Nrf2基因的过表达对酒精诱导的HepG2细胞损伤的保护作用及机制

目的: 探讨于人类肝癌细胞系HepG2中过表达Nrf2基因后对由酒精处理引起的细胞氧化压力和炎症反应的影响和机制。方法: 经过Keap1 siRNA预处理的HepG2细胞经含 75 mmol/L 酒精的培养基孵育 72 h 后,应用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测细胞活性以及应用Western blot和荧光定量实时聚合酶链反应（PCR）方法检测细胞内氧化压力和促炎症蛋白的表达水平。同时,转录因子核因子κB（NF-κB）的活性以及其抑制蛋白IκBα的表达也通过Western blot检测。结果: 经含75 mmol/L酒精的培养基孵育 72 h 后,HepG2细胞的细胞活性显著下降,同时伴随着细胞内抗氧化酶表达水平的显著下降和促炎症蛋白表达的显著上升。Nrf2基因的过表达显著增加了HepG2细胞活性,恢复了细胞内抗氧化酶的表达水平,并改善了细胞内的炎症反应（P<0.05）。Nrf2的过表达亦通过恢复IκBα的水平降低了由酒精处理诱导的转录因子NF-κB的活性（P<0.05）。 结论: Nrf2基因的过表达可以有效改善酒精造成的HepG2细胞内氧化压力和炎症反应,该效应部分通过抑制NF-κB的活性来完成。     

地塞米松对顺铂诱导的HepG2细胞凋亡及Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响

目的: 探讨地塞米松对顺铂诱导HepG2细胞凋亡的影响,并观察Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达。方法: HepG2细胞与顺铂及不同浓度的地塞米松共培养,RT-PCR检测Bcl-2、Caspase-3的mRNA表达,Western blot检测Bcl-2、Caspase-3蛋白表达,流式细胞术(FACS)检测各组HepG2细胞的凋亡情况。结果: 随着地塞米松浓度的增加,HepG2细胞中Bcl-2蛋白表达量升高,Caspase-3蛋白表达量下降。同时细胞凋亡率降低。结论: 地塞米松部分通过Bcl-2途径抑制肝癌细胞的凋亡,而Caspase-3又在调控细胞凋亡中起重要作用。     

熊果酸减轻高糖高脂诱导的人主动脉内皮细胞损伤

目的：探讨熊果酸（ursolic acid, UA）对人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells, HAEC）高糖高脂损伤的影响及机制。方法：MTT法选取合适的高糖和棕榈酸钠（sodium palmitate, SPA）损伤浓度以及UA预孵浓度。采用试剂盒检测NO、ROS的含量,乳酸脱氢酶（LDH）的释放率以及抗氧化酶包括总超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性。Western blot法检测内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、细胞间黏附分子（ICAM-1）、血管细胞黏附分子（VCAM-1）、半胱天冬酶-1（caspase-1）以及GSDMD的蛋白表达情况。Hoechst33342联合PI荧光染色检测细胞膜的完整状态以探讨焦亡发生情况。观察UA对HAEC的保护作用。结果：预孵UA（1 μmol/L和5 μmol/L）可以减轻高糖高脂（30 mmol/L GLU+0.1 mmol/L SPA）造成的HAEC损伤,提升HAEC活力,减轻氧化应激损伤,增加NO的释放和eNOS的蛋白表达,减少黏附分子的蛋白表达,减少细胞焦亡。 结论：UA可能通过减轻高糖高脂诱导的HAEC氧化应激反应,抑制细胞焦亡的发生,减轻内皮细胞损伤。     

新型格列酮类化合物ANY2对HepG2细胞糖代谢的影响

目的: 体外实验研究新型格列酮类化合物ANY₂对糖代谢的影响。方法: 采用高浓度胰岛素持续作用肝癌细胞株( HepG₂)24 h 建立胰岛素抵抗模型( IR-HepG₂),并观察ANY₂对细胞葡萄糖消耗(GC) 、对细胞内糖原含量、糖异生及糖酵解作用的影响。结果: ANY₂能显著增加 IR-HepG₂在高、中、低糖条件下的葡萄糖消耗, 并呈明显的剂量依赖性;增加 IR-HepG₂细胞内糖原含量,但与模型组相比,仅在高浓度差异有统计学意义;减少IR-HepG2 细胞以乳酸为底物的糖异生量;提高糖酵解作用中IR-HepG₂细胞乳酸的生成和细胞内丙酮酸激酶(PK) 活力。结论: ANY₂可显著改善IR-HepG₂ 细胞的糖代谢作用。     

系统性红斑狼疮患者血清抗内皮细胞抗体和抗β2糖蛋白I抗体水平及其对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的: 检测抗内皮细胞抗体(AECA)和抗β₂GP-Ⅰ抗体在SLE患者血清中的水平及探讨AECA对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响。方法: 收集系统性红斑狼疮(SLE)患者90例和正常对照40例,留取血清,经酶联免疫吸附法(ELISA)检测AECA和抗β₂GP-Ⅰ抗体水平。收集SLE患者部分临床指标,分析AECA和抗β₂GP-Ⅰ抗体水平与临床指标间的关系。将不同浓度AECA的SLE患者血清加入HUVEC培养基,应用四唑盐比色试验(MTT)法检测各组OD值判断内皮细胞增殖状态。结果: SLE患者血清中AECA和抗β₂GP-Ⅰ抗体水平显著高于正常对照组(P<0.01)。在90例SLE患者中33例抗β₂GP-Ⅰ抗体阳性,该33例SLE患者对应的AECA、APTT水平和SLE活动评分(SLEDAI)积分均显著高于其余57例SLE患者(P<0.01,P<0.05,P<0.05)。同时该33例患者AECA和抗β₂GP-Ⅰ抗体水平呈高度正相关(r=0.984, P<0.01),AECA和抗β₂GP-Ⅰ抗体水平均与SLEDAI呈正相关(P<0.05),抗β₂GP-Ⅰ抗体水平与凝血酶原时间(PT)间存在正相关(r=0.349, P<0.05)。空白对照组、健康对照血清组和低浓度AECA血清组间OD值无差异,而高浓度AECA血清组OD值显著低于以上3组(P<0.05)。结论: AECA和抗β₂GP-Ⅰ抗体与SLE疾病活动相关,AECA在体外对HUVEC增殖有抑制作用。     

熊果酸通过抑制TLR-4/NF-κB发挥对心脏缺血再灌注损伤保护作用的研究

目的: 研究熊果酸(ursolic acid, UA)在Wistar大鼠离体心脏缺血再灌注损伤中的保护作用以及TLR-4/NF-κB信号通路在其中所起的作用。 方法: 12周的清洁健康成年雄性Wistar大鼠20只,体质量200~250 g,随机分为2组：缺血再灌注组(I/R组)和熊果酸干预组（UA组）。适应性饲养一周后,UA组给予灌胃熊果酸 40 mg/kg,I/R组给予同样方法灌等量生理盐水,连续饲养 30 d 后应用langendorff系统建立离体心脏缺血再灌注损伤模型,各组均在阻断左冠状动脉(LAD)前用K-H缓冲液维持灌注 10 min,阻断LAD 30 min 后继续K-H缓冲液再灌注 120 min。在缺血前即刻(T₀)、再灌注即刻（T₁）、再灌注 30 min（T₂）以及 120 min (T₃) 记录心率(HR)、左心室舒张末压(LVEDP)、左心室发展压(LVDP)、左心室压力最大上升和最大下降速率(±dp/dt_max);心脏标本留取进行氯化三苯基四氮唑法（TTC）染色观察心肌梗死面积;应用qRT-PCR检测TLR-4、NF-κB、IL-6、TNF-α mRNA含量;Western blot法检测TLR-4、NF-κB、IL-6、TNF-α蛋白表达水平。 结果: 与I/R组相比较,给予 UA预处理后,心肌梗死面积显著减少（33.94%±2.13% vs 21.14%±1.71%,P<0.05）;左心室功能明显改善(P<0.05);同时发现心脏标本中TLR-4、NF-κB、IL-6以及TNF-α的mRNA表达减少（P<0.05）,蛋白表达水平也明显下降(P<0.05)。结论: UA预处理可通过抑制TLR-4/NF-κB信号通路降低IL-6、TNF-α等炎症因子的产生,从而明显改善Wistar大鼠离体心脏缺血再灌注损伤。     

反义寡核苷酸抑制早期生长反应基因-1表达对内皮细胞缺氧复氧损伤的影响

目的: 研究反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,AS-ODN)抑制早期生长反应基因1(early growth response gene-1,Egr-1)表达对内皮细胞缺氧复氧(anoxia/reoxygenation,A/R)损伤的影响。方法: 采用新生大鼠进行心脏微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)原代培养,取3~4代的CMECs建立缺氧复氧模型。细胞随机分为6组:对照(Con)组、缺氧复氧组(A/R)、溶剂组(LIP)、反义寡核苷酸转染组(AS)、正义寡核苷酸转染组(S)和错配寡核苷酸转染组(Sc)。通过测定细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)及内皮细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量,观察内皮细胞损伤程度;应用ELISA法测定细胞培养上清液肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量,观察内皮细胞炎症反应水平;Western-blot法检测培养内皮细胞中Egr-1的蛋白表达水平;显微镜下观察细胞形态学改变并计算存活率。结果: A/R造成内皮细胞内MDA升高,SOD下降,上清液中LDH、TNF-α含量升高,A/R刺激下细胞Egr-1的蛋白表达水平明显升高;A/R刺激前给予AS-ODN可抑制Egr-1蛋白的表达,减轻内皮细胞的损伤及炎症反应程度,提高细胞存活率。结论: AS-ODN抑制培养内皮细胞Egr-1的表达,并降低A/R损伤,提示Egr-1与缺氧复氧所致的心脏微血管内皮细胞损伤密切相关。     

睑板腺癌中MMP-2的表达及其临床意义

目的: 探讨基质金属蛋白酶-2(matrix metallop roteinase-2,MMP-2)在睑板腺囊肿和睑板腺癌组织中的表达差异及其与睑板腺癌临床病理特征的关系和临床意义。方法: 采用免疫组化SP法检测睑板腺囊肿和睑板腺癌组织中MMP-2、血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况,以CD34标记检测肿瘤内的微血管密度(microvessel density, MVD),分析MMP-2与临床病理因素、VEGF、MVD的关系。结果: MMP-2在睑板腺癌组织中阳性表达率高于睑板腺囊肿(56% vs 20%),差异具有统计学意义(P﹤0.05),而VEGF表达在睑板腺癌和睑板腺囊肿中差别无统计学意义;MMP-2蛋白表达与肿瘤复发和局部浸润有关 (P﹤0.05),与患者年龄、组织学分级、病理类型和病程无关 (P﹥0.05)。MMP-2阳性的肿瘤组织内MVD明显高于MMP-2阴性肿瘤(P﹤0.05),VEGF的表达与MMP-2无相关性(r=-0.049,P=0.748)。结论: MMP-2在睑板腺癌中高表达,可能通过非VEFG依赖途径促进肿瘤的血管生成,进而参与肿瘤浸润和复发。     

三氧化二砷、VEGF对人骨肉瘤Saos-2细胞TRAF-2和STAT-6表达的影响

目的: 探讨肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF-2）和信号转导子与转录激活子6（STAT-6）在骨肉瘤发病机制中的作用,及三氧化二砷（As₂O₃）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）对其表达的影响。方法: 人骨肉瘤Saos-2细胞经分别加入As₂O₃和VEGF培养48 h后,采用实时荧光定量PCR法和流式细胞术测定TRAF-2和STAT-6的表达。 结果: 100 ng/mL 浓度的VEGF能显著上调TRAF-2及STAT-6的表达(P<0.05,P<0.01);2 μmol/L以上的As₂O₃能显著下调TRAF-2及STAT-6的表达(P<0.05,P<0.01),它还能显著降低VEGF诱导作用(P<0.05,P<0.01)。结论: TRAF-2和STAT-6在骨肉瘤的发病机制中可能起了重要作用,VEGF具有促进疾病的进展作用,而As₂O₃则反之,两者具有一定的量-效关系。     

血管紧张素Ⅱ和缬沙坦对血管内皮细胞AT1/AT2及eNOS 表达的调节作用

目的: 研究缬沙坦在血管内皮细胞中对血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ) 受体I 型(AT₁) 和Ⅱ型(AT₂) 、一氧化氮合酶(eNOS) 的表达和一氧化氮(NO) 生成的影响。方法: 使用人脐静脉内皮细胞系ECV-304(HUVECs), 分为对照组、Ang Ⅱ组、缬沙坦组和Ang Ⅱ加缬沙坦组, 作用不同时间, 检测AT₁/AT₂ 的mRNA和蛋白表达、eNOS 的蛋白表达和NO 的生成。结果: 在HUVECs 细胞中未检测到AT₂的蛋白表达,Ang Ⅱ 、缬沙坦均显著抑制细胞中AT₁的mRNA 和蛋白表达, 且缬沙坦呈明显的剂量依赖效应, Ang Ⅱ作用36 h 显著抑制NO 的生成而合用缬沙坦可明显逆转该效应。结论: 在HUVECs 中缬沙坦可通过自身的结合下调AT₁, 并能逆转Ang Ⅱ长时间作用对NO生成的抑制作用, 提示缬沙坦可改善血管内皮细胞的功能。     

低强度超声联合托泊替康诱导人肝癌细胞凋亡的研究

目的: 研究低强度超声联合托泊替康诱导人肝癌细胞(HepG2)凋亡的协同效应以及相关的机制。方法: 应用HepG2,实验分为托泊替康处理组、超声处理组、联合治疗组(托泊替康+超声),评估细胞生存活力、细胞凋亡,胞内托泊替康累积及空化效应。结果: 当超声强度为 0.8 W/cm² 及以上时,协同托泊替康能明显诱导HepG2细胞凋亡,1.0 W/cm² 超声辐照联合托泊替康时细胞凋亡率为 12.88%,空化效应在凋亡诱导实验中促进了托泊替康胞内渗入,增加胞内积累。结论: 联合低强度超声能增强托泊替康的凋亡诱导效应,空化效应是其协同增强的主要机制。     

人肝肿瘤细胞中霉酚酸II相代谢特征研究

目的: 研究和比较体内外肝肿瘤细胞和正常肝细胞II相代谢特征。方法: 采用体外培养人肝肿瘤细胞株与正常人肝细胞株、临床来源肝肿瘤组织与肿瘤旁组织,检测UGT1A9的基因与蛋白水平表达,以霉酚酸为模型药物、HPLC法定量测定霉酚酸及其葡萄糖醛酸结合物,考察霉酚酸在上述细胞和组织微粒体中的代谢强弱,分析肝肿瘤细胞与正常肝细胞中II相代谢酶UGT1A9的功能与差异。结果: 体外培养人肝肿瘤细胞HepG₂和临床来源人肝细胞瘤组织中UGT1A9表达分别高于正常人肝细胞L-O2和人肝肿瘤癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.01)。然而人肝肿瘤细胞HepG₂和人肝肿瘤组织对霉酚酸的代谢能力远低于人正常肝细胞L-O2和人肝肿瘤癌旁组织(P<0.05)。结论: 人肝肿瘤细胞与临床来源人肝细胞瘤组织中UGT1A9的表达与功能存在不相关性,提示肿瘤细胞中虽然UGT1A9表达较高,但其功能存在某些缺失,可能与肿瘤细胞内营养相对缺乏有关。     

NS-398 诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的: 研究选择性环氧化酶-2(COX-2) 抑制剂NS-398 对人肝癌细胞HepG₂ 凋亡的影响, 及其相关蛋白Bcl-2 在细胞凋亡中的作用。方法: 通过体外细胞培养, 应用荧光显微镜、透射电镜、流式细胞仪观察NS-398 对HepG₂ 的凋亡诱导作用, 应用免疫细胞化学法观察Bcl-2 在人肝癌细胞HepG₂ 凋亡中的表达。结果: NS-398 处理HepG₂ 细胞后, 电镜下可见到细胞核固缩、染色质凝集成新月型紧靠核膜周边,核碎裂、染色质片断化等典型的细胞凋亡形态变化。荧光显微镜及流式细胞检测则未见凋亡征象。免疫细胞化学分析显示, NS-398 处理后的HepG₂ 细胞,其Bcl-2 表达较对照组明显下降。结论: COX-2 选择性抑制剂NS-398 对人肝癌HepG₂ 细胞有显著的凋亡诱导作用;抗凋亡基因Bcl-2 在NS-398 诱导的HepG₂ 细胞凋亡中有重要的调控作用。     

川芎嗪对儿茶酚胺诱导大鼠心肌损伤时Bcl-2和Fas 蛋白表达的影响

目的: 观察川芎嗪对儿茶酚胺诱导大鼠心肌损伤时心肌细胞Bcl-2 和Fas 蛋白表达的影响。方法: 采用皮下多点注射异丙肾上腺素(ISO,5 mg·kg^-1) 每天1 次, 连续3 d, 诱导大鼠心肌损伤,采用免疫组化方法检测Bcl-2 和Fas 蛋白的水平, 并利用图像分析系统分析蛋白阳性表达区域平均光密度值。结果: 损伤组和川芎嗪保护组心肌细胞Bcl-2蛋白表达较对照组均显著升高(P<0.01), 损伤组Fas 蛋白水平较对照组也显著升高(P<0.01), 川芎嗪保护组的Fas 蛋白水平较损伤组显著下降(P<0.01), 且Bcl-2 Fas 比值也较损伤组和对照组明显增加。川芎嗪保护组的病理损伤程度明显低于损伤组。结论: 川芎嗪可抑制儿茶酚胺诱导的心肌损伤时心肌细胞中促凋亡基因Fas 的表达, 提高心肌细胞中Bcl-2 Fas 比值。     

天麻素抑制H2O2诱导的PC12细胞铁死亡

目的：研究天麻素对过氧化氢（H2O2）损伤的PC12细胞的保护作用及机制。方法：建立H2O2损伤PC12细胞神经损伤模型。MTT法检测细胞活力并确定H2O2最佳造模浓度,筛选和确定天麻素最佳处理浓度。试剂盒检测丙二醛（MDA）、总谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）水平和活力变化;流式细胞仪检测细胞脂质活性氧（ROS）水平;透射电子显微镜观察PC12细胞形态变化;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测p53、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）蛋白表达变化。结果：MTT法实验结果显示,50 μmol/L H2O2处理PC12细胞48 h,细胞生长抑制率接近50%;而天麻素（1、5、25 μmol/L）预处理4 h可提高H2O2损伤细胞的存活率,且其作用呈浓度依赖性。MDA、GSH、SOD检测结果表明天麻素降低H2O2处理后的MDA水平,并提高SOD和GSH活力。流式细胞仪检测发现,H2O2损伤后细胞内ROS的含量升高,而天麻素预处理后有效降低H2O2损伤的细胞内ROS的含量。透射电子显微镜观察结果显示,与正常组相比,50 μmol/L H2O2处理后PC12细胞的线粒体脊变厚,线粒体体积变小;天麻素预保护处理后,PC12细胞的线粒体形态趋于正常状态。Western blot结果表明,天麻素预保护后可升高H2O2损伤后GPX4蛋白表达水平,并降低p53蛋白表达水平。 结论：H2O2可通过增加PC12细胞内氧化应激水平引起铁死亡;天麻素预保护后可上调细胞内GPX4蛋白表达和下调p53蛋白表达,从而减少细胞氧化应激产生,抑制细胞铁死亡发生而发挥保护PC12细胞的作用。     

CYP2C19基因多态性真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的: 构建细胞色素P450 CYP2C19^*1、^*2、^*3真核表达载体,并分别转染人肝癌细胞(HepG2),建立高表达目的基因的稳定转染细胞系。方法: 应用化学合成法合成CYP2C19^*1(野生型)序列,再以此为模板,体外定点突变PCR法构建^*2、^*3(突变型)。DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.l(-),经菌落PCR、酶切以及测序鉴定后,脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR、Western Blot 分别检测CYP2C19^*1、^*2、^*3 mRNA以及蛋白的表达。结果: 成功构建了pcDNA3.1(-)-CYP2C19^*1、^*2、^*3表达质粒,并建立了相应稳定转染细胞系。进一步的RT-PCR和Western Blot检测结果表明,目的基因均得到了稳定的表达。结论: 人CYP2C19^*1、^*2、^*3稳定表达细胞系为研究创新药物或新药先导化合物临床前代谢性质的筛选和预测以及为临床潜在药物相互作用提供了有效实验平台。     

重组人白血病抑制因子体外诱导HL-60细胞凋亡与bcl-2及p5表达的关系

目的 探讨重组人白血病抑制因子(rh-LIF) 诱导HL-60 细胞凋亡的作用及其可能机制。 方法 不同剂量(10 ~ 4 000 U·ml^-1) 的rh-LIF 作用HL-60 细胞3 d 后, 用流式细胞仪观察分析细胞周期变化并检测细胞凋亡率, 用TUNEL 法检测原位细胞凋亡情况;分别用免疫组化法和原位杂交法检测rh-LIF 作用2、4、6 d 后P53 蛋白及p53 mRNA、bcl-2 mRNA 表达水平的改变。 结果 rh-LIF (10 ~ 4 000 U·ml^-1) 作用d 3, 细胞凋亡率较对照组显著增加, 其中以1 000 U·ml^-1组的作用最强;rh-LIF (800 U·ml^-1) 作用2 ~ 6 d,P53 蛋白和p53 mRNA 表达也同步增高,而bcl-2 mRNA 表达显著降低(P <0.01)。 结论 rh-LIF 能诱导HL-60 细胞凋亡, 该作用与P53 蛋白表达增加和bcl-2 表达降低有关。