次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌活的非可培养状态形成及复苏过程研究

目的 研究不同有效氯浓度次氯酸钠溶液诱导肠炎沙门氏菌进入活的非可培养状态（viable but non-culturable state: VBNC）及复苏条件研究。方法 以不同有效氯浓度次氯酸钠处理肠炎沙门氏菌,分析肠炎沙门氏菌活的非可培养状态菌数及VBNC发生率的变化,结合扫描电镜观察肠炎沙门氏菌VBNC态细胞与正常细胞的形态差异,而后比较不同复苏条件的复苏效果,同时对复苏后的细胞生理活性进行评价。结果 40 mg/L有效氯浓度处理20 min可使活菌全部进入VBNC状态,细胞表面出现褶皱塌陷;高于60 mg/L有效氯浓度可全部杀灭,细胞出现断裂、破损;进入VBNC态的肠炎沙门氏菌在5种复苏处理下,均可恢复可培养性;在20 mmol/L丙酮酸钠×热激条件下恢复效果较好。pHi和胞内ATP显示复苏后细胞活性较正常细胞有所降低。结论 在食品生产、环境清洁中应注意次氯酸钠使用浓度,否则极易造成肠炎沙门氏菌VBNC态的形成和复苏,导致食品污染,从而增加食品安全风险。     

SD-PMA-qPCR快速检测冷冻肉制品中活性沙门氏菌的研究

为实现冷冻肉制品中活性沙门氏菌的快速检测与控制,本文利用PMA（叠氮溴化丙锭）和SD（脱氧胆酸钠）消除死菌和损伤菌的影响,建立了运用SD-PMA-qPCR法检测活性沙门氏菌的反应体系和反应条件,并进行人工染菌样品检测试验。SD的最佳浓度确定为0.1%,最佳孵育时间为20 min。对-20 ℃低温冷冻处理3~4 d的沙门氏菌处理液,使用平板计数法、qPCR、PMA-qPCR和SD-PMA-qPCR进行计数,结果发现qPCR与PMA-qPCR二者检测值接近且明显高于平板计数值,而SD-PMA-qPCR检测值与平板计数值相近,这表明SD和PMA的联合使用能有效的消除死菌和损伤菌的影响。人工染菌样品试验表明,沙门氏菌检出限在102 CFU/g,同时106 CFU/g大肠杆菌O157:H7的存在不会影响检测结果。本研究所建立的SD-PMA-qPCR检测方法特异性好、灵敏度高,有望成为快速检测冷冻肉制品中活性沙门氏菌的新方法,具有很好的研究价值和应用前景。     

SD-PMA-ddPCR检测食品中沙门氏菌的研究

研究将叠氮溴化丙锭（PMA）与微滴数字PCR（dd PCR）技术相结合,建立一种沙门氏菌活菌的检测方法。结果表明,PMA不能完全有效抑制108CFU/m L的沙门氏菌死菌DNA的PCR扩增,0.1%脱氧胆酸钠（SD）和40.0μg/m L PMA协同作用,可以有效抑制108CFU/m L的沙门氏菌死菌DNA的PCR扩增,不抑制沙门氏菌活菌DNA扩增的PMA最高浓度是40.0μg/m L。经过SD和PMA对样品预处理,在不同死、活菌比例下,PMA-dd PCR可以定量检测活菌,避免了死菌DNA的干扰。本方法的检出限为8.0 copy/20μL。利用PMA-dd PCR检测人工污染鸡肉样品,最低可检出102CFU/m L的沙门氏菌。实验结果证明PMA-dd PCR方法的特异性、精确度、稳定性良好。      

金黄色葡萄球菌活的非可培养状态的诱导和复苏

研究金黄色葡萄球菌活的非可培养状态(viable but non-culturable state,VBNC)的诱导和复苏方法。采用不同pH、温度、盐度、不同浓度的食品防腐剂山梨酸钾处理进行诱导;复苏则采用了直接升温处理、添加液体培养基升温处理、添加酵母液升温处理、添加吐温升温处理的方法。结果表明,经过不同温度和山梨酸钾诱导后的金黄色葡萄球菌进入了VBNC状态;其中诱导时间最短(76d)的条件是0.5mmol/L山梨酸钾、-20℃寡营养条件;采用BHI培养基升温的方法,以及添加0.5%和1%的吐温20和吐温80的培养液升温方法使进入VBNC状态的金黄色葡萄球菌得到复苏。VBNC状态的金黄色葡萄球菌在形态上发生了变化;复苏后的菌株除尿素酶阴性外,其他代谢特征均与标准菌株相同。     

金黄色葡萄球菌活的非可培养状态的诱导和复苏

研究金黄色葡萄球菌活的非可培养状态（viable but non-culturable state,VBNC）的诱导和复苏方法。采用不同pH、温度、盐度、不同浓度的食品防腐剂山梨酸钾处理进行诱导;复苏则采用了直接升温处理、添加液体培养基升温处理、添加酵母液升温处理、添加吐温升温处理的方法。结果表明,经过不同温度和山梨酸钾诱导后的金黄色葡萄球菌进入了VBNC状态;其中诱导时间最短（76d）的条件是0.5mmol/L山梨酸钾、-20℃寡营养条件;采用BHI培养基升温的方法,以及添加0.5%和1%的吐温20和吐温80的培养液升温方法使进入VBNC状态的金黄色葡萄球菌得到复苏。VBNC状态的金黄色葡萄球菌在形态上发生了变化;复苏后的菌株除尿素酶阴性外,其他代谢特征均与标准菌株相同。      

细菌活的非可培养状态研究

综述了细菌活的非可培养状态的导致原因、生物学特性、检测及复苏方法,通过对活的非可培养状态的研究,使相关研究人员更加深刻的了解和认识活的非可培养状态下的细菌特性,从而对非可培养状态病原菌的防控起到积极的作用。通过细菌VBNC状态的综述进而对益生乳酸菌VBNC状态的研究提出新的思路,以解决乳酸菌发酵剂工业化生产中所面临的问题。     

细菌的活的非可培养状态及其研究进展

细菌的活的非可培养状态是指细菌具有生物活性和毒性,但用常规培养法检测不出来的一种特殊生理状态。由于这种状态在特定条件下可以复苏,将培养出来和致病,所以研究细菌的活的非可培养状态对正确地评价食品的卫生状况,改进检验方法具有重要的意义。本文介绍了细菌进入活的非可培养状态的各种诱导因素;活的非可培养状态细菌的生理特征;已研究的能进入活的非可培养状态的细菌种类;细菌的活的非可培养状态的检测方法;最后阐述了进行细菌的活的非可培养状态研究的重要意义。     

茶多酚影响肠道菌群活的非可培养状态(VBNC)状态转变的研究

以代表性的肠道致病菌为研究对象,利用茶多酚干预其正常生长状态,促进进入活的非可培养状态(VBNC),该文对此进行了系列研究。通过在0³.0%浓度范围内调节茶多酚剂量,发现2.5%浓度的茶多酚溶液能达到最大抑菌效果。还研究了在0.6%3.0%浓度范围内调节茶多酚剂量,发现2.5%浓度的茶多酚溶液能达到最大抑菌效果。还研究了在0.6%¹.2%浓度梯度的茶多酚诱导下,细菌由正常生活状态进入VBNC状态所需的时间,随着茶多酚浓度的升高由25 d减少为15 d,最后用扫描电镜观察,发现沙门氏菌VBNC状态的个体形态相对于正常状态平均皱缩了0.3μm。另外,通过监测生长曲线发现,2.0%茶多酚在抑制肠道致病菌生长且延迟其进入对数生长期的同时,提高了益生菌67%的生长效率。研究结果证明,茶多酚对调节肠道菌群的生长起到了积极的作用,该研究为深入利用茶多酚在食品发酵生产和保健食品开发方面提供了理论基础。     

细菌活的非可培养状态的研究现状及发展趋势

微生物是危害食品质量安全的重要因素。细菌活的非可培养状态的概念提出,对于微生物学、食品质量安全、水质管理、流行病学等方面,都有重大意义。对细菌活的非可培养的研究现状及发展趋势进行了综述。     

细菌活的非可培养状态的分子生物学检测技术研究进展

许多细菌在不良环境下能进入活的非可培养状态(viable but nonculturable state,VBNC)。细菌培养技术常常造成VBNC状态的细菌漏检,应用分子生物学检测技术可以提高VBNC细胞的阳性检出率。针对VBNC细胞的分子生物学检测技术,基于细菌特异性DNA分子、mRNA分子是目前常用的检测方法,而利用报告基因(如绿色荧光蛋白基因)检测VBNC细胞是一种有效的方法。最近利用叠氮溴乙锭 (ethidium monoazide bromide,EMA)或者叠氮溴化丙锭 (propidium monoazide,PMA)联合PCR技术选择性抑制细菌死细胞扩增,该方法结合了EMA(PMA)选择渗透性和PCR特异性,作为一种区分细胞死活的方法,可以有效检测细菌VBNC细胞。     

物理场加工中细菌活的非可培养状态相关研究进展

物理场加工技术是一类使用加热、加压和辐射等物理学方法的技术, 其中热加工、超声波、超高压和紫外辐照等技术已被广泛应用于食品加工。近年来多个报道显示, 在物理场加工中细菌可进入活的非可培养状态(viable but non-culturable, VBNC)。VBNC状态指微生物为了适应逆境而进入的一种特殊休眠状态, 在合适条件下能复苏, 甚至可能依然保持致病能力, 这提示我们应该对物理场加工食品的微生物安全予以高度重视。本文主要综述了物理场加工中食源性致病菌和腐败菌VBNC状态的研究进展, 并从共性机制的角度出发分析其形成原因。本文旨在为更好的应用物理场加工技术并保障食品安全提供新思路和新方向。     

PMA-qPCR定量检测VBNC副溶血弧菌方法的建立与优化

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）在某些不利于生长的自然和食品加工条件下能够进入活的非可培养（viable but non-culturable, VBNC）状态,普通检测方式极易漏检,因此VBNC细菌检测技术的开发与优化对副溶血弧菌感染防控具有重要意义。基于叠氮溴化丙锭结合荧光定量PCR技术（propidium monoazide quantitative PCR,PMA-qPCR）能够利用活细胞的膜完整性区分活菌和死菌的原理,以副溶血弧菌ATCC 17802为对象,通过探讨PMA-qPCR方法中各项因素对活菌计数结果的影响,优化并建立了VBNC副溶血弧菌的定量检测方法。实验结果表明,当添加PMA质量浓度为15 mg/L,黑暗孵育10 min,再进行强光照射15 min后,死细胞的DNA扩增得到有效抑制,此时提取DNA模板进行qPCR扩增准确性更高,活菌数与qPCR扩增循环数呈现显著性线性相关（R²=0.99）。PMA-qPCR法测定副溶血弧菌活菌数的标准曲线显示该方法检测范围为2.90×10¹～2.90×10     

DNase处理法结合数字PCR与qPCR对活的非可培养状态副溶血性弧菌检测比较研究

目的探讨DNase处理法结合微滴化数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)在检测冷冻食品中活的非可培养状态(viable but non-culturable state, VBNC)副溶血性弧菌的适用性,并与实时荧光定量PCR(qPCR)进行比较。方法用无菌磷酸盐缓冲液对解冻的大西洋鲑鱼样品进行10倍梯度稀释,再加入副溶血性弧菌,终浓度为6.6×10~5 CFU/mL。-20℃分别诱导10、20和30 d。将DNase试剂与叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)染料分别作用于不同时期的冷冻基质,结合qPCR和ddPCR进行比较检测,对比其作用效果。结果DNase-qPCR和PMA-qPCR检测3个冷冻阶段活性副溶血性弧菌的Cq值分别为31.41±0.06、32.40±0.04、34.59±0.15和31.24±0.06、32.32±0.03、34.25±0.12, 2种方法Cq值均呈现上升的趋势且数值接近。采用DNase-ddPCR和PMA-ddPCR检测各阶段活性副溶血性弧菌,可直接读出绝对拷贝数,分别为233±6.43、108±5.57、28±3.21和256±6.56、126±3.06、35±2.52。2种方法检测的拷贝数差异不大,重复性好。相对标准偏差均在可接受范围内,符合欧盟定量检测要求。结论DNase处理试剂与PMA对有活性的副溶血性弧菌检测效果相当,与PMA相比,DNase处理法无需强光照射,操作简便快捷,无试剂毒性。ddPCR不需要标准品即能实现对基质中微量活性副溶血弧菌精准定量检测。     

植物乳杆菌活的非可培养状态的初步研究

利用16S rDNA序列分析法测得实验室保藏的乳酸菌的16S rDNA序列,并与基因库中基因序列进行同源性比较,经鉴定此菌为植物乳杆菌。并研究了植物乳杆菌进入活的非可培养状态（Viable but Non-culturable,VBNC）的诱导条件和复苏条件。结果显示,在诱导条件为MRS液体培养基、pH5.5～6.2、温度-20℃和有氧环境时,植物乳杆菌在12d之后进入了VBNC状态;复苏条件为添加有6%吐温-80的MRS液体培养基和普通MRS液体培养基分别在48h和96h之内可以使VBNC的植物乳杆菌复苏。      

Factors affecting the occurrence of viable but non-culturable state in Salmonella,Escherichia coli and Staphylococcus aureus during thermosonication and prevent it with sodium pyruvate

Concerning potential food safety and/or public health risks raised by viable but non-culturable (VBNC) state bacteria, factors affecting its occurrence during thermosonication were summarised. The relative ratios of Salmonella and Escherichia coli in the VBNC state were higher than that of Staphylococcus aureus, suggesting that the tested gram-negative bacteria would be more likely to survive in this state than S. aureus (gram-positive). The culturability of bacteria was easier to be retained in neutral pH environment, resulting in a reduced likelihood of entering into a VBNC state. Non-occurrence of a VBNC state by moderate heat of 32–57 °C was observed, facilitated in combination with sonication and being correlated with thermosonication conditions. Adding sodium pyruvate before thermosonication treatments could prevent the occurrence of a VBNC state, though the molecular mechanism of it is not clearly known and needs further elucidation.     

单增李斯特菌非可培养状态的诱导与PMA-qPCR检测

在9%（w/v）NaCl条件下,通过温度、pH两种因素诱导一株单增李斯特菌进入\     

Potential of Escherichia coli O157:H7 to persist and form viable but non-culturable cells on a food-contact surface subjected to cycles of soiling and chemical treatment

Our aim was to assess the potential of Escherichia coli O157:H7 to persist in a processing environment. We studied E. coli behaviour under conditions modelling those of meat plants to establish one initial bacterial load that allows persistence and another that does not. Polyurethane coupons (3.5 cm²) were contaminated once with E. coli in meat exudate before being subjected daily to a cleaning product and a disinfectant, both at half the recommended in-use concentrations, and a further soiling with the exudate. This procedure aimed to model what occurs in harbourage sites. Because previous experiments showed that persistence could not be achieved at 15 °C (temperature of slaughter halls), we incubated the coupons at 20 °C. Viable cells were determined by ethidium monoazide-qPCR (EMA-qPCR). When the first chemical treatment (CT) was applied to 24-hour biofilms with 5.4 log CFU/cm², cells were no longer detectable after the first week. However, on 66-hour biofilms with 6.7 log CFU/cm², after initially decreasing, E. coli numbers reached 6.6 log CFU/cm² and 8.3 log viable cells/cm² on the 11th day. When E. coli was cultured with a Comamonas testosteroni previously shown to increase E. coli biofilm formation, and subjected to CT on alternate days, E. coli stabilized at 4.6 log CFU/cm² before the CT, from the 5th day of the experiment. The killing and detachment effects of the CT decreased over time and PCR quantification detected a resumption of growth after 2 days (CT on alternate days) or 3 days (daily CT). Intracellular pH (pHi) of individual cells was determined during an experiment in which the CT was applied on alternate days. The proportion of cells with no proton gradient towards the environment (pHi ≤ 5.4) increased after the CT as expected. But during the first week of the experiment only, a further increase in this proportion occurred 24 h after the CT, suggesting that some of the surviving viable but non-culturable cells finally died.This study shows that conditions leading to E. coli O157:H7 persistence are not likely to arise when good refrigeration and hygiene practices are applied, and highlights the usefulness of EMA or PMA-qPCR as a complement to CFU determination in studying bacterial survival after cleaning and disinfection.     

过氧化氢处理中鼠伤寒沙门氏菌VBNC态形成及其机制解析

为确定过氧化氢的有效杀菌浓度,以鼠伤寒沙门氏菌为目标微生物,借助分子生物学手段,探究过氧化氢对自来水中鼠伤寒沙门氏菌活性和可培养性的影响及其活的非可培养状态(viable but non-culturable,VBNC)的形成原因。结果表明:较低过氧化氢浓度(0～15 mmol/lL)处理可达到部分杀菌的效果,1 mol/L以上过氧化氢可完全灭菌。而15 mmol/L过氧化氢处理导致4.08 lg(CFU/mL)鼠伤寒沙门氏菌全部进入VBNC状态。该状态的沙门氏菌形态和结构改变,过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶几乎完全被钝化,处理中产生的自由基强度在0～30 min内与VBNC发生系数呈正相关。