纳米级脂质微泡超声造影剂肿瘤被动靶向研究

目的 观察纳米微泡通过肿瘤血管内皮间隙实现被动靶向的可行性.方法 20只SKOV3细胞皮下种植荷瘤裸鼠分为A组(超声显像组10只)及B组(冰冻切片组10只,再分为B1组及B2组).制备DiI标记的纳米微泡及微米微泡并调整至相同浓度.A组:各裸鼠先后经尾静脉注射相同浓度微米微泡及纳米微泡(35μl/只,间隔1.5h),分别进行超声显像观察.B组;B1组及B2组各裸鼠分别注射相同浓度微米微泡及纳米微泡(约10μl/只),1.5h后对裸鼠进行心脏灌注后切取肿瘤组织及肌肉组织进行冰冻切片、Hoechst核染,激光共聚焦显微镜下观察不同微泡在两组织中的滞留情况.结果 超声显示:纳米微泡组达峰时间及消退时间均长于微米微泡组,而峰值强度低于微米微泡组.冰冻切片观察;纳米微泡组肿瘤细胞周围见明显红色荧光聚集,微米微泡组肿瘤、肌肉组织中及纳米微泡组肌肉组织中均未见明显红色荧光.结论 纳米级脂质微泡可通过肿瘤血管内皮间隙,即实现了肿瘤被动靶向.     

载多西紫杉醇脂质微泡超声造影剂的制备及其性质

目的 制备载多西紫杉醇脂质微泡并测定性质及观察其体内显像效果.方法 制备载多西紫杉醇脂质微泡,测定粒径、包封率等性质;观察60Co射线灭菌前后微泡性质的差异,观察超声辐照后载药微泡药物的释放,并观察其对兔VX2肝癌的显像效果.结果 载多西紫杉醇微泡的浓度为2.2×109～3.2×109个/ml;粒径分布范围为473.4～706.6 nm,平均粒径为623.1 nm;微泡的包封率为70%以上,载药量为(17.5±0.8)%;Zeta电位为-(3.1±0.9)mV;超声辐照微泡溶液后,药物可释放;静脉注射此微泡后,兔肝实质见良好、持续的增强显像,肝癌病灶可见明显的"快进快出"显影表现.结论 载多西紫杉醇脂质微泡包封率较高,性质较佳,体内显像效果好,提高了超声在肝癌等肿瘤诊断中的价值,超声辐照能促使微泡中的药物释放,有望在实时监控下体内定点靶向给药,实现对肿瘤的靶向治疗.     

以HER2为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂的制备及实验研究

目的 制备以HER2受体为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂,并观察其体外寻靶能力及体外超声显像效果.方法 制备生物素化Herceptin单抗,检测其生物素化程度及生物学活性;薄膜水化-声振法制备生物素化纳米微泡,以生物素-亲和素为桥梁制备HER2为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂,观察其对SKOV3卵巢癌细胞的体外寻靶能力及靶向结合的体外超声显像.结果 平均每分子Herceptin单抗可与16个生物素分子结合;与游离单抗相比,生物素化抗体的活性未见明显降低(P＞0.05).体外寻靶实验观察:靶向纳米微泡组SKOV3细胞表面有明显的红染纳米微泡与其牢固结合,沿细胞表面排列较规则;非靶向组SKOV3细胞表面未结合红染的纳米微泡.靶向纳米微泡体外超声显像:细胞爬片与靶向纳米微泡孵育后可明显增强超声显像效果,对照组均未见明显超声显像.结论 应用生物素-亲和素系统成功构建了以HER2为靶点的纳米级超声造影剂,与SKOV3细胞结合后有明显超声显像效果.     

超声辐照载血管内皮细胞生长因子抑制剂脂质微泡对皮下结肠癌移植瘤治疗效果的研究

目的 评价超声辐照载血管内皮细胞生长因子抑制剂(vascular endothelial growth factor inhibitor,VEGFI)脂质微泡对结肠癌的治疗效果.方法 将稳定表达绿色荧光蛋白的结肠癌细胞系接种于Balb/c裸鼠皮下,建立结肠癌移植瘤模型.将48只皮下种植结肠癌移植瘤的Balb/c裸鼠随机分为4组:A组(12只),空白对照组,不接受超声造影及辐照;B组(12只),接受裸脂质微泡超声造影及假照;C组(12只),裸脂质微泡超声造影及超声辐照;D组(12只),载VFGFI脂质微泡及超声辐照.辐照前和3次辐照后第1d、第3d、第7d、第11d、第16d分别对各组裸鼠测量体质量和荧光摄片,测量肿瘤大小,计算肿瘤体积,绘制肿瘤体积生长曲线及裸鼠体质量生长曲线.16d后处死裸鼠,切除并分离肿瘤组织,测量各组肿瘤质量.结果 辐照前各组裸鼠体质量和肿瘤体积差异无统计学意义(P＞0.05);随访期间,A组与B组肿瘤体积持续增大,两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05);辐照后第7d,C组及D组肿瘤体积均小于A组,差异有统计学意义(P＜0.01),C组与D组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05);第7d后C组肿瘤体积变化不明显,到第16d肿瘤体积仍然小于A组,差异有统计学意义(P＜0.01),而D组肿瘤体积进一步缩小,与C组比较差异有统计学意义(P＜0.05).切除肿瘤组织,D组肿瘤质量低于C组(P＜0.05),C组低于A组(P＜0.05),而A、B组之间肿瘤质量差异无统计学意义(P＞0.05).观察期间各组裸鼠体质量差异无统计学意义(P＞0.05).结论 载VEGFI微泡联合超声辐照可以增强对结肠癌的治疗效果.     

载诺帝脂质微泡的制备及特性的实验研究

目的 制备载诺帝(去甲二氢愈创木酸)脂质微泡并测定其包封率、载药量及观察其体内超声显像效果.方法 采用机械振荡法制备载诺帝脂质微泡,测定其粒径大小、分布和Zeta电位、包封率、载药量;超声造影观察其在兔肝内的显像效果.结果 载药脂质微泡的浓度为(2.53±0.52)×109个/ml,粒径为(2.61±0.32)μm,Zeta电位为+(17.52±2.04)mV;脂质微泡诺帝的包封率(27.1±2.01)%,载药量为(10.9±0.90)%;微泡经外周静脉注射后,兔肝可见良好、持续的增强显像效果.结论 采用机械振荡法可以成功制备携带诺帝的脂质微泡,微泡可以通过肺血管床,符合静脉注射要求,在家兔体内获得了良好的显像效果.     

纳米脂质微泡超声造影剂制备及其显影效果的实验研究

目的 制备一种纳米级脂质超声微泡造影剂,并将其与普通脂质微泡在正常兔肝的造影效果进行比较,以评价其造影效果.方法 经机械振荡法制备纳米脂质微泡,检测其形态、粒径、表面电位等物理特性.分别经兔耳缘静脉团注自制纳米脂质、普通脂质微泡造影剂(2.5 ml/kg),动态观察肝的实质回声增强情况,并用DFY型超声图像分析诊断仪对造影效果进行定量分析.结果 纳米脂质微泡平均粒径为415.8 nm,平均电位为-(13.7±1.6)mV.造影后观察:该纳米微泡能明显增强兔肝的二维灰阶显像,与普通脂质微泡比较,纳米微泡达峰时间较晚,峰值持续时间较短,增强持续时间较普通脂质微泡长,纳米微泡对肝的增强峰值强度略低于普通微泡.结论 自制纳米微泡形态好,粒径均一,显影效果理想,为肿瘤的靶向性研究提供了一个前期基础.     

机械振荡法与声振法制备纳米级微泡超声造影剂效能比较

目的 比较机械振荡法与声振法制备纳米级微泡超声造影剂(Nanobubbles,NBs)的效能.方法分别用机械振荡法和声振法制备NBs,比较两种方法制备NBs的粒径、粒径分布、浓度以及制备所耗时间等.结果 声振法与机械振荡法制备的NBs粒径分别为(373.88±18.43)nm、(360.74±14.39)nm,二者比较差异无统计学意义(P=0.523).声振法制备的NBs离心纯化前粒径分布较广,与机械振荡法制备的NBs粒径分布(分散系数,polidispersity值)比较差异有统计学意义(P＜0.001).机械振荡法制备的NBs浓度为(1.48±0.15)×1010,明显高于声振法制备的NBs浓度[(8.07±0.62)×108] (P＜0.001).声振法制备NBs较机械振荡法耗时长,两者比较差异有统计学意义(P＜0.001).结论 机械振荡法与声振法均能制备出NBs,但与声振法相比,机械振荡法制备的NBs粒径分布窄,浓度高,用时短,可更加快速有效地制备NBs,适合进行肿瘤超声造影成像方面的实验研究.     

超声破坏微泡对大鼠皮肤创面愈合影响的实验研究

目的 探讨超声破坏微泡(声诺维)对大鼠皮肤创面愈合的影响.方法 96只SD大鼠建立皮肤创面模型后随机分成4组:超声破坏微泡组、单纯微泡组、单纯超声组和对照组.超声破坏微泡组经鼠尾静脉注射微泡造影剂0.5 ml,同时用声强度1 MHz、2.0 W/cm2超声辐照3 min单纯微泡组经鼠尾静脉注射微泡造影剂0.5 ml;单纯超声组经鼠尾静脉注射生理盐水0.5 ml,同样条件超声辐照3 min对照组经鼠尾静脉注射生理盐水0.5 ml.于创伤后第1、3、5、7、14、21 d利用HE染色和免疫组化方法 观察各组创面肉芽组织生长及血管内皮生长因子(VEGF)表达的情况.结果 HE染色:伤后第7 d,超声破坏微泡组肉芽组织明显比其他3组厚,新生毛细血管均垂直于创面生长,其他3组毛细血管排列紊乱.免疫组化观察VEGF表达变化:超声破坏微泡组在第3 d形成表达高峰,其他3组表达高峰在第5～7 d.结论 超声破坏微泡可以提高大鼠背部皮肤的创面愈合质量;新生肉芽组织成熟早,创面愈合加速.超声破坏微泡时产生的高温、高压及某些化学效应可以刺激内源性VEGF分泌,促进血管生成,从而促进创面愈合.

Abstract：

Objective To investigate the effect of microbubble(Sono Vue) destruction with ultrasound on wound healing in rats. Methods Total 96 SD rats were accepted one rounded whole-layer skin incision on back each other and randomly divided into four groups:microbubble destruction with ultrasound(US + MB),microbubble(MB), ultrasound(US) and control group. Rats in US + MB group were injected with 0.5 ml microbubble contrast agent via tail vein,and then ultrasound irradiated for 3 minutes immediately. MB group were injected with 0.5 ml microbubble contrast agent. US group were injected with 0.5 ml physiological saline,and then ultrasound irradiated for 3 minutes immediately under the same condition. Control group were injected with 0.5 ml physiological saline. Feed each rat in single cage. On day 1,3,5,7,14 and 21 after wound creation,the excised wound tissues were analyzed by histology and VEGF expression in wounds by immunohistochemistry. Results HE staining: On day 7, wounds of US + MB group displayed the most accumulation of granulation tissue and all new capillaries were perpendicular to the wound surface, but the new capillaries of other 3 groups were disordered. Immunohistochemical examination of VEGF expression:the peak expression appeared on day 3 in US + MB group, other 3 groups were on day 5 to day 7.Conclusions US + MB treatment could improve the quality of wound healing and granulation tissues were maturated earlier than MB, US treatment and control group, which could accelerate wound healing. High temperature,high pressure and some kind of chemistry effecs induced by microbubble destruction with ultrasound can stimulate the secretion of endogenous VEGF, which may be the mechanism of promoting angiogenesis and wound healing.     

超声微泡对射频消融效果影响的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂对射频消融效果的影响及应用价值.方法 对20只活体兔肝分别以无造影剂及术中造影行射频消融术,评价气化区显示效果和消融时间,并测量气化区、术后造影缺损区及大体病理的大小,分析其相关性.结果 加入微泡造影剂不影响射频消融的范围,但气化区形态更规则稳定,而且与凝固灶范围呈高度相关,同时可使施加射频时间明显缩短.结论 射频消融中加入微泡造影剂有助于识别消融区范围,可预防消融区周围脏器及血管受损.     

超声靶向微泡破碎和生物可降解纳米粒

目的 探讨超声靶向微泡破碎(UTMD)的物理靶向和纳米粒的生物靶向联合的双靶向方法细胞内递送siRNAs的效果.方法 制备RGD和非RGD生物可降解纳米粒;L16(45)正交设计筛选超声、微泡、纳米粒的优化参数;实验分成优化参数组、RGD纳米粒组、非RGD纳米粒组和空白对照组;倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察并检测分子探针Cy3标记的siRNAs在细胞内的摄取.结果 RGD纳米粒组的细胞摄取率和荧光强度分别为(93.49±1.37)%和34.28±2.06,优化参数组的细胞摄取率和荧光强度分别为(88.33±1.24)%和30.59±3.93,两组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).非RGD纳米粒组的细胞摄取率和荧光强度分别为(71.24±2.80)%和18.39±0.90,优化参数组的细胞摄取率和荧光强度分别为(84.78±2.13)%和27.18±0.91,两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 UTMD物理靶向和纳米粒生物靶向联合的双靶向方法不能提高siRNAs的细胞内递送.

Abstract：

Objective To investigate the intracellular delivery of siRNAs through the applications of ultrasound targeted microbubbles destruction(UTMD)and biodegradable nanoparticles carriers.Methods Preparation of nanoparticles with and without RGD sequences,parameters optimization via L16(45)orthogonal design,control experiments in groups of optimization,RGD targeted nanoparticles,non-RGD nanoparticles and blank control, and determinations by inverted fluorescence microscope and flow cytometry were performed.Results The uptake and fluorescence intensity of PC-3 cells in group of RGD targeted nanoparticle was (93.49±1.37)% and 34.28±2.06 respectively,and that in group of optimization was (88.33±1.24)% and 30.59±3.93 respectively(P＞0.05).Whereas the uptake and fluorescence intensity of PC-3 cells in group of non-RGD nanoparticles was(71.24±2.80)% and 18.39±0.90 respectively,and that in group of optimization was (84.78±2.13)% and 27.18±0.91 respectively(P＜0.05).ConclusionsThe applications of UTMD with RGD targted nanoparticles cannot increase the intracellular delivery of siRNAs.     

比较两种制备载紫杉醇超声微泡的方法

目的 比较能被超声击破的两种载紫杉醇超声微泡的制备方法,并评价其理化性质以及超声散射强度.方法 用单纯紫杉醇法Ⅰ号和三醋酸甘油酯溶解法Ⅱ号分别制备载紫杉醇脂质超声微气泡,测定其包封率、载药量、粒径大小、分布和Zeta电位、pH值,并行超声击破试验及兔VX2皮下肿瘤显像试验. 结果两种微泡显像无明显差异,可被低能量超声击破,但Ⅱ号(加入三醋酸甘油酯)脂质微泡较Ⅰ号(常规冷冻干燥法制备)载药微泡粒径显著减小[(1.07±0.38)μm vs(2.79±0.41)μm,P<0.01],表面电位增高[(19.10±0.32)mV vs (-5.90±0.21)mV,P<0.01],包封率和载药量显著增高[(95.00±1.22)% vs (36.10±4.74)%,P<0.01;(5.60±0.11)% vs (0.50±0.04)%, P<0.01]. 结论 三醋酸甘油酯溶解法制备的Ⅱ号微泡在局部药物释放中具有更大的应用价值.     

超声与微泡在血栓性疾病诊断与治疗中的作用

临床上早期准确地检出血栓并加以治疗,对于降低血栓并发症的发生率非常重要。采用特异性配体(包括抗体、受体蛋白等)与白蛋白或脂质体连接形成靶向超声造影剂可能是一种很有前途的导向诊断和治疗方法。制备一种能与血栓靶向黏附的超声微泡以及寻找一种适当强度的超声能量来有效诱导增强超声空化作用是达到靶向诊断与助溶治疗的条件。     

超声联合微泡阻断兔正常肝血流的再研究

目的 探讨采用改进声学参数的超声治疗仪激励循环微泡空化,延长正常兔肝血流阻断时间的可行性.方法 改进型脉冲式超声空化治疗仪,治疗头频率831 kHz,峰值负压4.3 MPa,平均声强1.25 W/cm2.9只新西兰大白兔麻醉后开腹暴露肝,经耳缘静脉缓慢推注微泡的同时予以超声辐照肝5min;其中6只分别于治疗前、治疗后即刻、30 min、60 min及48 h对治疗靶区行超声造影,视觉观察并用声学密度方法测量各时间点峰值强度(PI)变化;其余3只用于治疗后即刻病理学检查.结果 治疗前肝实质造影增强显著并且均匀,PI为(-51.88±4.26)dB,治疗后即刻靶区PI降至(- 62.53±4.83)dB,视觉观察血流灌注几乎完全消失,30～60 min后肝血流灌注呈缓慢恢复,48 h后几乎恢复正常,PI为(- 52.00±4.60)dB.治疗后即刻、30 min、60 min肝实质平均PI低于治疗前及治疗后48 h,差异均有统计学意义(P＜0.05),治疗前与治疗后48 h差异无统计学意义(P＞0.05).光镜下可见肝细胞弥漫性混浊肿胀,挤压肝窦及窦状间隙;门静脉周围出血、血肿形成.结论 超声联合微泡可以阻断正常兔肝的血流灌注达1h,其阻断机制可能主要是肝细胞肿胀.     

超声微泡介导体外转染hAng-1基因最佳条件的初步探讨

目的 探讨SonoVue微泡携带人血管生成素-1(hAng-1)基因在体外转染时超声照射强度、微泡浓度、DNA浓度等对转染效率和细胞活性的影响,以确定最佳转染条件.方法 将连接有eGFP-C_3-hAng-1质粒的SonoVue微泡以不同方式与293 T细胞混合,在超声照射下进行基因转染.分别检测不同超声照射强度、照射时间、不同微泡浓度和DNA浓度下的基因转染效率和细胞存活率.结果 随着超声照射强度、照射时间、微泡浓度和DNA浓度的增加,基因转染效率显著增加,细胞存活率在90%以上;当照射强度达到1.5 W/cm~2以上,照射时间超过30 s,微泡浓度和DNA浓度分别达到20%和15 mg/L后hAng-1基因的转染效率不再显著升高,而细胞存活率显著下降(P<0.01).结论 SonoVue微泡体外转染hAng-1基因的最佳条件为以细胞贴壁方式混合载基因微泡.照射强度1.5 W/cm~2,照射时间30 s,微泡浓度和DNA浓度分别为20%和15 mg/L.     

诊断超声加微泡造影剂对新生血管的作用

目的评价诊断超声加微泡造影剂对兔VX2肝肿瘤新生血管的作用.方法用二维灰阶超声监测6只大白兔肿瘤生长情况,待肿瘤长至长径约0.6～1.0 cm时进行实验.实验分为两组,处理组注射微泡造影剂(全氟显),对照组注射相同剂量的生理盐水.先用二维超声定位肿瘤,然后对处理组大白兔通过兔耳缘静脉缓慢注射微泡造影剂,剂量为0.10 ml/kg,注射时间约5 s.注射的同时行持续性二维超声显像(将MI调至1.4).整个显像过程持续6～7 min.然后两组肝肿瘤取材后送做透射电镜及切片HE染色检查.结果超声微泡造影剂能够显著增强肿瘤显像,同时也存在对肿瘤血管明显的生物学效应.在光镜下未见明显的肿瘤血管损坏,未见红细胞渗出等改变,但在电镜下可见肿瘤新生毛细血管明显的超微结构破坏,包括线粒体肿涨、髓样变及胞质空化等改变.结论高机械指数诊断超声加超声微泡造影剂能够破坏肿瘤新生血管的超微结构.     

P-选择素靶向超声微泡与普通超声微泡粘附途径和效能的对比研究

目的荧光显微镜直视下对比评价P-选择素靶向超声微泡与普通超声微泡在炎症内皮上的粘附途径和效能。方法构建携荧光FITC、抗P-选择素单抗的靶向超声微泡（MBp）和携荧光FITC普通超声微泡（MB）,随机经静脉弹丸式分别注入对照组（10只）和肿瘤坏死因子（TNF—α）处理组（10只）的小鼠提睾肌炎症模型。同时,20高倍荧光显微镜观测5min内两组不同微泡在提睾肌微血管中的粘附数量和粘附途径。结果TNF—α处理组MBp粘附数量为（12±2．6）个／视野,而MB粘附数量为（3±1．2）个／视野,两者差异有统计学意义（P〈0．01）;且TNF—α处理组MBp粘附数量分别为对照组MBp和MB的（6．4±1．7）倍和（9．9±2．1）倍（P〈0．01）。TNF-Ⅱ处理组和对照组分别有（69．6±2．6）％和（56．6±25．4％）的MBp通过直接与内皮细胞结合实现粘附,而MB内皮粘附率仅为（24．6±23．3）％和（20．0±27．4）％。结论与MB比较,MBp能高效、特异地粘附于炎症组织血管内皮上,应用其可有效评价血管内皮炎症反应或其他组织损伤。     

超声联合微气泡开放大鼠血脑屏障的实验研究

目的 探讨超声联合微气泡开放大鼠血脑屏障的安全性及有效性.方法 经大鼠尾静脉注射微气泡声诺维,同时采用GE Vivid 7超声辐射大鼠头颅,辐射深度经磁共振(MRI)扫描辅助定位于基底节区;以MRI增强扫描和荧光显微镜观察伊文思蓝的方法来检测血脑屏障开放程度,苏木素伊红(HE)染色观察细胞形态检测实验的安全性.结果 超声联合微气泡辐射大鼠头颅后,在MRI增强扫描T1W1上观察到辐射区域信号增强,荧光显微镜下观察到辐射区域伊文思蓝的红色荧光;HE染色细胞形态正常,结构完整.结论 超声联合微气泡可靶向、无创地开放大鼠血脑屏障,为中枢神经系统疾病的药物和干细胞治疗提供了新途径.     

超声造影评价载血管内皮细胞生长因子抑制剂微泡结合超声辐照对裸鼠皮下结肠癌移植瘤治疗效果的初步研究

目的 应用超声造影评价超声介导的载血管内皮细胞生长因子抑制剂(vascular endothelial growth factor inhibitor,VEGFI)微泡对实验裸鼠结肠癌的治疗效果.方法 18只皮下种植结肠癌肿瘤的Balb/c裸鼠模型随机分为三组:A组(6只)为对照组,接受裸脂质微泡超声造影检查及假照;B组(6只),裸脂质微泡超声造影检查及超声辐照;C组(6只),载VEGFI脂质微泡及超声辐照.辐照前、辐照后1d、辐照后1周分别进行实时超声造影检查,存储图像进行声学定量脱机分析,获取峰值强度(PI)、局部血容量(RBV)、局部血流量(RBF)等造影参数并加以比较.结果 辐照前三组PI、RBV、RBF差异无统计学意义(P＞0.05);A组假照后1 dPI、RBV、RBF高于假照前,但差异无统计学意义(P＞0.05),1周后PI、RBV、RBF明显高于假照前,差异有统计学意义(P＜0.05);B组辐照后1 dPI、RBF、RBV较辐照前减小,差异有统计学意义(P＜0.05),而1周后PI、RBF、RBV又上升,与辐照前比较差异无统计学意义(P＞0.05);C组辐照后1d、辐照后1周PI、RBV、RBF均较辐照前减小,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 载VEGFI微泡联合超声辐照可以增强对实验裸鼠结肠癌的治疗效果.