基因和黄瓜花叶病毒(CMV)3'端缺失0.9kb的复制酶基因片段的植物表达载体pBICT,通过很痛农杆菌311SE系,利用叶圆盘法转化烟草,在含有卡那霉素的选择培养基上诱导生芽、生根,得再生植株53株。移入大田后,选取5株,提取植物总DNA,Southern杂交检测,结果5株中均有复制酶基因的整合,且转基因植株在大田中表现了良好的抗TMV和CMV能力。      

低双乙酰啤酒酵母工程菌的构建

利用PCR技术以啤酒酵母QY的染色体为模板扩增出含有乙酰羟酸合成酶（AHAS）基因ILV2的片段，将ILV2基因的内部EcoRI片段连接到整合载体YIp5上，并在该载体的Bam HI-SalI位点插入铜抗性基因CUP1－MT1，构建了YIpCE质粒，将其转化啤酒酵母QY，所得到的转化子AHAS酶的活力比受体菌QY降低75％左右， 在发酵测试中，转化了产生双乙酰的量比原始菌株降低30％。     

兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒弱毒疫苗的创制

黄瓜花叶病毒（CMV）和马铃薯X病毒（PVX）在烟草中普遍存在、危害严重，对烟草产业健康发展有重大影响。为预防田间烟草上黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒，需要构建能够同时预防CMV和PVX的弱毒疫苗。本研究首先构建了CMV RNA2的2b蛋白提前终止突变体pCB301-CMVFny-R2-2bPT，在此突变体中插入200 bp的PVX保守序列（5890-6089）获得突变体质粒pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089。该突变体质粒与含野生型CMVFny RNA1和CMVFny RNA3的质粒等量混合后通过农杆菌浸润方法分别接种中烟100、红花大金元和林烟草，接种后烟草症状与野生型CMVFny-RNA1+RNA2+RNA3混合接种烟草症状相比显示弱侵染性。疫苗遗传稳定性检测证实疫苗载体中插入的PVX 200 bp保守片段稳定存在，CMV和PVX强毒株系攻毒试验表明该弱毒疫苗在中烟100上对CMV和PVX同时具备交叉保护作用。     

基于蛋白损伤污染物毒性评价的luxCDABE生物发光载体的构建

目的构建含完整lux CDABE基因盒的PUCD-dna K重组发光载体,用于对蛋白损伤污染进行毒性评价。方法用PCR法从大肠杆菌W3110中扩增dna K基因,将PCR产物测序后与Gen Bank中dna K序列进行BLAST比对。将dna K片段及PUCD615载体均用Bam H I、Eco R I双酶切,连接后电转化导入宿主菌JM109。挑取克隆,提取质粒用PCR鉴定,阳性克隆再进行测序。结果 dna K基因PCR扩增产物得到206 bp片段,PCR产物测序后BLAST比对同源性为100%,表明扩增序列正确。PUCD-dna K测序结果表明序列含有dna K基因及PUCD615载体上的基因,且与载体连接处正确地出现对应的酶切位点。结论 PUCD-dna K载体构建成功。含lux CDABE全基因盒作为报告基因的载体PUCD615可克服lux AB必须外加底物(脂肪醛)才能实现生物发光的缺点,通过优化连接及转化条件,可将大片段的PUCD615载体与短片段的插入序列连接成功,构成重组载体。     

植物乳杆菌P8亚油酸异构酶基因及其上游非编码区的克隆与分析

依据GenBank中已公布的亚油酸异构酶基因,设计一对特异性引物,PCR扩增该基因后,克隆到T载体上并转化到Trans1-T1感受态细胞中。经菌落PCR鉴定和序列分析表明,亚油酸异构酶基因大小为1720bp。该基因与植物乳杆菌AS1.555(DQ227322)的同源性达到99%,与泡菜植物乳杆菌(DQ010331)的同源性达到89%。该基因序列在GenBank上注册,编号为HM569265,对其进行生物信息学分析发现,基因中含有一段低复杂性区域。分析乳酸杆菌(CP001617)基因组全序列,设计了亚油酸异构酶基因上游非编码区805bp片段的特异性引物,PCR扩增该片段后将其克隆到T载体上并转化到Trans1-T1感受态细胞中。经菌落PCR鉴定后,进行序列分析和生物信息学的初步分析,预测出该片段中有12个基序,以及6个转录调控元件。     

通过基因工程获得高抗黄瓜花叶病毒的NC89植株

将黄瓜花叶病毒(CMV)的卫星RNA 基因和外壳蛋白(CP)基因同时插入植物表达载体 ROKII 质粒,构成嵌合基因表达盒,通过叶盘转化法导入 NC89单倍体植株,对转化植株进行了 CMV 人工攻毒试验,结果表明,其 CMV 抗性较对照 NC89有明显提高,其中约10%在攻毒90天后病级仍低于2级,个别株完全不发病。     

启动子替代构建克雷伯氏菌普鲁兰酶高产菌株

应用启动子替代技术将普鲁兰酶产生菌克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)HN9的普鲁兰酶基因的启动子替换为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的P43启动子,构建高产酶菌株。通过融合PCR,将由3个DNA片段融合得到启动子替代同源重组片段,该3个DNA片段分别是带有克雷伯氏菌普鲁兰酶基因启动子上游部分同源序列的四环素抗性基因(Tet)的上游片段Tet1、带有枯草芽孢杆菌P43启动子部分上游同源序列的Tet下游片段Tet2和带有克雷伯氏菌普鲁兰酶基因上游同源序列的P43启动子部分序列的Pro。经电转化将同源重组片段导入克雷伯氏菌中,转化子的普鲁兰酶基因表达水平比出发菌株提高10.23~11.45倍,摇瓶发酵酶活力提高8.97~10.52倍。结果表明,应用高效组成型启动子P43替代原始菌株的普鲁兰酶基因的启动子能够显著提高普鲁兰酶基因的表达量和发酵酶活力。     

多基因DNA条形码鉴定6 个鳗鱼物种

建立6?种鳗鱼的物种多基因DNA条形码精准鉴定方法。以鳗鱼DNA为模板,采用3?对通用引物对6?种鳗鱼的3?个基因（16S rRNA、Cyt b、COⅠ）部分DNA片段进行聚合酶链式反应扩增、测序,结果6?种鳗鱼各获得3?条16S rDNA（638～643?bp）、Cyt?b（464～466?bp）、COⅠ（705～707?bp）基因部分DNA序列,从中选取各物种序列同源的片段设计3 对新引物对6 种鳗鱼的16S rRNA、Cyt b、COⅠ基因部分DNA片段进行PCR扩增,其产物大小分别为504～507、400、609?bp,再从各片段中筛选出具有6?种鳗鱼物种特异性强的、碱基数分别为262、280、300?bp的3?条DNA片段序列,作为6?种鳗鱼物种的3?个基因的标准DNA条形码,应用DNAMAN?V6软件进行同源性分析,并通过GenBank数据库的比对验证,制定了供检测实践用的同源率判别指标,建立鳗鱼物种的多基因条形码检测方法。应用该方法对30?个待检鳗鱼样品进行检测,结果表明,各样品基于3?个基因DNA条形码的比对,符合同源率指标,物种判别结果互相吻合,从而精准判别样品的所属物种。该方法稳定、精准、易于操作,可应用于6?种鳗鱼的物种鉴定,值得推广。     

烟草上马铃薯Y病毒的RT-PCR检测

本文根据已报道的PVY CP基因序列,设计合成了2套扩增PVY CP基因全序列和中间部分序列的寡核苷酸引物,用两套程序分别对马铃薯Y病毒普通株系(PV YO)和马铃薯Y病毒坏死株系PV YN) CP基因进行RT-PCR扩增,结果分别得到了与预期大小一致的804和301bp片段,健康植株对照中未扩增到任何产物,建立了RT-PCR检测烟草上马铃薯Y病毒的程序。      

病毒诱导的基因沉默防控烟草马铃薯Y病毒病研究

  背景  病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）是植物抗病毒侵染的一种自然机制。  方法  以马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）脉坏死株系（PVYN）的外壳蛋白（coat protein, CP）基因为靶向序列,构建烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默表达载体pTRV2-CP,转化农杆菌GV3101后,与pTRV1-GV3101混合成TRV: : CP（OD₆₀₀ 0.4~0.6）喷施处理剪叶后的烟苗,测定其侵染效率。人工接种PVY于对照及TRV: : CP处理的烟苗,RT-qPCR检测、表型观察和小区试验评价TRV介导的VIGS体系对PVY侵染的沉默效果。  结果  ① 与TRV: : 00相比,接种PVY 35 d时,TRV: : CP处理的烟株中PVY累积量减少了72.8%;②VIGS表达载体45 d内能有效表达;③温室盆栽和田间小区试验TRV: : CP处理对PVY防治效果分别达到85.12%和73.08%。  结论  研究建立的VIGS体系能够沉默PVY CP基因的表达,有效防治烟草马铃薯Y病毒病,为PVY的防治提供了新的方法。      

黔江烟田病毒与周边作物及杂草携毒关系分析

为明确烟田烟叶携带病毒与周边作物和杂草携带病毒的亲缘关系,利用RT-PCR克隆烟田烟叶与周边杂草和作物携带病毒外壳蛋白（CP）,通过MEGA序列比对分析黔江烟田烟叶和周边杂草与作物所带病毒种类及其亲缘关系。结果显示,黔江地区烟草感染病毒有烟草普通花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）和马铃薯Y病毒（PVY）;在烟田周边杂草和作物番薯、四季豆、糯米团、三悬叶钩草、杂草中检测到了TMV;自番薯、四季豆、蓬蘽、千里光、糯米团、三悬叶钩草中扩增出CMV;自番薯、四季豆、假酸浆、杂草中扩增出了PVY。进化关系分析显示,三悬叶钩草、四季豆、糯米团以及番薯为黔江烟田烟叶TMV的主要来源,蓬蘽为烟叶病毒病CMV的侵染源,假酸浆为烟田PVY的主要来源。     

河南烟草主要病毒发生种类及侵染类型分析

为进一步明确河南烟区主要病毒种类及侵染类型,2020年从河南9个烟区分别采集疑似烟草普通花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)和烟草蚀纹病毒(TEV)侵染的烟草样本共407份,分别利用上述4种病毒的特异性引物进行单重RT-PCR病原检测。检测结果表明,河南烟区病毒病样本的总检出率为98.28%,其中,检出率最高的是CMV为89.19%,其余依次为TMV 63.88%、PVY 28.99%和TEV 24.32%。侵染类型分为单一病毒侵染和复合病毒侵染,单一病毒侵染率为23.34%,该侵染类型中CMV所占比例最高,为16.71%;复合病毒侵染率为74.94%,复合病毒侵染类型中CMV+TMV所占比例最高,为36.86%,其次分别为CMV+TMV+PVY和CMV+TEV+PVY两种侵染类型,侵染比例均是7.62%。因此,CMV是2020年河南烟区的优势病毒,田间侵染以复合病毒侵染为主,侵染类型主要有CMV+TMV、CMV+TMV+PVY及CMV+TEV+PVY。     

安徽省烟草病毒种类的血清学鉴定

2007 年从安徽亳州、宣城和芜湖等地的烟草产区共采集181 个表现明显病毒病症状的病样,采用Tas-ELISA 和间 接ELISA 方法共检测112 个病样,其中分别检测宣城黄渡、宣城金坝、芜湖红杨、芜湖三元各16 个病样以及亳州陈店48个病样。结果显示,安徽宣城32 个病样中,TMV、CMV、PVY 的阳性率分别为91%、3%、50%,芜湖32 个病样中,TMV、CMV、PVY 的阳性率分别为66%、0、75%,说明宣城、芜湖烟区侵染烟草的病毒种类以TMV、PVY 为主,CMV 为零星侵染;亳州48 个病样中,TMV、CMV、PVY 的阳性率分别为100%、48%、8%,说明亳州烟区侵染烟草的病毒种类以TMV、CMV 为主,PVY 侵染发生较少。     

马里兰烟病毒病症状类型、毒源种类及病毒侵染构型研究

湖北五峰县是中国唯一的马里兰烟种植区。2011年在湖北马里兰烟产区进行病毒病发生情况大田调查,发现主要有花叶、畸形、脉坏死、蚀刻等4种症状类型,幵采用指示植物法对主要症状类型所含病毒的种类进行了鉴定;对采集的57份病毒病样本采用DAS-ELISA进行病毒种类的鉴定。结果表明,发生在马里兰烟上的烟草病毒种类包括TMV、CMV、PVX、PVY 和 TEV,TMV 检出率最高,PVY 次之;以2种或2种以上病毒复合侵染方式为主,其中 TMV＋PVY、TMV＋CMV＋PVY共存方式较为常见。     

湖南烟草病毒病种类检测与系统进化分析

为明确湖南烟草病毒病的种类及分布状况,利用小干扰RNA（siRNA）测序和反转录PCR（RT-PCR）对湖南烟区样品进行检测,分析主要病毒侵染类型,最大似然法构建系统进化树确定分类地位。结果表明,湖南烟草受到烟草普通花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）、番茄斑驳花叶病毒（Tomato mottle mosaic virus,ToMMV）、地黄花叶病毒（Rehmannia mosaic virus,ReMV）和辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus,PMMV）等6种病毒的侵染,其中ToMMV、ReMV、PMMV首次被检测到,TMV、CMV和PVY是主要病毒,TMV为优势病毒,复合侵染是主要侵染类型,复合侵染率为71.29%;湖南烟草上的TMV分离物形成3个独立组系,CMV分离物属群组I的亚组IB,PVY分离物属PVY^NTN-a、PVY^E和PVY^SYR-I株系。本研究摸清了湖南烟草病毒种类、分布及侵染情况,明确了TMV、CMV、PVY的分类地位,为病毒病的防治提供了理论依据。     

陕西烟草病毒病毒原鉴定及种群区系分布

2001年在陕西省烟区采集了165个样品,经过生物学测定、血清学反应(琼脂双扩散法和酶联免疫吸附法)和电镜观察,鉴定出5种为害烟草的病毒。其中烟草普通花叶病毒(TMV)34份、烟草蚀纹病毒(TEV)32份、黄瓜花叶病毒(CMV)31份、马铃薯Y病毒(PVY)16份、烟草环斑病毒(TRSV)4份,分别占总标样的20.61%、19.39%、18.79%、9.7%和2.4%。TMV和CMV、TMV和TEV、TMV和PVY复合侵染各为35、2和11份,分别占总标样的21.21%、1.2%和6.67%。TEV和PVY在某些烟区有明显上升的趋势。     

德阳地区晒烟病毒种类及发生规律研究

病毒病在德阳晒烟上每隔1-2年大发生一次,造成重大经济损失。1989-1991年,采用ELISA等手段,鉴定了该地区晒烟病毒标样722个。结果表明,烟草普通花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯病毒Y(PVY)是晒烟上的3种主要病毒。在不同年份或同一年份的不同时期,这3种病毒发生的比例各不相同。重病年以蚜传的CMV、PVY为主。烟草病毒病流行与否与2、3月的气温及雨日关系密切。调查了该地区的毒源植物,提出了以治蚜避蚜、提高烟株抗病力为中心的综合防治措施,取得了明显的防治效果。