Rhizopus oryzae产酸性蛋白酶条件及其酶学性质研究

本文以少孢根霉(Rhizopus oligosporus)为对照研究了豆豉中的一个分离菌株米根霉(Rhizopus oryzae)产生酸性蛋白酶的条件及所产蛋白酶的性质,结果表明这个菌株的产酶条件和蛋白酶的性质与少孢根霉相比有相似性但也存在一些差异:米根霉在水分含量57%~59%、pH2.5~3.0的酸性介质中、28~31℃下培养36h时产酸性蛋白酶能力最强,所分泌的蛋白酶系在pH4.0和pH6.0附近有最强的催化活性,在pH3.0~6.0的范围内有较好的稳定性,催化反应的最适作用温度为50℃,它的温度稳定性很差,在50℃保温30min已完全失活;少孢根霉在水分含量52%~55%、pH2.5~3.0的酸性介质中、31℃下培养48h时产酸性蛋白酶能力最强,在35℃条件下培养36h也能产生较高的酶活力,少孢根霉分泌的蛋白酶系在pH3.0和pH6.0附近有最强的催化活性,在pH4.0～6.0范围内很稳定,催化反应的最适作用温度可达55～60℃,但它的温度稳定性较差,在50℃保温30min,酶活力损失达到90%,保温120min酶几乎完全失活。     

酸性条件下毛霉和根霉蛋白酶的催化特性

研究比较了Actinomucor elegans蛋白酶和Rhizopus oligosporus蛋白酶在pH 3.0～6.0的条件下催化大豆分离蛋白(SPI)降解的特性,结果表明:在pH3.0和pH3.5的条件下,SDS-PAGE显示毛霉和根霉蛋白酶都能迅速地催化大豆7S和11S蛋白的降解,但此时水溶性蛋白的得率不高,均在35%以下;在pH5.0、5.5和6.0时,毛霉和根霉蛋白酶催化大豆分离蛋白降解的能力增强,水解度升高,水溶性蛋白的得率增加,但毛霉蛋白酶的水解产物水溶性蛋白得率始终高出约10%,SDS-PAGE显示毛霉蛋白酶催化下的大豆分离蛋白各个亚基降解消失的速度下降,同时伴随有新的条带产生,特别是碱性亚基几乎不能在4h内降解,根霉蛋白酶催化下的大豆分离蛋白各个亚基降解消失的速度在pH5.0和5.5时还比较强,但在pH6.0时明显下降,酸性亚基和碱性亚基均不能在4h内消失,表明在酸性条件下2个霉菌的蛋白酶其催化特性有明显的差异。     

雅致放射毛霉AS3.2778酸性蛋白酶的纯化及性质研究

毛霉蛋白酶对大豆蛋白有较高的水解效率以及对蛋白水解物具有良好的脱苦效果,因此在大豆多肽的制备方面显示出很好的应用前景。为了开发这一蛋白酶系,采用硫酸铵盐析、羧甲基琼脂糖凝胶阳离子交换层析及苯基琼脂糖凝胶疏水层析对其进行分离纯化,从雅致放射毛霉AS3.2778的发酵麸曲中纯化得到两个酸性蛋白酶组分Pa1和Pa2。电泳分析并结合凝胶色谱确定纯化的两个组分均是单体酶,其分子质量分别在35ku和33ku。对其性质研究发现:Pa1在pH5.5、50℃有最大催化活性,Pa2在pH4.5、50℃有最大催化活性;两者在温度低于40℃,酸性的环境(pH4.0～7.0)中有很好的稳定性;浓度10μmol/L的Pepstatin A可以完全抑制这两种蛋白酶的活性,表明Pa1和Pa2属于天冬氨酸蛋白酶家族;金属离子对两者的活性影响不显著,其中仅Cu2+、Zn2+对Pa1有弱的抑制作用,而Mn2+、Co2+、Cu2+对Pa2有弱的抑制作用;Pa1和Pa2具有相同的肽键选择性,并且与雅致放射毛霉碱性蛋白酶Pb1存在一定的肽键选择互补性;Pa2的N端氨基酸序列为:GTGTVPVTDY,这与来源于根霉属微生物的酸性蛋白酶有很高的同源性。     

雅致放射毛霉羧肽酶Y的基因克隆、表达与酶学性质研究

本研究从雅致放射毛霉中克隆、表达和纯化羧肽酶Y(CPY),体外激活后检测其酶学性质。本文筛选并鉴定了一株腐乳发酵菌株,命名为雅致放射毛霉PEP001(Actinomucor elegans PEP001)。以相近种族来源的真菌羧肽酶Y保守序列设计简并引物调取部分目的基因序列,利用末端扩增技术(RACE)分别获得3’与5’端基因全长,克隆获得羧肽酶Y基因,全长为1557 bp,编码518 aa。将其酶原(pro CPY)在大肠杆菌Rosetta中重组表达,产物为包涵体;在毕赤酵母GS115中成功分泌表达pro CPY,产量为151.20±10.20mg/L。通过体外激活与纯化,获得电泳纯的成熟羧肽酶Y。成熟羧肽酶Y最适pH为6.0,最适温度为45℃,在40℃下有较高稳定性,在60℃下很快失活,在pH 4.0~7.0下都有较高的稳定性。本文中雅致放射毛霉PEP001羧肽酶Y为首次报道,为进一步研究其应用打下一定基础。     

两种生产用米曲霉的形状及蛋白酶性质研究

研究对比了两株米曲霉的形态特征以及成曲的蛋白酶酶学性质。结果显示,两株米曲霉的形态差异明显:米曲霉1号菌落较大、发芽和产孢子较快,种曲及成曲颜色偏黄,菌丝较短,孢子较多;而米曲霉2号菌落较小,孢子发芽时间及产孢子时间比1号晚,成曲孢子较1号少,但菌丝长且粗壮,种曲颜色偏绿,成曲颜色偏白,米曲霉2号的产酶能力强。蛋白酶性质的研究结果显示,两株米曲霉成曲的蛋白酶性质有差异,1号和2号的最适反应温度分别为45℃和50℃,最适反应pH分别为6.0和9.0。此外,两株米曲霉的成曲蛋白酶的耐盐性相当,随着盐浓度的增大,酶活力均逐渐降低,在20%氯化钠条件下,酶活力均降至无盐条件下的20%~30%。     

章鱼肠道产蛋白酶菌的筛选、产酶条件及酶学性质

采用检测水解透明圈和测定蛋白酶活力的方法,从章鱼肠道中分离筛选出一株高产蛋白酶的菌株QDV-3,并对其产酶条件及酶学性质进行研究。结果表明:QDV-3菌株在以果糖为碳源,蛋白胨为氮源,培养基初始pH8.0,培养温度30℃的条件下振荡培养3.5d时,所产蛋白酶活力最高,Mn2+和Ba2+对菌株产蛋白酶有促进作用。所产蛋白酶在SDS-PAGE电泳上显示至少有5种蛋白酶,分子质量范围为32.4～124.2kD,蛋白酶的最适作用温度为50～60℃,最适作用pH值为9～11,在50℃条件下保温1h,剩余酶活力为95%,热稳定性较好。     

一种米曲霉耐盐蛋白酶的纯化及酶学性质分析

采用硫酸铵沉淀、Q-HP阴离子交换柱和Superdux 75凝胶柱等技术,从酱油大曲中纯化得到一种耐盐蛋白酶,经飞行时间质谱鉴定为钙蛋白酶RIM13,属于一种半胱氨酸蛋白酶。该蛋白酶的最适温度为50?℃;最适pH值为6.5;稳定温度为40?℃;稳定pH值为7.0;Mn2＋促进蛋白酶活力,Fe3＋、Fe2＋、Cu2＋、Ca2＋、K＋、Na＋抑制蛋白酶活力,以上金属离子对蛋白酶二级结构也产生不同程度的影响;米氏常数Km为2.43?g/L,最大反应速率Vm为103.09?mg/（L·min）。在5、10?g/100?mL和15?g/100?mL的NaCl质量浓度条件下,蛋白酶保留的酶活力分别为77.22%、54.39%以及41.15%。该蛋白酶在高盐度环境下保持较高的酶活力,因此具有潜在的工业应用价值。     

雅致放射毛霉3.2778羧肽酶性质及其活性中心结构的研究

固态发酵雅致放射毛霉菌株(Actinomucor elegans)3.2778得到羧肽酶粗酶液,以N-苄氧羰酰基-L-苯丙胺酰-L-亮氨酸(N-CBZ-Phe-Leu)为底物,采用镉-茚三酮法测定羧肽酶水解产物。结果表明:雅致放射毛霉3.2778羧肽酶最适作用pH值范围为6.5～7.2,最适作用温度范围在40℃～45℃,最适作用温度为40℃,在30℃～40℃具有良好的温度稳定性。0.99mmol/L金属离子中,Mg2+对羧肽酶活力表现出显著的促进作用,酶活提高37%;而Cu2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+可以抑制绝大部分酶活,残留的相对酶活力约10%。9.1mmol/L金属蛋白酶抑制剂1,10-邻菲啰啉(OP)和丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)和二异丙基磷酰氟(DFP)均可以完全抑制该酶活性,同时,对巯基有修饰作用的蛋白酶抑制剂PCMB、DTT、碘乙酸和β-巯基乙醇对羧肽酶有强烈的抑制作用。因此,推断该酶可能是一种丝氨酸羧肽酶,其活性中心有丝氨酸残基和二硫键结构,酶活受Mg2+激活。     

酱油发酵用2种米曲霉中性蛋白酶的酶学性质比较

米曲霉产蛋白酶的性质对酱油品质有重要的影响。研究以一株产中性蛋白酶的米曲霉CICIM F0899为研究对象,首先对其进行扫描电镜观察,与米曲霉沪酿3.042比较表明F0899的分生孢子头较小,分生孢子大于沪酿3.042。其次对F0899和沪酿3.042产蛋白酶酶学性质研究表明F0899产蛋白酶在20～40℃保持稳定,最适反应温度为60℃,在pH 6.0～8.0时保持稳定,最适反应pH为8.0,在盐浓度为18%的条件下,仍能保留20%的酶活,可达沪酿3.042的2.2倍,Ag+对F0899有严重的抑制作用,Fe3+没有明显的抑制。因此,米曲霉CICIM F0899产的蛋白酶在耐高温、耐低pH和耐高盐的性能优于沪酿3.042。     

毛霉蛋白酶的组分特性及对大豆蛋白水解的研究

毛霉是腐乳酿造的主要微生物之一,其分泌的蛋白酶对大豆蛋白具有较高的水解效率以及对蛋白水解物良好的脱苦效果,因此在大豆蛋白水解加工方面显示出很好的应用前景.本研究采用多种蛋白纯化的方法从毛霉胞外分离纯化出三种不同的蛋白酶组分.在探讨了各组分蛋白酶性质的基础上,考察了各种蛋白酶组分对大豆蛋白的水解效果.结果显示,纯化得到的碱性蛋白酶组分Pb1对大豆蛋白具有相对较强的水解能力,而酸性蛋白酶对大豆蛋白水解能力较差,碱性蛋白酶与酸性蛋白酶之间具有良好的协同作用.     

Proteolysis characteristics of Actinomucor elegans and Rhizopus oligosporus extracellular proteases under acidic conditions

Enzymatic hydrolysis of soybean protein isolate by the extracellular proteases from Actinomucor elegans and Rhizopus oligosporus at pH 3.0, 3.5, 5.0, 5.5 and 6.0 was investigated. The activity of the A. elegans protease is lower than that of R. oligosporus, but both proteases exhibit considerable degradation of soybean protein at pH 5.5 and 6.0. The water‐soluble protein content and the degree of hydrolysis of the hydrolysates are increased significantly, and bitterness values are very low. Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS‐PAGE) reveals that these proteases have different cutting sites on peptide polymers. At pH 5.5, there is a lower content of total free amino acids (39.20 mg per 100 mL; 62.68% hydrophobic amino acids) in the R. oligosporus protease hydrolysate. In conclusion, treatment with R. oligosporus protease at pH 5.5 achieves efficient degradation of soybean protein, suggesting a promising industrial process for making bitterless protein hydrolysates.     

基于序贯设计的毛霉AS3.2778发酵产蛋白酶工艺优化

本研究主要就毛霉AS3.2778固体发酵的工艺条件进行了探讨,利用序贯设计这一数学工具对影响产酶的若干因素进行了优化,并最终确立了相对稳定的发酵工艺条件。结果表明,每250ml三角瓶装8g麸皮,其中添加1.23%麦芽糖,1.56%蛋白胨,0.74%KH2PO4,0.06% FeSO4·7H2O作为辅助营养物,培养基的起始含水量为每克麸皮添加0.79ml水,发酵温度24.1℃,时间48h。在优化的工艺条件下,每克干基可发酵产酶1541U,是起始发酵单位的202%。     

雅致放射毛霉液体深层培养条件及发酵培养基的优化研究

文中研究了在摇瓶液体培养条件下,不同培养基成分及发酵条件对雅致放射毛霉菌丝体生长的影响,并经正交实验得到其民的培养基组成为：黄豆粉3％,饴糖0．5％,硫酸镁0．2％,磷酸二氢钾0．2％,酵母膏0．1％,在此条件下,28℃,200r/min摇瓶培养64h,毛霉菌丝体生物量（以菌丝体干重表示）可达1.02g/100mL.     

诱导少孢根霉分泌胞外β-葡萄糖苷酶条件的研究

对少孢根霉在液态发酵后产生的β-葡萄糖苷酶最大酶活时最适工艺条件进行了研究。研究结果表明以吐温-80、吐温-20、曲通-x、聚乙烯醇、V_c、醋酸钠和EDTA作诱导剂,以吐温-80的效果最佳,使用量为100μL/ 100mL时获得最大酶活;麸皮、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、玉米粉作碳源,以麸皮的产酶效果最佳,2%的麸皮使用量获得最大酶活。少孢根霉产β-葡萄糖苷酶最适发酵工艺条件:接种量2%少孢根霉在75mL黄豆芽液体培养基中,加2%的麸皮、调发酵培养基的初始pH值6.0,再加100μL/100mL诱导剂吐温-80,于35℃培养48h。     

雅致放射毛霉产孢子培养基组成及培养条件的优化

文中研究了在以麸皮为基础培养基的条件下,不同培养基的组成及培养条件对雅致放射毛霉生成孢子量的影响,并经正交试验得出其最优的培养基组成为外加1.0％的葡萄糖,0.1％氯化钙、0.2％硫酸铜、0.2％硫酸铵的麸皮培养基.雅致放射毛霉生成孢子的最佳培养条件为料液比1∶1.5,接种量为104个/mL的孢子悬浮液,28℃培养4d.     

雅致放射毛霉YYS-15菌株产菊粉酶发酵条件的研究

在摇瓶条件下对雅致放射毛霉YYS-15产菊粉酶的条件(不同的碳源、氮源、无机盐、初始pH值以及发酵量)进行了研究.经正交试验对其发酵条件优化后,确立了最适宜的发酵条件为菊粉20g/L、蛋白胨25g/L、KNO36g/L、KCl 5g/L、FeSO4·7H2O 0.1g/L、pH值为8.0,在28℃、振荡培养96h后酶活性达到27.36U/mL.     

Structural and Functional Properties of Fermented Soybean (Tempeh) by Using Rhizopus oligosporus

The effect of R. oligosporus on structural and functional properties of fermented soybean was studied. After 24 hours of fermentation, the amount of total free amino acids formed greatly increased in soybean (1.20 g/100 g soybean). The pH of the fermented soybean was neutral during the growth of the mold. The amount of g-amino butyric acid (GABA) gradually increased during fermentation of the soybean (21.4 mg/100 g soybean per 24 hours). The proteins (albumin, globulin, alkaline soluble) were rapidly degraded to amino acids and low-molecular-weight peptides. Instrumental texture of fermented soybean (48 hours) had higher weakness (7.14 N), modulus of elasticity (1.02 × 10⁹ Pa) and surrender value (8.17 × 10⁶ Pa); these values were significantly different (P < 0.05) compared with 24 and 72 hours fermentation. Cell structure of fermented soybean was proportionally disorganized during the course of fermentation. The cell walls, cytoplasm, and vacuoles could not be distinctly identified. R. oligosporus produced enzymes which hydrolyzed protein, lipid, and starch, providing growth substrates and playing a role in its metabolism. Metabolism of mold was attributed to soybean cell disorganization, and the ratio of mature mold became higher, which was indicated by dark color.