BCG-CpG-DNA重复给药对小鼠免疫毒性的初步评价

目的观察BCG-CpG-DNA重复给药对小鼠免疫器官和免疫功能的影响,评价BCG-CpG-DNA的免疫毒性。方法将BALB/c小鼠随机分为4组,对照组注射生理盐水,实验组分别注射低(100μg)、中(250μg)、高(500μg)剂量的BCG-CpG-DNA,于28d内分别经背部皮下免疫7次,分别于初次免疫后14d、末次免疫后3d和3周,检测各组小鼠免疫器官脏器系数、淋巴细胞转化功能、细胞因子释放(ELISPOT法)、T细胞亚群变化(免疫荧光法)和NK细胞杀伤活性(乳酸脱氢酶法)。结果 BCG-CpG-DNA重复给药7次,主要影响小鼠初级免疫器官,表现为脾肿大,对胸腺、肝脏和肾脏无影响;对细胞免疫功能的影响是增强淋巴细胞转化功能;降低中、高剂量组CD3+T细胞亚群含量;提高体内分泌IFNγ和IL-4的细胞数二者的比例;增强NK细胞的杀伤能力。结论 BCG-CpG-DNA重复给药累计达3.5mg,小鼠表现为免疫功能增强,对免疫器官和免疫功能无不良影响,未见免疫毒性副作用。     

BCG-CpG-DNA对重组HBsAg的免疫佐剂作用

目的研究BCG-CpG-DNA对重组HBsAg的免疫佐剂作用。方法以BCG-CpG-DNA与重组HBsAg混合免疫小鼠,以铝佐剂疫苗为对照,采用放射免疫法检测抗-HBs中和抗体水平,ELISA法分析抗体亚类,酶联免疫斑点试验(ELIS-POT)检测CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)功能。结果BCG-CpG-DNA能提高抗-HBs中和抗体水平,促进抗原特异性IgG2a的产生,诱导Th1型免疫应答,与铝佐剂协同作用能部分逆转Th2反应。同时能增强抗原特异性CD8+T淋巴细胞的杀伤作用,实验组与对照组比较差异有显著意义。结论BCG-CpG-DNA对HBsAg有较好的免疫佐剂作用,有可能成为一种新型的免疫佐剂。     

灵芝精粉与灵芝孢子粉对Lewis肺癌模型小鼠免疫功能的影响

目的研究灵芝精粉与灵芝孢子粉对Lewis肺癌模型小鼠免疫功能的影响,并比较二者在肿瘤治疗中的免疫调节作用。方法经C57BL/6小鼠右腋皮下接种1×106个Lewis肺癌细胞,建立小鼠Lewis肺癌模型。于接种肿瘤细胞次日至第20天,分别隔日灌胃灵芝孢子粉(D1)、灵芝精粉001(D2)及灵芝精粉002(D3),剂量均为0.5g/kg,同时设立对照组和肿瘤组(灌胃等体积生理盐水)。监测各组小鼠体重及瘤体积,第21日处死小鼠,称量瘤重,并无菌制备脾细胞悬液,检测小鼠NK细胞杀伤活性,流式细胞术检测小鼠脾细胞中CD4+、CD8+T细胞和B细胞数量,淋巴细胞转化试验检测脾细胞中T、B细胞增殖功能。结果与对照组比较,肿瘤组小鼠脾细胞中T、B细胞增殖功能、细胞数量及NK细胞杀伤活性均有不同程度的下降。与肿瘤组相比,3种灵芝制剂均可提高Lewis肺癌模型小鼠NK细胞的杀伤活性和T、B细胞增殖功能,其中,以D2作用最为明显(P<0.05);3种灵芝制剂均可不同程度地提高Lewis肺癌模型小鼠CD4+、CD8+T细胞数量,其中,以D3作用最为显著(P<0.05)。3种灵芝制剂对Lewis肺癌模型小鼠的体重、瘤重、瘤体积及B细胞数量均无明显影响。结论灵芝制剂对Lewis肺癌小鼠的免疫功能具有正向调节作用,其中灵芝精粉的作用优于灵芝孢子粉。     

缓释胸腺肽口服片剂的制备及免疫调节作用

目的制备缓释胸腺肽口服片剂,并探讨其生物学活性及对小鼠免疫功能的影响。方法采用常规方法制备缓释胸腺肽片剂。以E-玫瑰花环试验及淋巴细胞转化试验,评价其生物学活性;免疫小鼠,以乳酸脱氢酶释放法检测小鼠NK细胞活性;巨噬细胞吞噬功能试验检测小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率;流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群。结果所制备的缓释胸腺肽口服片剂,各项质量检测指标均达到《中国药典》三部(2005版)要求,其释药过程无突释和释药峰。缓释片剂组的E-玫瑰花结形成率及淋巴细胞转化率明显高于空白基质片组,且差异有显著意义;NK细胞活性、巨噬细胞吞噬率及CD3~+、CD4~+、CD4~+/CD8~+比值与空白基质片组相比,差异均有显著意义。结论缓释胸腺肽口服片剂具有良好的生物学活性,并对小鼠免疫调节功能有明显的增强作用。     

1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗诱导CD8~+T细胞对病理性CD4~+T细胞的抑制作用

目的观察1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗诱导CD8+T细胞对病理性CD4+T细胞的抑制作用。方法用1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗免疫非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠,并同时设立噬菌体空载体免疫组和未免疫空白对照组。于初次免疫后第20周,检测各组小鼠血糖;磁珠法分离免疫小鼠CD8+T细胞,并用合成反义肽及IL-2诱导刺激作为效应细胞;分离噬菌体空载体免疫组和空白对照组小鼠CD4+T细胞,用合成正义肽及IL-2诱导刺激作为靶细胞。将效应细胞与靶细胞按不同比例混合,以乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL的杀伤活性。结果初次免疫后第20周,1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗免疫组小鼠血糖水平保持正常,而另外2组小鼠血糖均高于正常水平。1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗免疫组诱导的CD8+T细胞作效应细胞,当效靶比为100∶1时,对噬菌体空载体免疫组CD4+T细胞的杀伤效率最高,达47.95%±11.30%,而噬菌体空载体免疫组诱导的小鼠CD8+T细胞对空白对照组的CD4+T细胞无杀伤作用。结论1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗能够诱导CD8+T细胞抑制病理性CD4+T细胞。     

皮下植入医用几丁糖对大鼠免疫系统的影响

目的探讨经大鼠腹部皮下植入医用几丁糖对其免疫系统的影响。方法将96只Wistar大鼠随机分为医用几丁糖高剂量组(5 ml)、低剂量组(1 ml)、假手术组(5 ml无菌生理盐水)、空白对照组(未处理)、免疫抑制组(取材前连续4 d经大鼠腹腔注射环磷酰胺)和免疫刺激组(取材前12 h单次腹腔注射脂多糖),根据考察周期将每组16只大鼠再随机分为1、4、8和12周4个实验操作小组。对大鼠以下指标进行检测:免疫器官系数、免疫器官组织病理学观察、NK细胞杀伤活性、T淋巴细胞亚群分析和T/B淋巴细胞增殖情况。结果医用几丁糖植入后1、4、8和12周,医用几丁糖高剂量组及低剂量组大鼠的免疫器官系数、NK细胞杀伤活性、T淋巴细胞亚群分析、T/B淋巴细胞增殖的结果与假手术组和空白对照组比较,差异均无统计学意义(P0.05),免疫器官组织病理学观察未见异常;免疫抑制组大鼠的免疫器官系数、NK细胞杀伤活性、T淋巴细胞亚群分析、T/B淋巴细胞增殖的结果与其他各组比较,差异均有统计学意义(P0.05),免疫器官组织病理学观察可见淋巴细胞数目大量减少等免疫抑制现象;免疫刺激组大鼠的脾脏系数、T淋巴细胞亚群分析、T淋巴细胞增殖的结果与其他各组比较,差异均有统计学意义(P0.05),免疫器官组织病理学观察可见淋巴细胞数目大量增多等免疫刺激现象。结论经大鼠腹部皮下植入医用几丁糖后,未对其免疫系统产生明显影响。     

CpG ODN对rHBsAg免疫小鼠NK细胞表面分子表达及其活性的影响

目的探讨合成的含CpG基序的寡核苷酸(CpG ODN)与重组乙型肝炎病毒表面抗原(rHBsAg)联合免疫小鼠对NK细胞表面标志NK1.1表达情况及其细胞毒活性的影响。方法采用C57BL/6小鼠,经后腿胫骨前肌免疫2次,FACS检测脾细胞NK1.1表面分子的表达,生物活性法测定脾脏NK细胞的细胞毒活性。结果各实验组间NK细胞表面标志NK1.1的表达差异无显著意义;加CpG ODN各组与相应未加CpG ODN组比较对靶细胞的杀伤活性显著增强,且各组与对照组比较杀伤活性差异均具有显著意义。结论CpG ODN对免疫小鼠NK细胞表面分子NK1.1的表达无明显影响,而对其细胞毒活性具有明显的增强作用,显示CpG ODN具有潜在的免疫佐剂效应。     

肠道病毒71型感染患儿外周血自然杀伤细胞比例、亚群、表面受体及免疫效应分子的变化

目的探讨肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)感染患儿外周血中自然杀伤(Natural killer,NK)细胞比例、亚群、表面受体及免疫效应分子的变化。方法将EV71阳性的急性期患儿按疾病严重程度分为重症病例组和普通病例组,同时设健康对照组。提取各组患儿外周血,采用流式细胞术检测外周血中NK细胞比例、NK细胞亚群、自然细胞毒受体NKp30和NKp46、激活性受体NKG2D、抑制性受体CD94和NKG2A、脱颗粒标记CD107a及免疫效应分子(PF、GrB和GNLY)阳性细胞所占NK细胞的比例。结果重症病例组患儿外周血NK细胞比例较健康对照组明显减少(P<0.01),普通病例组CD16+NK细胞亚群比例较健康对照组升高(P<0.05),重症病例组较普通病例组低,但差异无统计学意义(P>0.05);重症病例组和普通病例组NKG2D阳性细胞百分率均较健康对照组低(P<0.01),而CD94和NKG2A阳性细胞百分率均较健康对照组明显升高(P<0.01),NKp30和NKp46阳性细胞率3组之间差异无统计学意义(P>0.05);重症病例组和普通病例组CD107a、PF、GrB、GNLY的阳性细胞百分率均较健康对照组明显降低(P<0.01或P<0.05)。结论 EV71感染可能抑制宿主NK细胞的增殖、激活及其杀伤功能。重症病例组与普通病例组比较,NK细胞比例和CD16+NK细胞亚群降低,抑制性受体CD94表达增高,胞浆内CD107a、GrB和PF表达显著降低,可能与重症病例的发生有关。     

结核菌H37Ra在小鼠体内诱导的免疫应答

目的检测结核菌H37Ra免疫小鼠后产生的特异性细胞免疫和体液免疫应答水平。方法将BALB/c小鼠随机分为H37Ra组、BCG组和生理盐水(NS)组,分别进行免疫,免疫8周后处死小鼠,分离血清,ELISA间接法测定血清特异性抗PPDIgG抗体的水平,流式细胞分析仪检测脾脏T淋巴细胞亚群的变化。脾淋巴细胞经体外培养、PPD刺激后,MTT法检测脾淋巴细胞的刺激指数,ELISA法检测培养上清液中IFN-γ和IL-4的水平。结果H37Ra免疫小鼠血清中抗PPDIgG抗体、脾脏CD3+T细胞和CD4+T细胞的百分率、脾淋巴细胞刺激指数、IFN-γ和IL-4水平均显著高于NS对照组,但与BCG组差异无显著意义。各组间脾脏CD8+T细胞、CD4+T/CD8+T比值差异均无显著意义。结论H37Ra免疫小鼠后,可以产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答,有望成为结核疫苗的候选抗原。     

注射用母牛分枝杆菌对结核菌感染小鼠细胞免疫功能的影响

目的观察注射用母牛分枝杆菌(微卡)对结核菌感染小鼠细胞免疫功能的影响,并探讨其作用机制。方法C57小鼠经尾静脉注射结核分枝杆菌H37RV,建立结核菌感染小鼠模型。将模型小鼠随机分为模型组、微卡高、中、低3个剂量组和异烟肼组,同时设正常对照组。感染8周后处死小鼠,取肺、脾、肝,计算重量指数和病变总指数,测定肺脏活菌数量,并观察主要脏器的病理变化;流式细胞术测定小鼠脾脏中CD3+T、CD4+T、NK1.1+T、NK、γδT细胞的比例以及CD4+T细胞胞内IFNγ和IL-4的表达。结果微卡各剂量组能明显减轻感染小鼠的发病状况,其中微卡中剂量组的各脏器病变总指数、脾脏和肺脏重量指数、肺脏结核菌活菌数均显著低于模型组;微卡各剂量组小鼠的肺部病变主要以增殖性结节为主,而模型组则以坏死性结节和增殖性结节为主;微卡各剂量组小鼠的CD3+T、CD4+T细胞比例均明显升高,CD4+IFNγ+辅助性T细胞比例与模型组比较,差异无统计学意义;微卡低、中剂量组CD4+IL-4+辅助性T细胞比例明显降低,同时能显著提高小鼠天然免疫系统γδT和NK细胞的比例。结论微卡可提高结核菌感染小鼠天然和获得性细胞免疫水平,对结核菌感染小鼠具有较好的免疫干预作用。     

梅花鹿鹿茸活性多肽的提取及免疫功效的初步研究

目的提取并分离纯化不同加工方法处理的梅花鹿鹿茸活性多肽(PAP),并对其免疫功效进行初步研究。方法以不同工艺处理的鹿茸为原料,应用分子排阻层析和离子交换层析提取鹿茸活性多肽,通过淋巴细胞增殖、细胞因子产生等试验,检测PAP对淋巴细胞的免疫功效。结果所提取的梅花鹿鹿茸活性多肽蛋白含量分别为:冻干茸9.20 mg/ml;冷冻鲜茸1.30 mg/ml;热炸茸1.10 mg/ml。鹿茸多肽可以促进小鼠T、B淋巴细胞的增殖,活化巨噬细胞分泌IL-12,对机体有免疫增强作用。结论梅花鹿鹿茸活性多肽对机体的细胞免疫有显著增强作用。     

抗体阻断表面黏附分子DNAM-1和LFA-1对人自然杀伤细胞肿瘤杀伤活性的抑制作用

目的探讨抗体阻断表面黏附分子DNAM-1和LFA-1对体外扩增的人自然杀伤(Natural killer,NK)细胞的肿瘤杀伤活性的影响。方法体外活化人外周血单个核细胞来源的NK细胞,并检测其表面黏附分子DNAM-1和LFA-1的表达水平;通过Trans-well阻隔试验,阻断NK细胞与靶细胞接触,考察细胞-细胞直接接触对NK细胞杀伤活性的影响;通过NK细胞毒性试验,引入抗DNAM-1单克隆抗体和抗LFA-1单克隆抗体,阻断相应信号途径,考察相关黏附分子在NK细胞肿瘤杀伤过程中的作用。结果体外活化的NK细胞高表达表面黏附分子DNAM-1和LFA-1。阻断NK细胞与靶细胞接触,NK细胞的肿瘤杀伤效应大大降低。应用单克隆抗体阻断DNAM-1或LFA-1信号途径,可显著降低NK细胞肿瘤的杀伤效应;联合阻断DNAM-1和LFA-1信号途径,可进一步降低NK的细胞杀伤效应。结论细胞-细胞间直接接触是NK细胞发挥肿瘤杀伤效应的重要机制,表面黏附分子DNAM-1和LFA-1介导的信号途径对维持NK细胞肿瘤杀伤活性具有重要意义。     

Costimulatory CD226 Signaling Regulates Proliferation of Memory-like NK Cells in Healthy Individuals with Latent Mycobacterium tuberculosis Infection

It is now widely accepted that NK cells can acquire memory, and this makes them more effective to protect against some pathogens. Prior reports indicate memory-like NK cells (mlNKs) in murine model of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) as well as in healthy individuals with latent TB infection (LTBI). The increased expression of CD226 was evident in mlNKs from LTBI+ people after stimulation with γ-irradiated Mtb (γ-Mtb). We thus evaluated the contribution of costimulatory CD226 signaling in the functionality of mlNKs in LTBI+ people. We found that blockade of CD226 signaling using the antibody- or CRISPR/Cas9-mediated deletion of the CD226 gene in NK cells diminished the proliferation of mlNKs from LTBI+ people. Blocking CD226 signaling also reduced the phosphorylation of FOXO1 and cMyc expression. Additionally, cMyc inhibition using a chemical inhibitor reduced proliferation by mlNKs from LTBI+ people. Moreover, blocking CD226 signaling reduced glycolysis in NK cells, and the inhibition of glycolysis led to reduced effector function of mlNKs from LTBI+ people. Overall, our results provide a role for CD226 signaling in mlNK responses to Mtb.     

复合疫苗佐剂促进蛋白抗原通过交叉提呈和交叉致敏诱生CD8~+CTL反应的研究

目的研究CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-oligodeoxynucleotides,CpG-ODN)与A(lOH)3或Montanide ISA720等组成的复合佐剂在小鼠体内促进蛋白抗原通过交叉提呈和交叉致敏诱生CD8+CTL反应的能力。方法以鸡卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)为抗原,分别以CpG X1、A(l OH)(3即Alum)、Montanide ISA720、CpG X1+Alum和CpG X1+Montanide ISA720为疫苗佐剂,分别于0和4周经肌肉注射免疫C57BL/6小鼠,体积均为100μl,分别含20μg OVA、20μg CpG X1、74μl Montanide ISA720和/或100μg Alum。通过胞内细胞因子染色和体内CTL杀伤试验评价不同佐剂对细胞免疫应答的影响,通过表达OVA的黑色素瘤和李斯特菌攻击模型评价不同佐剂在免疫预防和免疫治疗中的作用。结果与OVA组相比,A(lOH)3本身不能有效诱生小鼠的细胞免疫应答;CpG X1或Montanide ISA720单独使用能够在一定程度上增强抗原特异性CD8+T细胞的IFNγ分泌和CTL活性,但不增强抗原特异性CD4+T细胞反应。两种复合佐剂具有比单佐剂更强的细胞免疫佐剂效应,其中CpG X1+MontanideISA720只能增强抗原特异性CD4+和CD8+T细胞的IFNγ分泌,而CpG X1+Alum不仅能够增强抗原特异性CD4+和CD8+T细胞的IFNγ分泌,还能够增强CD8+CTL的杀伤活性。在黑色素瘤和李斯特菌攻击模型中,CpG X1+Alum佐剂显示出良好的预防和治疗效果。结论 CpG X1与A(lOH)3组成的复合佐剂能够有效促进蛋白抗原通过交叉提呈和交叉致敏诱生功能性CD8+CTL反应。     

Study on the Immunomodulation Effect of Isodon japonicus Extract via Splenocyte Function and NK Anti-Tumor Activity

Here we investigated the potential immune-enhancing activity of Isodon japonicus on murine splenocyte and natural-killer (NK) cells in vitro. The ethanol extract of I. japonicus significantly enhanced the proliferation of splenocyte and induced the significant enhancement of NK cells' activity against tumor cells (YAC-1). In addition, I. japonicus increased the production of interferon (IFN)-γ and tumor necrosis factor (TNF)-α, suggesting that the increase in NK cell cytotoxicity could be due to the enhancement of the NK cell production of both cytokines. Taken together, I. japonicus extract inhibited the growth of human leukemia cells (K562) by 74%. Our observation indicated that the anti-tumor effects of I. japonicus may be attributed to its ability to serve as a stimulant of NK anti-tumor activity. In addition, our results support the development of functional food studies on I. japonicus.