应用聚合酶链反应检测食品中肠毒素大肠杆菌

应用聚合酶链反应对食品样品中肠毒大肠杆菌热敏性肠毒素和耐热肠毒素基因进行扩增，两对引物从ＥＴＥＣ的ＬＴ和ＳＴ基因中分别扩增出３１４ｂｐ和２３７ｂｐ的ＤＮＡ片段，均能与相应的ＬＴ和ＳＴ基因探针杂交，酶切分析表明，不同菌株扩增的片段为均一的ＬＴ基因和ＳＴ基因的ＰＣＲ产物１２８份食品样品中ＥＴＥＣ的污染情况进行了测定，三种基因型（ＬＴ，ＳＴ，ＬＴＳＴ）的ＥＴＥＣ从样品中鉴定出。     

进口转基因抗Basta~(TM)除草剂油菜籽检测方法研究

建立了从油菜籽中提取总ＤＮＡ和用ＰＣＲ技术检测外源基因的方法，用该方法从进口油 菜籽中检出外源的草丁膦乙酰转移酶基因（ＰＡＴ）、新霉素磷酸转移酶基因（ＮｐｔＩＩ）、花椰 菜花叶病毒３５Ｓ启动子（ＣａＭＶ ３５Ｓ）。     

猪伪狂犬病毒环介导等温扩增技术检测方法的建立

为建立通用性猪伪狂犬病毒(PRV)环介导等温扩增快速检测方法,本实验根据PRV gB基因序列的保守区段设计四套特异性引物,基于环介导等温扩增技术引入环引物,筛选出特异性引物PRV-1,对其特异性、灵敏度进行评估,进行临床样本和人工干扰样本检测试验,并与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测结果进行比较分析。结果表明该检测方法能够特异性的检出PRV的存在,具有良好的特异性;灵敏度检测下限为10fg/μL;且本文建立的检测方法其结果与临床样品和人工干扰样本qPCR检测结果具有高度的一致性。因此,本实验建立的PRV环介导等温扩增检测方法特异性强、灵敏度高,具有较好的稳定性,并且操作安全、简便、高效,该方法的建立为猪伪狂犬病的快速诊断和基层检疫提供了新的选择。     

猪瘟病毒实时荧光LAMP检测方法的建立

为做好猪瘟的早期诊断和及时预防,建立一种快速检测猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的实时荧光环介导等温扩增方法。试验利用Primer Explorer version 4针对CSFV的5`UTR非编码区设计4组引物,筛选出最佳引物后建立CSFV的实时荧光环介导等温扩增检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度以及适用性进行验证。结果显示,本试验建立的实时荧光环介导等温扩增方法对128份临床样本和22份猪瘟活疫苗人工干扰样本的检测结果与实时荧光聚合酶链式反应检测方法一致。该方法仅对猪瘟病毒有扩增反应,且最低检测浓度为10 fg/μL,对猪伪狂犬病毒、高致病性高致病型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型等8种病原无扩增反应。本试验建立的实时荧光环介导等温扩增方法特异性强、灵敏度高,检测效果好,操作简单,适用于CSFV临床样本的快速检测。     

随机扩增多态性DNA(RAPD)技术不适合烟草品种的鉴定

随机扩增多态性ＤＮＡ多态性是基于聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术的新型技术，它以随机寡聚核苷酸（通常为１０个碱基对）作为引物进行ＰＣＲ扩增，通过扩增条带的多态性反映物种整个基因组随机分布的ＤＮＡ水平上的差异。其特点是：１、引物的随机性，可在对被检对象无任何分子生物学资料的情况下对其基因组进行分析，而且简便快捷经济，适合对大量样品进行快速鉴定。２、由于反应条件的低严紧性，其精确性受到模板质量、浓度，离子浓度等反应条件的影响，重复性差。用７个白肋烟，６个香料烟和６个烤烟品种的鲜叶片提取基因组ＤＮＡ，井利…     

采用狂犬病毒G基因原核表达的间接ELISA方法

为获得狂犬病毒G基因并在大肠杆菌中进行表达,进而初步建立用于评价狂犬疫苗免疫效果的方法,根据狂犬病病毒RV(rabies virus)ERA株G基因序列设计引物,从病毒中提取出RNA,经逆转录并扩增得到RVG基因;将该基因片段定向克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒PET-RVG并转化到大肠杆菌BL21(DE3)gold中,经IPTG诱导表达并确定表达的最佳条件;Ni亲和层析柱纯化获得重组G蛋白,并以G蛋白为抗原建立检测狂犬病毒抗体的间接ELISA方法.检测结果表明,经灰度分析纯化后纯度可达96%.     

大豆异黄酮中转基因大豆成分检测研究

利用含有35S启动子、NOS终止子片段的质粒,确定相应检测方法的灵敏度为15个拷贝和150个拷贝;采用扩增CaMV35S启动子的2对引物、扩增NOS终止子的2对引物、扩增EPSPS目的基因的1对引物,对大豆异黄酮样品中转基因成分进行了检测,结果均扩增出了特异性片段,且测序结果正确。     

双孢蘑菇耐热相关基因028-1的克隆与序列分析

根据双孢蘑菇耐热相关基因片段028-1400的cDNA序列设计并合成引物，应用cDNA末端快速扩增（RACE）方法获得该基因的5′端cDNA片段028-11200。以上述两个片段为模板，经PCR扩增获得该基因的全长cDNA序列，并对其进行了克隆、鉴定、测序与分析。该序列全长1．37Kb，在GenBank中未发现明显的同源序列。该基因序列在GenBank上的登录号为DQ235473。     

甘蔗白叶病植原体PCR检测方法的建立与应用

为建立简便、快速、特异性的甘蔗白叶病植原体检测方法，本研究根据甘蔗白叶病植原体sec A基因设计特异引物secA-F/secA-R，建立了甘蔗白叶病植原体PCR检测方法。使用该方法可以从含有甘蔗白叶病植原体的甘蔗样品中稳定扩增出目标基因片段，片段长度为350bp。本方法的最低检测浓度为50 fg/μL。应用该方法对云南耿马蔗区采集的7份甘蔗白叶病样品进行了检测鉴定，结果表明，所有样品均为阳性。以上结果表明，本研究建立的甘蔗白叶病植原体PCR检测方法特异性和敏感性好，操作简便，适用于甘蔗白叶病植原体的快速检测。     

多重PCR法用于畜肉源性鉴定的研究

根据Genebank中猪、牛、羊的线粒体细胞色素b（Cyt-b）基因序列,设计了猪、牛、羊的通用上游引物和特异性下游引物,通过调节引物比例、反应体系、反应条件以及模板量等优化实验确立了多重PCR检测方法。研究结果显示,该多重PCR方法能够同时扩增样品中猪、牛、羊成分,对混合样品的检出限可达10%;并将该方法用于成都市猪、牛、羊肉的调查研究,得到了理想的结果。      

烟草品种识别方法──扩增片段长度多态性(AFLP~)

ＡＦＬＰ是利用特定引物对ＤＮＡ的酶切片段进行两次选择性的ＰＣＲ扩增以揭示遗传多型性,技术程序中巧妙运用了两种限制性内切酶、两种接头、两种特定引物和两次选择性扩增,多态性片段数目多,一般来讲,聚丙烯酰胺变性凝胶可显示５０—１００个扩增片段,而且精确性高,重复性能好。是目前烟草品种鉴定的最有效方法。利用６种ＡＦＬＰ引物组合,在烟草品种Ｋ３２６、ＴＮ９０、ＴＮ８６和Ｓａｍｓｏｕｎ中产生了３３个多态性标记。这些品种可以得到明显的区分,其中包括两个非常相近的品种ＴＮ９０和ＴＮ８６。不仅如此,同一品种烘烤后…     

基于DNA测序方法检测生鲜肉中5种动物源性成分

目的建立生鲜肉中猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分的DNA测序鉴别方法,并对采集自北京各地区生鲜肉品进行检测验证。方法合成动物线粒体上12S rRNA、cytochrome b、cytochrome c oxidase基因引物,建立猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分的DNA测序鉴别方法,并对50份猪、牛、羊、鸡、鸭肉品进行检测。结果使用线粒体上12S rRNA、cytochrome b、cytochrome c oxidase基因引物对猪、牛、羊、鸡、鸭肉品进行扩增,分别获得456、400和710 bp大小的DNA片段。只有12S rRNA基因引物均可对此5种动物源性成分扩增且效果良好。扩增产物进行序列测定。根据序列构建的系统进化树发现,此方法可有效区分样品中猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分。结论此方法快速、简便,可准确检测50种生鲜肉样品中的动物源性成分,作为肉类鉴别的新方法。     

猪流行性腹泻病毒冻干qLAMP检测体系的建立

为建立猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）实时荧光定量LAMP（Quantitative LAMP,qLAMP）与冻干技术结合的快速检测方法。该实验根据PEDV的高度保守序列设计了引物并进行筛选,建立PEDV的qLAMP检测方法。筛选棉子糖、甘露醇和牛血清蛋白作为冻干辅料并优化,将最佳的配方与等温扩增试剂（除甜菜碱）混合后进行冷冻干燥处理。优化主干燥升温方式和二次干燥时间,制作出一条适合等温扩增试剂的冻干曲线,并以此制备PEDV qLAMP冻干检测试剂盒。结果显示：通过对冻干成品性状、溶解性及剩余水分含量的测定,确定了主干燥后期采用一步升温的方式进行升温,解析干燥时间为3.5 h。PEDV qLAMP冻干检测体系的最低检测限为每微升157 copies,与工艺优化前相比,其检测速率得到提升。对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒等5种病原无扩增反应,重复性实验变异系数均小于5%,常温条件下保存30 d,在4 ℃条件下至少保存12个月。该研究通过使用冻干技术建立了LAMP检测方法,具有现场操作简便快捷、检测效果好、储存时间长,适用于基层现场快速检测。     

实时荧光聚合酶链式反应法检测食品中猪源性成分

针对猪线粒体细胞色素b基因序列设计特异的引物和探针,建立食品中猪源性成分实时荧光聚合酶链式反应检测方法,并经特异性和敏感性试验验证其可行性。结果表明：该体系可扩增猪肉DNA片段,长度为98bp,其他常见畜、禽肉成分均无法正常扩增。该体系灵敏度低至1pg,且阴性样品扩增后的Ct值限制在35循环以后。对于各模拟肉类样品中掺杂的猪源性成分,其检测限均达1%,经市售加工食品检测验证,表明所建立的猪引物探针体系具有特异性好、灵敏度高、快速、高效等优点,可用于对食品中猪源性成分的掺假鉴别检测。     

运用PCR技术进行5种液态奶的鉴别

采用聚合酶链式反应(PCR)对牛奶、羊奶、水牛奶、骆驼奶、黄豆奶这五种液态奶进行鉴别。其中,羊奶以ATP6为目的基因设计其特异性引物,能扩增出大小为292 bp的DNA片段,水牛奶以12SrRNA为目的基因设计特异性引物对,扩增出大小为328 bp的DNA片段,牛奶、骆驼奶以细胞色素b(cyt b)为目的基因设计引物,可以分别扩增出大小为725 bp和363 bp的DNA片段,黄豆浆以细胞色素f(cyt f)为目的基因,扩增出大小为510 bp的DNA片段,各引物对对于其它物种奶类无特异性扩增,并采用两种限制性内切酶验证了该扩增的特异性。通过不同物种的基因序列差距设计的引物,能同时鉴别出这几种液态奶,是一种可靠、简单、快捷的液态奶鉴别方法。     

非洲猪瘟病毒核酸检测的阳性DNA获取方法研究

目的:建立非洲猪瘟病毒核酸检测过程中所需阳性DNA片段的获取方法。方法:通过PCR和荧光定量PCR技术,使用非洲猪瘟病毒核酸检测试剂盒来确定阳性样品,根据标准方法获得该阳性样品中的目的基因序列,并通过测序确认,再利用基因克隆和基因合成的方法得到含有该阳性对照的质粒。结果:文章成功获得了非洲猪瘟病毒核酸检测所需阳性DNA片段,且通过序列比对发现其位于该病毒P72蛋白编码基因序列中的保守区域。结论:文章提供的方法不仅能够获得非洲猪瘟病毒核酸检测所需的阳性DNA片段,同时还适用于其他动植物源性检测和转基因检测所需的阳性DNA的获取。     

基于FemAB基因特异引物的动物双歧杆菌PCR检测方法的建立

分离和鉴定了两株双歧杆菌,通过16SrDNA通用引物扩增条带测序和非特异引物随机扩增法扩增条带测序推测其为动物双歧杆菌。随后使用以编码肽聚糖肽桥形成蛋白(Peptidoglycan bridge formation protein)FemAB基因为目的扩增片段设计的特异引物进行了扩增鉴定。结果表明,此特异引物对这两株动物双歧杆菌菌株扩增结果为阳性,其他对照菌株扩增结果为阴性,且扩增条带测序结果与预计一致。FemAB基因在PCR特异扩增法鉴定细菌种属中具有较好的分辨能力,并使用其建立了动物双歧杆菌PCR检测方法。本研究旨为应用FamAB基因鉴定细菌种属以及双歧杆菌属微生物的鉴定提供了数据参考。     

口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立同时检测口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和猪水泡病病毒的多重荧光RT-PCR检测方法。方法根据口蹄疫病毒3D蛋白编码基因、水泡性口炎病毒N蛋白编码基因和猪水泡病病毒VP1蛋白编码基因的高保守区设计特异性引物和探针,对3种动物病毒进行多重荧光定量RT-PCR扩增。结果经过扩增,可以同时检测口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和猪水泡病病毒,而其他参试病原均无扩增信号,显示其良好的特异性。对口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、猪水泡病病毒的最低检测限分别达到101、102、102个质粒拷贝浓度。结论本方法灵敏度高,特异性良好,可实现多种病毒混合感染的同时检测。     

猪链球菌微滴数字PCR定量检测方法的建立

根据猪链球菌(Streptococcus suis,SS)gdh基因的保守序列设计特异性引物和Taq Man探针,通过反应条件优化和特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品的检测,建立可对其准确定量的微滴数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)检测方法,并与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法进行比较分析。结果表明,该方法特异性良好,与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪圆环病毒2型和伪狂犬病毒无交叉反应;灵敏度优于qPCR,线性相关系数(R2)为0.991,呈良好线性关系,最低可检测到2.692 copies/μL的阳性质粒;稳定性好,变异系数为1.66%。临床样品定量检测结果表明,dd PCR具有敏感性高、特异性好等优点,能对qPCR检测的可疑样品进行精确定量。本研究建立的dd PCR能够准确定量检测SS,将为SS相关研究提供有益参考。     

应用SYBR GreenⅠ溶解曲线检测食源性单增李斯特菌

基于单增李斯特菌hlyA基因和李斯特菌属的16sRNA基因分别合成两对引物,确立SYBR GreenⅠ荧光PCR检测单增李斯特菌两个特异性基因的最佳反应体系及条件,反应液经凝胶电泳验证,验证结果显示,扩增出的两条不同大小、不同T_m值的目的核酸片段,分别对应两条荧光PCR溶解曲线上的两个独立波峰。基于单增李斯特菌hlyA基因建立标准曲线,相关系数为0.996,最低检出限约为89CFU/mL。为检验方法的可行性,对鲜活白蚬子样品中分离出的疑似菌株进行实际检测,所得阳性结果经国家标准方法（GB4789.30-2010）验证,验证结果表明,SYBR GreenⅠ荧光PCR实际检测阳性结果与GB4789.30-2010检测结果一致。