柚皮苷对人卵巢癌SKOV3细胞P38MAPK及ERK1/2蛋白表达的影响

目的: 探讨中药柚皮苷对人卵巢癌SKOV3细胞P38MAPK及ERK1/2蛋白表达水平的影响。方法: 体外培养人卵巢癌SKOV3细胞,分为空白对照组、柚皮苷10、20、40 μmol/L 组、塞来昔布 80 μmol/L 组。Western Blot测定培养 48 h 后各组细胞中P38MAPK及ERK1/2蛋白表达水平。结果: Western Blot结果显示,与空白对照组相比,低浓度柚皮苷组(10、20 μmol/L)对SKOV3细胞P38MAPK及ERK1/2蛋白的表达无明显影响,而 40 μmol/L 柚皮苷及塞来昔布组可明显下调P38MAPK及ERK1/2蛋白表达,具有统计学差异(P<0.05)。结论: 柚皮苷能抑制人卵巢癌SKOV3细胞P38MAPK及ERK1/2蛋白的作用,从而可能阻断卵巢癌的发生、发展。     

槲寄生凝集素抑制人大肠癌HCT116 细胞环氧化酶-2 表达的研究

目的:探讨槲寄生凝集素对人大肠癌HCT116 细胞环氧化酶(COX-2) 表达的影响。方法:采用RT-PCR、Western blotting 和ELISA 等方法检测不同浓度(0.1 ～ 1 mg/L) 槲寄生凝集素对细胞COX-2 及其产物前列腺素E₂ (PGE₂) 表达的影响。结果:槲寄生凝集素可抑制HCT116 细胞的COX-2 mRNA、 蛋白表达及PGE₂ 的水平, 其抑制COX-2 蛋白的表达与PGE₂的水平相一致, 只在大剂量(1 mg/L) 时对COX-1 mRNA 有抑制作用。结论:槲寄生凝集素具有抑制HCT116 细胞的COX-2基因转录、蛋白表达和功能活性等作用, 在一定浓度(0.1 ～ 1 mg/L) 和时间范围(3 ～ 24 h) 内, 表现出时效与量效关系。     

塞来昔布胶囊犬口服给药的体内过程及一致性评价

目的: 建立Beagle犬血浆中塞来昔布的定量测定方法,考察Beagle犬口服塞来昔布胶囊体内药代动力学过程,并与进口的西乐葆胶囊比较,进行体内过程一致性评价。方法: 采用双周期自身交叉实验设计,8只Beagle犬分别单剂量口服西乐葆和塞来昔布胶囊,用HPLC法测定血浆中的塞来昔布浓度,以DAS 2.0 药代动力学计算程序拟合药物浓度-时间曲线,计算药动学参数和相对生物利用度。结果: 塞来昔布胶囊和西乐葆胶囊主要药代动力学参数t_max分别为(2.0±0.8)、(2.0±0.9) h、C_max分别为(902±433)、(764±295) μg/L、AUC_(0→t)分别为(10053±6100)、(9266±3967) μg·h·L^-1,差异均无统计学意义(P>0.05)。相对生物利用度为(106.0±26.7)%。结论: 塞来昔布胶囊与西乐葆胶囊的体内过程具有一致性。     

蟛蜞菊内酯对脂多糖诱导RAW264.7细胞环氧化酶2、NO及TNF-α的影响

目的: 研究蟛蜞菊内酯对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导RAW264.7巨噬细胞环氧化酶2(COX-2)、NO及TNF-α的作用。方法: ELISA方法检测 0.2、2、20 μmol/L 不同浓度蟛蜞菊内酯对终浓度为10 μg/mL LPS诱导RAW264.7细胞产生TNF-α、NO及前列腺素E₂(PGE₂)的影响,Western blot方法检测蟛蜞菊内酯对LPS诱导COX-2 酶蛋白表达的影响。结果: LPS能够明显诱导小鼠RAW264.7细胞产生的COX-2酶蛋白,蟛蜞菊内酯低中高3个浓度均能抑制LPS诱导产生的COX-2酶蛋白表达。PGE₂可以被 LPS诱导增加,与空白组比有显著差异。蟛蜞菊内酯低中高3个浓度均能抑制LPS诱导产生的PGE₂、NO和TNF-α,呈现剂量依赖性。结论: 蟛蜞菊内酯抗炎的作用机制可能为抑制COX-2的蛋白表达,进而抑制PGE₂的生成,也可能与抑制NO和TNF-α生成有关。     

紫杉醇耐药卵巢癌细胞亚株的蛋白组学研究

目的: 建立卵巢癌细胞株与紫杉醇耐药卵巢癌细胞亚株的差异蛋白表达图谱,寻找对紫杉醇药物耐受的相关蛋白。方法: 以人卵巢浆液性囊腺癌细胞株(SKOV3)和对紫杉醇稳定耐药卵巢浆液性囊腺癌细胞亚株(SKOV3-TR30)为研究对象,应用双向电泳技术建立SKOV3与SKOV3-TR30的蛋白质差异表达图谱,并对图谱进行质谱分析。然后应用蛋白免疫印迹和免疫细胞化学方法对其中3个有差异的蛋白进行定量和定位检测。结果: (1)经过组内与组间3次重复,发现每次实验均有相似变化的差异点23个。其中与SKOV3细胞株相比,在SKOV3-TR30细胞株表达上调大于3倍的蛋白质点有16个(P<0.05),表达下调大于3倍的蛋白质点有7个(P<0.05)。(2)通过质谱分析和数据库搜索,其中7个蛋白点得到初步鉴定,分别为可溶性抗药性相关钙结合蛋白(Sorcin)、组织蛋白酶B前体(Cathepsin B)、调宁蛋白3、热休克蛋白27(HSP27)、波形纤维蛋白、尼克酰胺乙酰乙酸水解酶和血红蛋白β链。(3)蛋白免疫印迹结果显示,Sorcin、Cathepsin B及HSP27在SKOV3-TR30细胞中的表达显著高于SKOV3细胞株(P<0.05)。免疫细胞化学的结果表明,SKOV3及SKOV3-TR30均可检测到Sorcin、Cathepsin B及HSP27阳性表达的细胞,并且3个蛋白均分布在细胞浆内,以核周最为明显。结论: 低浓度紫杉醇诱导的上皮性卵巢癌耐药细胞亚株中存在细胞骨架相关信号转导分子表达上调,上调的细胞骨架相关信号转导分子在卵巢癌临床预示耐药与逆转耐药治疗中的作用值得进一步研究。     

黄连素对HepG2细胞CYP3A4和P-gp的影响和作用机制研究

目的: 阐明黄连素即盐酸小檗碱(berberine hydrochloride,BBR)对人肝癌细胞HepG2中细胞色素P450 3A4(CYP3A4)、多药耐药基因(MDR1)在mRNA和蛋白水平表达的影响,初步探讨黄连素对CYP3A4和P-糖蛋白(P-gp)的影响及其作用机制。方法: 采用MTT法检测不同浓度的BBR(1~100 μg/mL)对HepG2细胞活力的影响;并在BBR对HepG2细胞毒性较小的浓度范围进行实验,实验分为空白对照组、不同浓度BBR组、诱导剂利福平(Rif)组以及不同浓度BBR和Rif共同给药组,与对数期HepG2细胞孵育48 h后,提取细胞RNA和总蛋白,分别采用荧光定量PCR法(QRT-PCR)、Western blot法检测HepG2细胞中CYP3A4、MDR1、孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)、视黄醛X受体(retinoid X receptor,RXR)在mRNA水平的表达和CYP3A4、P-gp在蛋白水平的表达。结果: BBR在1~40 μg/mL 浓度范围内对HepG2细胞毒性小,细胞活力大于80%,超过 40 μg/mL 时对细胞毒性大,细胞存活率低。Western blot结果表明,与空白对照组比较, 0.1、0.5 和 2 μg/mL BBR对HepG2细胞CYP3A4和P-gp蛋白的表达有诱导作用(P<0.05),但10、40 μg/mL BBR对HepG2细胞CYP3A4和P-gp蛋白的表达有显著性抑制作用(P<0.01)。QRT-PCR结果表明,与空白对照组比较,10、20和 40 μg/mL BBR均对HepG2细胞PXR、CYP3A4、MDR1 mRNA的表达有显著抑制作用(P<0.05);但 10 μg/mL BBR对RXR mRNA无显著性影响(P>0.05),20、40 μg/mL BBR对RXR mRNA有显著的抑制作用(P<0.05)。结论: 黄连素对CYP3A4和P-gp有双向作用,低剂量时诱导,高剂量时抑制,并且其作用很有可能通过PXR信号通路实现。     

氯美昔布诱导肺癌细胞凋亡的作用机制

目的: 探讨氯美昔布诱导肺癌细胞凋亡的可能作用机制。方法: 人肺癌细胞株A549和NCI-H460 细胞先加入终浓度IL-1β₁ 1μg/L刺激 24 h,再加入不同浓度氯美昔布继续培养 24 h,采用Western blot 法检测ERK2、p-ERK及Bcl-2表达水平。氯美昔布体外处理A549、NCI-H460后,采用Western blot法检测Bcl-2、Bax表达水平。结果: 氯美昔布作用后肺癌细胞中ERK2及p-ERK的磷酸化水平均下降,并伴有Bcl-2水平的下降,差异有统计学意义(P<0.01)。并且随着氯美昔布浓度的增大, Bcl-2蛋白表达量逐渐下降,而Bax蛋白表达在A549细胞中增强,在NCI-H460细胞中不变,Bcl-2/Bax的比值下降。结论: 氯美昔布诱导肺癌细胞凋亡的机制可能与通过ERK信号转导途径调节肺癌细胞产生Bcl-2,进而诱导Bcl-2/Bax的比值下降有关。     

自噬在米诺环素保护PC12细胞氧糖剥夺-复糖复氧中的作用

目的: 探讨自噬在米诺环素保护PC12细胞氧糖剥夺-复糖复氧中的作用。方法: 构建PC12细胞氧糖剥夺-复糖复氧模型,采用米诺环素(MC,1、10、100 μmol/L)或3-甲基腺嘌呤(3-MA,5 mmol/L)进行干预,MTT检测细胞活力,单丹磺酰戊二胺(MDC)染色观察自噬泡,Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白轻链3(LC3Ⅱ)、泛素结合蛋白P62/SQSTM l的表达。结果: 氧糖剥夺处理后,1 μmol/L 和 10 μmol/L的MC能显著提高PC12细胞的存活率,而 100 μmol/L 则会加重细胞的损伤。蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表达与MC的浓度呈正相关性,自噬抑制剂3-MA能够降低LC3Ⅱ和Beclin1,增加P62/SQSTM l的表达逆转MC的保护作用。结论: 低剂量(1、10 μmol/L)MC能够通过增加LC3Ⅱ和Beclin1的表达,诱导PC12细胞产生自噬从而保护氧糖剥夺-复糖复氧处理后的PC12细胞。     

熊果酸抑制HepG2中C-反应蛋白的异常表达及其对HUVECs的损伤

目的: 研究不同剂量的熊果酸(UA)对IL-6诱导的HepG2细胞中C-反应蛋白(CRP)异常表达的抑制作用以及对CRP所致人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)损伤的保护作用。方法: IL-6(30 ng/mL)、UA(6.5、12.5、25 μmol/L)与IL-6(30 ng/mL)共同作用于HepG2细胞48 h,分别用MTT法、Western blot法及RT-PCR法检测各组细胞活力、CRP蛋白及mRNA表达情况。CRP(25 μg/mL)、UA(5,10,20 μmol/L)与CRP(25 μg/mL)共同作用于HUVECs 24 h,分别用MTT法、Western blot法及RT-PCR法检测各组细胞增殖、VCAM-1和LOX-1的蛋白及mRNA表达。结果: UA能显著抑制IL-6诱导的HUVECs细胞活力下降及细胞中CRP蛋白与mRNA的表达升高;UA显著抑制CRP引起的内皮细胞增殖,并且在mRNA及蛋白水平均能显著抑制CRP诱导的HUVECs异常高表达VCAM-1及LOX-1。结论: UA可通过抑制肝脏合成炎症因子CRP而降低血液中CRP浓度,并降低CRP等炎症因子对内皮细胞的损伤等途径从而发挥抗心肌缺血及动脉粥样硬化等心血管疾病的作用。     

Oct-4基因在胃癌顺铂耐药中的作用

目的: 建立胃癌BGC-823顺铂耐药细胞株,研究Oct-4基因在胃癌顺铂耐药中的作用。方法: 使用顺铂逐步增加剂量法诱导胃癌BGC-823细胞,以建立其多药耐药细胞株BGC-823/DDP;MTT细胞毒实验检测顺铂对肿瘤细胞的细胞毒作用;半定量RT-PCR检测Oct-4基因的表达;基因转染干扰Oct-4表达;Western blot实验检测Oct-4蛋白的表达改变。结果: 经过30~34周的诱导我们建立了胃癌BGC-823顺铂耐药细胞株;MTT细胞毒实验结果显示顺铂对BGC-823和BGC-823/DDP细胞的IC₅₀值分别为(2.33±0.12) 和(21.46±0.97) μmol/L(P<0.01),与BGC-823细胞比较,BGC-823/DDP细胞对顺铂耐药是其9.21倍;半定量RT-PCR检测显示胃癌耐药株BGC-823/DDP高表达Oct-4基因;Western blot结果显示化学合成的siRNA可以靶向下调Oct-4蛋白的表达;siRNA干扰BGC-823/DDP细胞Oct-4基因的表达后,BGC-823/DDP细胞对顺铂的的IC₅₀值从(22.04±1.84 ) μmol/L 减小到(6.15±0.53) μmol/L,二者差异具有统计学意义(P<0.01)。结论: 研究结果表明,Oct-4基因的高表达在胃癌顺铂的耐药中起着重要的作用。     

不同剂量前列腺素E2对H9c2心肌细胞肥大的影响

目的: 研究前列腺素E2(PGE2)对H9c2心肌细胞的肥大作用,并分析其量效关系,为寻找抗心肌肥大的潜在靶点提供理论依据。方法: 将H9c2心肌细胞分为空白对照组(C组)和PGE2处理组,PGE2处理组又分为小剂量PGE2组(D1组)、中剂量PGE2组(D2组)和大剂量PGE2组(D3组)。各组细胞培养液中PGE2终浓度分别为0、0.1、1及 10 μmol/L。给药孵育 48 h 后,利用荧光显微镜观察大鼠H9c2心肌细胞形态及体积;通过测量细胞直径大小、BCA法测定细胞总蛋白含量来确定心肌细胞是否肥大;RT-PCR技术测量心钠肽(Atrial natriuretic peptide, ANP)、脑钠肽(Brain natriuretic peptide, BNP) mRNA的表达水平,以此判断是否发生病理性肥大。结果: 与C组比较,免疫荧光显示D1组、D2组及D3组细胞形态改变、体积增大;细胞直径及总蛋白含量显著增加(P<0.05),不同剂量PGE2组间亦具有统计学差异(P<0.05);D2组及D3组较C组细胞内ANP、BNP mRNA表达水平显著增高(P<0.05)。结论: PGE2可剂量依赖地诱导H9c2心肌细胞肥大,较大剂量PGE2引发心肌细胞病理性肥大。抑制PGE2合成有望为抑制心肌肥大提供靶点。     

Hydralazine逆转胃癌细胞株p16基因甲基化及增强其表达的研究

目的: 通过使用甲基转移酶抑制剂肼屈嗪(Hydralazine)作用于胃癌细胞株BGC-823,观察Hydralazine对MTS1/p16基因启动子区CpG岛甲基化、p16 mRNA、p16蛋白表达及细胞增殖的影响;分析p16基因启动子区CpG岛甲基化与p16基因表达两者间的关系,以此考察胃癌细胞株BGC-823 p16基因的失活机制是否与启动子区CpG岛甲基化有关。方法: 对体外培养的胃癌细胞株BGC-823进行分组实验,实验组加入水溶性的Hydralazine,浓度0、10、30、100 μmol/L,对照组不加Hydralazine,96 h 后对两组分别行甲基化特异性PCR法(MSP)、RT-PCR及Western blot检测,以观察p16基因甲基化状态、mRNA、蛋白表达的变化;应用6种不同浓度的水溶性Hydralazine(0、3、10、30、100、300 μmol/L)处理胃癌细胞BGC-823,72 h 后行MTT检测,以观察对细胞增殖的影响。结果: P16基因在胃癌细胞株BGC-823中,启动子区CpG岛呈高甲基化状态,mRNA及蛋白呈低水平表达。Hydralazine阻断甲基转移酶作用后,p16基因启动子区CpG岛呈去甲基化状态,Hydralazine浓度越高,CpG岛去甲基化越明显。Hydralazine阻断甲基转移酶作用后,用药后p16 mRNA表达较前明显增强(P<0.05)。Hydralazine阻断甲基转移酶作用后,用药后p16蛋白表达较前明显增强(P<0.01)。MTT检测到不同浓度的Hydralazine(0、3、10、30、100、300 μmol/L)对细胞增殖的抑制率差异有统计学意义(P<0.05),其量效关系反映出抑癌基因p16去甲基化程度越高,对胃癌细胞株BGC-823的增殖抑制越显著。结论: P16基因动子区CpG岛甲基化是p16基因失活的重要机制。     

抗氧化剂ebselen 对SHRsp 冠状动脉eNOS 蛋白表达的影响

目的:研究新型抗氧化剂含硒谷胱甘肽过氧化物酶模拟物PZ51 对卒中易感型自发性高血压大鼠(SHRsp) 高血压发展的慢性过程中冠状动脉内皮型一氧化氮合成酶(eNOS) 表达的影响。方法:22 只8 周龄SHRsp 随机分为PZ51 组和对照组, 灌胃治疗6 周。测量心脏重量比值、心脏结构;采用分光光度计测心肌组织匀浆一氧化氮(NO) 的浓度;免疫组化检测冠状动脉eNOS 蛋白表达。结果:PZ51 组较对照组心肌组织匀浆NO 浓度显著升高(1.18±0.25vs 0.72±0.18 μmol°mg^-1 prot, P<0.05)、冠状动脉内皮eNOS 蛋白表达显著增加(7.45±2.10 vs 2.77±2.07, P<0.05) 。结论:PZ51 治疗6 周显著增加了SHRsp 冠状动脉eNOS 蛋白表达及心肌组织NO的水平。