人LNα4链LG3-4组件的优化表达及活性检测

目的优化人层粘连蛋白α4链LG3-4组件基因在大肠杆菌中的表达条件。方法分别从诱导温度、诱导时间、IPTG浓度等方面进行优化。表达产物经Ni-NTA介质纯化,MTT法检测目的蛋白对人肺癌A549细胞粘附及增殖功能的影响。结果在20℃下,1mmol/L的IPTG诱导6h,目的蛋白呈最佳可溶性表达;在37℃下,2mmol/L的IPTG诱导4h,呈最佳包涵体形式表达。纯化后目的蛋白纯度达96%,且具有良好的增强人肺癌A549细胞伸展和粘附的功能。结论已确立了hLNα4LG3-4重组蛋白在大肠杆菌中的最佳表达条件。     

重组人B7-H4IgV融合蛋白的表达、纯化及活性

目的表达、纯化重组人B7-H4IgV融合蛋白,并检测其活性。方法将人B7-H4胞外片段IgV区基因插入pQE-30原核表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA柱亲和层析纯化,并进行Westernblot鉴定。用纯化的rhB7-H4IgV蛋白免疫昆明小鼠,经ELISA、流式细胞术测定小鼠抗血清的活性;免疫SP2/0荷瘤小鼠,观察对肿瘤细胞生长的抑制作用。结果表达的rhB7-H4IgV蛋白约占菌体总蛋白的25%,纯化后蛋白纯度为93%,浓度约为0.5mg/ml,与抗His单抗可产生特异性反应条带。免疫昆明小鼠产生的抗血清效价可达1∶10000,可与SP2/0肿瘤细胞结合。rhB7-H4IgV蛋白对SP2/0移植瘤生长具有一定的抑制作用。结论已成功表达并纯化了重组人B7-H4IgV融合蛋白,纯化蛋白可诱发小鼠体内免疫应答,产生的抗体能与表达B7-H4的肿瘤细胞SP2/0结合,rhB7-H4IgV蛋白在一定程度上能抑制SP2/0移植瘤的生长。     

人巨细胞病毒融合表达载体的构建及鉴定

目的构建含人巨细胞病毒(HCMV)gB680糖蛋白基因和突变的pp65蛋白基因(pp65m)的融合表达载体,并检测其在COS-7细胞中的表达。方法用PCR法从HCMV基因组中钓取gB680和pp65m蛋白基因,分别亚克隆入pMD18-T载体中,经酶切鉴定并测序后,构建真核表达载体pVAX1/gB680+pp65m,以ELISA法检测其在COS-7细胞中的瞬时表达。结果重组质粒含有gB680和pp65m融合基因,并能在COS-7细胞中表达。结论已成功构建了人巨细胞病毒融合表达载体,并可在真核细胞中表达。     

融合蛋白GST-PADI4可溶性表达条件的优化及纯化

目的优化融合蛋白GST-PADI4的可溶性表达条件,并对蛋白进行纯化。方法对融合蛋白GST-PADI4工程菌的诱导温度(16、20、25、30、37℃)、诱导剂IPTG浓度(0.05、0.1、0.2、0.5、1 mmol/L)、诱导时菌液A600值(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0)、诱导时间(8、12、16、20、24 h)进行优化,分析融合蛋白GST-PADI4的可溶性表达情况;按优化的表达条件进行大量表达后,采用Sepharose 4B亲和层析柱对融合蛋白进行纯化。结果在16℃,菌液A600值约为0.4时,以0.1 mmol/L IPTG诱导12 h,融合蛋白GST-PADI4有较高的可溶性表达;纯化的融合蛋白纯度为91%。结论优化了融合蛋白GST-PADI4的可溶性表达条件,并获得了高纯度的可溶性融合蛋白,为后续研究PADI4蛋白的功能奠定了基础。     

GST-AEP融合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的利用GST融合基因表达系统表达GST-AEP融合蛋白,并进行纯化及鉴定。方法IPTG诱导重组质粒pGEX-4T-1/AEP在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,溶菌酶裂解后,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行12%SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果大肠杆菌经诱导,高效表达出相对分子质量约34000的蛋白,与GST-AEP融合蛋白相符。Western blot结果显示该蛋白能够被兔抗GST多克隆抗体识别。结论已成功表达并纯化了融合蛋白,为更深入研究AEP的结构和功能奠定了基础。     

表达HBsAg及rhIFNα2b融合蛋白的人参细胞株的建立

目的建立表达HBsAg及rhIFNα2b融合蛋白的人参细胞株。方法采用PCR方法分别扩增HBsAg及rhIFNα2b基因,以GS linker连接后,克隆入表达质粒pBI121,构建植物细胞表达质粒pBISI,转化农杆菌LBA4404,感染人参愈伤组织细胞。经G418筛选抗性细胞株,提取细胞基因组DNA,进行PCR检测;应用ELISA法检测HBsAg及rhIFNα2b的表达;通过Western blot分析表达蛋白的反应原性。结果重组表达质粒pBISI经酶切鉴定,表明构建正确。筛选得到3株正常生长的人参细胞株,基因组DNA扩增得到约1200bp的融合基因片段;经ELISA检测,其中1株能够表达HBsAg及rhIFNα2b;表达的蛋白与鼠抗HBsAg血清在相对分子质量35000处出现特异条带。结论已获得了表达HBsAg及rhIFNα2b融合蛋白的人参细胞株。     

绿色荧光蛋白融合表达HBsAg基因载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的　构建绿色荧光蛋白融合表达HBsAg基因的载体 ,并检测其在COS 7细胞中的表达。方法　采用PCR获得HBsAg基因 ;利用该基因片段和质粒pEGFP 3.1的HindⅢ /KpnⅠ限制性酶切位点构建融合表达载体pGHBs 3.1;通过脂质体介导的方法将该载体转染到COS 7细胞中 ,用PCR法检测基因转染 ,ELISA检测HBsAg的瞬时表达 ,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达。结果　融合表达载体pGHBs 3.1转染COS 7细胞后 ,在细胞中检测到HBsAg基因片段 ,转染细胞培养上清中检测到HBsAg表达 ,用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达。结论　表达载体pGHBs 3.1在COS 7细胞中获得了表达 ,表达的融合蛋白具有HBsAg和绿色荧光蛋白的双重活性 ,该载体可用绿色荧光蛋白作为报告基因观察HBsAg的表达及定位。     

CHO细胞表达重组人生长激素-Fc融合蛋白糖基化类型的优化

目的 优化CHO细胞表达重组人生长激素-Fc(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白,以获得更优的糖基化比例及更低含量的高甘露糖。方法 在7 L生物反应器中培养表达rhGH-Fc的CHO细胞,通过改善补料培养基成分(使用3种商业化培养基：Gly-1:EX-CELL Glycosylation Adjust、Gly-2:SHEFF-CHO PLUS PG ACF、Gly-3:EfficientFeed C+AGT Supplement&GlycanTune C+Total Feed),对rhGH-Fc糖基化修饰进行调整,并通过质谱分析目的蛋白的糖基化类型及比例。结果 Gly-1、Gly-2、Gly-3的G0F(主要糖型一般为G0、G1和G2,F为岩藻糖)分别为32.89%、58.66%、33.28%,G1F分别为31.39%、18.03%、34.90%,G2F分别为31.39%、18.03%、34.90%,Gly-1与Gly-3使目的蛋白含有更少的G0F及更多的G2F;Gly-3补料方案在高甘露糖修饰方面较其他两种方案更少...     

重组人蛋白C在HEK293细胞中的表达与鉴定

目的获得转染人蛋白CcDNA的工程细胞株,实现重组蛋白C的表达。方法将构建好的重组表达载体pIRES-hPC用脂质体介导的方法转染HEK293细胞,经G418加压筛选、细胞有限稀释法等获得克隆细胞株,收集无血清培养上清,浓缩后进行鉴定。结果经G418筛选得到了21株克隆化细胞,SDS-PAGE和Westernblot鉴定表明,表达产物含有人蛋白C,且具有抗凝活性。结论在哺乳动物细胞中已成功表达重组人蛋白C,为进一步深入研究及产业化奠定了基础。     

人溶菌酶-木聚糖酶融合基因在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLY)-木聚糖酶(Xylanases,XynⅡ)融合基因。方法通过PCR技术将hLY基因与XynⅡ基因连接,中间插入肠激酶识别位点序列;将其克隆至载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9K-XynⅡ-EKsite-hLY,经SacⅠ线性化后,电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选得到高拷贝转化子,PCR鉴定为阳性的克隆用甲醇进行诱导;表达的融合蛋白经Sephadex G-75凝胶柱层析纯化后,用肠激酶酶切,分别采用改良舒加法和DNS法测定hLY和XynⅡ的活性。结果获得的融合基因序列与理论序列完全一致;重组表达质粒构建正确;融合蛋白的hLY和XynⅡ活性分别为170和158 U/ml,经肠激酶酶切后,hLY的活性为520 U/ml,XynⅡ的活性达244 U/ml。结论已在毕赤酵母中成功表达了XynⅡ-EKsite-hLY融合基因,经肠激酶酶切后的目的蛋白活性均有较大提高。     

穿膜肽HIV-TAT与呼吸道合胞病毒G蛋白片段G1及CTL表位融合蛋白的表达及纯化

目的在大肠杆菌中表达含穿膜肽HIV-TAT与呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白片段G1及CTL表位的融合蛋白,并进行纯化。方法以质粒pET-G1F/M2为模板,扩增含TAT、RSVG蛋白片段G1和CTL表位F/M2的融合基因片段,与原核表达质粒pET-His连接,构建融合表达质粒pET-TAT-G1F/M2,转化E.coli BL21(DE3)plysS进行诱导表达,采用Ni2+螯合亲和层析法纯化经尿素变性的包涵体,梯度透析复性纯化的目的蛋白,并进行Westernblot鉴定。结果在E.coli中可高效表达重组蛋白TAT-G1F/M2,表达量占菌体总蛋白的30%以上,目的蛋白主要存在于包涵体中。经变性、纯化、复性可获得高纯度(>95%)特异性的TAT-G1F/M2蛋白。结论已在大肠杆菌中成功表达了融合蛋白TAT-G1F/M2,为进一步进行RSV体内体外免疫学研究奠定了基础。     

分泌型rhGM-CSF/IL-2融合蛋白表达载体的构建

目的 将GM-CSF基因与IL-2基因通过一中间接头G-G-G-S-G-G-S-G连接到一起,并在E.coli中分泌表达具有更高GM-CSF和IL-2生物活性的融合蛋白分子。方法 在引物设计中,通过选择密码子,在Linker的中前部设计了一个BamHI酶切位点,GM-CSF的下游引物和IL-2的上游引物均起始于该位点。然后通过PCR、酶切、连接等一系列分子克隆的方法,构建融合蛋白的克隆及表达载体。结果 经EcoRI/SaII双酶切鉴定,克隆载体pUC19GM-CSF/L/IL-2及表达载体pBVGMCSF/L/IL-2中均插入了正确的外源片段。结论 克隆及表达载体的成功构建,为进一步表达融合蛋白及活性研究打下了基础。     

人脑钠肽与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及其活性

目的在毕赤酵母中表达重组人脑钠肽(BNP)与人血清白蛋白(HSA)融合蛋白,并检测其活性。方法重叠PCR法拼接BNP二联体与HSA基因,插入表达载体pPIC9K,电穿孔法转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析、Western blot鉴定及活性检测。结果融合基因(BNP)2-HSA经测序正确,重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确。诱导72h,融合蛋白表达量最高,可达200mg/ml,且具有良好的反应原性,其活性为rhBNP标准品的1%。结论已在毕赤酵母中成功表达了具有一定生物活性的(BNP)2-HSA融合蛋白,为开发BNP长效药物奠定了基础。     

产气荚膜梭菌β_2-β_1融合基因的构建及初步表达

目的构建产气荚膜梭菌β2-β1毒素融合基因并在重组大肠杆菌中表达。方法采用PCR方法,从含β2毒素基因质粒CPB2-9中扩增出β2毒素基因,经NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后,回收0.73kb片段,再将含β1毒素基因质粒pXETB1经同样双酶切回收,与β2片段连接,转化BL21(DE3)中,进行诱导表达。结果经SDS-PAGE和Westernblot分析表明,重组菌株BL21(DE3)可表达β2-β1融合蛋白,且该蛋白可以被相应的抗体所识别。结论已成功构建了β2-β1融合基因,并在重组大肠杆菌中表达。