雄甾烯酮转化菌的诱变育种和发酵条件优化

采用紫外线照射和NTG对实验室保存的一株对植物甾醇有降解能力的Mycobacterium sp. SH5进行诱变处理,得到一株雄甾-4-烯-3,17-二酮(Androst-4-end- 3,17-dione, AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(Androst -1,4-end-3,17-dione, ADD)分解酶 (9α-羟化酶) 缺陷型菌株Mycobacterium sp. SH5-52.对Mycobacterium sp. SH5-52降解植物甾醇侧链得到AD (D) 的培养基组成、接种量、温度、pH值和溶氧等发酵条件进行了研究.在最佳的发酵条件下,投料质量浓度为0.6 g/dL时,AD (D) 的转化率由原来的37.2%提高到47.6%左右.     

降解植物甾醇产雄甾1,4-二烯-3,17-二酮工程菌株的构建及转化培养基优化

雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)作为甾体激素药物不可替代的中间体,是多种激素类药物的原材料。在分枝杆菌(Mycobacterium sp.ZFZ)体内过表达3-甾酮-Δ1脱氢酶(KstD),获得一株ADD生产菌,随后研究了不同培养基组成对该菌株生产ADD的影响。在单因素的基础上,以ADD产量为衡量指标,采用响应面法优化了转化培养基的组成,并建立各影响因素变化的二次回归方程。结果表明,最适宜的转化培养条件为玉米浆23 g/L、葡萄糖9 g/L、硝酸钠2.8 g/L、磷酸氢二钾2 g/L。此条件下底物甾醇浓度为10 g/L时,ADD的产量可达(4.12±0.18) g/L,ADD产量比出发菌株提高了近18倍。     

环糊精促进Burkholderia cepacia转化胆固醇生成胆甾-4-烯-3,6-二酮

Burkholderia cepacia可转化胆固醇生成甾体激素药物前体。通过质谱、红外光谱、核磁共振光谱等技术鉴定出一种有较高医药用价值的转化产物为胆甾-4-烯-3,6-二酮,但胆固醇的疏水性导致其转化得率较低。添加环糊精提高目标产物的转化得率,并考察环糊精对细胞生长及底物包埋情况的影响。分别选取多种环糊精(与胆固醇的摩尔比为1∶1)添加到转化体系,结果表明,甲基-β-环糊精和羟乙基-β-环糊精对提高胆甾-4-烯-3,6-二酮摩尔转化得率效果显著,分别是对照组的27.55倍和37.95倍。进一步优化羟乙基-β-环糊精的添加比例,当其添加量与底物胆固醇的摩尔比为2∶1时,产物胆甾-4-烯-3,6-二酮转化得率是摩尔比为1∶1时的1.59倍。红外光谱表征2 mol羟乙基-β-环糊精与1 mol底物胆固醇的包结络合情况,发现2 mol的羟乙基-β-环糊精可有效对胆固醇甾核的A环、侧链的26-C和27-C进行包被,形成稳定的包结物。羟乙基-β-环糊精可有效包被底物胆固醇,进而提高产物胆甾-4-烯-3,6-二酮的产率,为微生物转化生产胆甾-4-烯-3,6-二酮提供借鉴。     

Nocardia canicruria BF313催化甾体9α-羟基化发酵工艺优化

应用微生物转化的方法,以Nocardia canicruria BF313作为实验菌株,雄烯二酮为底物,研究了生物法制备9α-羟基雄烯二酮的新工艺。实验考察了转化培养基成分、投料方式、初始pH等因素对微生物转化生成9α-羟基雄烯二酮的影响。最终确定的发酵培养基为:15g/L葡萄糖,2g/L蛋白胨,5g/L酵母粉,1.5g/L硫酸亚铁。灭菌前调pH为7.0,以4%的接种量接种,预培养16h后以拟结晶方式投加底物,经过48h的转化,在投料浓度为10g/L情况下,底物转化率可高达97.2%,在投料浓度20g/L情况下,底物转化率也可达82.7%,投料浓度高于国际水平10g/L,具有极好的产业化前景。     

微生物降解植物甾醇侧链生产雄甾烯二酮的研究进展

甾体激素类药物是我国医药领域的重要门类,雄甾烯二酮是甾体激素类药物不可替代的中间体。微生物选择性降解植物甾醇侧链生成雄甾烯二酮,能替代复杂的多步化学合成法,并减轻目前由于薯蓣皂素为原料造成的资源紧缺,对合理利用我国的甾体植物资源,推动制药行业的发展有着重要的意义。本文结合相关的研究进展,综述了微生物选择性降解植物甾醇侧链菌种的选育与改良,水相体系中转化条件的优化及几种非水相转化系统的研究状况,并针对传统诱变育种耗时、费力、正突变率低、突变性状比较分散等缺陷,提出通过基因组改组技术实现突变性状优化重组,为构造甾醇微生物转化高产菌种提供广阔的发展空间。     

金龟子绿僵菌对甾体底物11-α羟化反应的工艺

研究了金龟子绿僵茵（Metarhizium anisopliae）对甾体底物16α、17α-环氧黄体酮（16α，17α—epoxy-4-pregnene-3，20-dione）的羟化反应工艺，考察了培养基组成、接种量、投料时间、转化时间、溶料方式、发酵级数等因素，探索了稀释发酵液以提高转化效率的新工艺。     

利用胆固醇氧化酶转化胆固醇制备胆甾-4-烯-3-酮

用酶法催化氧化胆固醇制备胆甾-4-烯-3-酮相对于化学法合成具有反应简单、成本较低等优点.作者探讨了在正辛烷作为有机相的两相反应体系中,以胆固醇氧化酶催化氧化胆固醇制备胆甾-4-烯-3-酮的方法.在胆固醇质量浓度为40g/L,反应时间40min、反应温度40℃、磷酸缓冲液-正辛烷体积比32、通氧40L/h及搅拌转速300r/min下,胆固醇转化率达到92%,经薄板层析及紫外扫描,发现转化产物为单一的胆甾-4-烯-3-酮.     

雄烯二酮耐底物突变株的筛选及生物转化培养基优化

采用紫外、硫酸二乙酯复合诱变的方法对能选择性降解植物甾醇侧链的新金分支杆菌MN2进行诱变处理,利用梯度平板技术筛选高底物耐受性突变株,通过摇瓶发酵实验检测其转化性能,以期筛选出具有较高底物耐受性且转化生成雄烯二酮（androst-4-ene-3,17-dione,AD）能力提高的突变株。最终筛选到1 株能在含高浓度底物平板上生长的AD突变株MN4。在底物甾醇投料量为20 g/L,摇瓶发酵144 h时AD生成率为40.9%,较出发菌株提高了15.1%。经斜面接种连续传代5 次,MN4突变株遗传性状稳定。对突变株MN4的发酵培养基进行优化,通过正交试验确定的最佳培养基配比为：葡萄糖1 g/L,玉米浆25 g/L,磷酸二氢钠0.6 g/L,硝酸钠6.2 g/L,豆油160 g/L。根据该配方进行转化,得到AD的生成率为50.6%。     

重组枯草芽孢杆菌表达4-木糖醇脱氢酶的发酵和反应条件优化

L-木酮糖(L-苏式-戊酮糖)是一种昂贵的稀有戊糖,而4-木糖醇脱氢酶(xylitol-4-dehydrogenase,XDH)是生物合成L-木酮糖(L-xylulose)的关键酶。为了促进L-木酮糖的生产,对枯草芽孢杆菌外源表达4-木糖醇脱氢酶的发酵条件进行优化,并对以木糖醇为底物静息细胞催化反应合成L-木酮糖的反应条件进行研究。通过单因素实验确定了最佳培养基的成分(g/L)为:蔗糖25,尿素6,MgSO_40. 05,MnSO_40. 01,FeSO_40. 01,初始pH值8. 0。最佳发酵条件为:装液量40 mL(250 mL锥形瓶),接种量1. 67%,发酵培养温度28℃。在优化条件下4-木糖醇脱氢酶酶活为5. 183 U/L,与初始酶活相比提高了231. 2%。最优反应条件:底物质量浓度20 g/L,50mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH 10. 0),反应温度45℃,优化反应条件下转化率达到17. 74%。通过对菌株发酵和反应工艺条件的优化,为后续L-木酮糖工业化生产奠定了基础。     

微生物发酵法生产去氢表雄酮检测方法的建立

建立了一个微生物发酵生产去氢表雄酮(DHEA)的检测方法,采用气相色谱法同时测定发酵液中雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)、去氢表雄酮甲氧基甲基醚和DHEA含量。发酵液经乙酸乙酯萃取,可直接进样分析。气相色谱条件为:FID检测器,DB-1型(30 m×0.53 mm×0.25 m)毛细管柱;柱温280℃,进样口280℃,检测器310℃;载气为高纯N2,流速1 m L/min。在实验室条件下,发酵液中各主要成分分离情况良好。结果表明:4-AD、去氢表雄酮甲氧基甲基醚和DHEA的浓度线性范围分别为:4-AD为0.2~1.0 g/L(R2=0.996);去氢表雄酮甲氧基甲基醚为0.1~0.9 g/L(R2=0.992);DHEA为0.2~1.0 g/L(R2=0.998),平均回收率依次为(97.88±0.74)%,(99.39±1.07)%和(98.91±1.09)%。该方法具有步骤简单,重现性好,准确度和灵敏度高的特点。