γ-聚谷氨酸生产菌种的ARTP诱变及其发酵条件优化

γ-聚谷氨酸是一种由生物所合成的氨基酸聚合物,具有极强的水溶性,生物相容性,能被广泛的运用到食品、医药、日化、环保、农业等行诸多领域,具有巨大的市场前景。本实验以实验室保藏的一株产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis QY-27为出发菌株,通过常压室温等离子体(ARTP)诱变,筛选获得一株遗传性能稳定的高产γ-聚谷氨酸突变菌株Bacillus licheniformis QS-21,该突变菌株γ-聚谷氨酸的产量较出发菌株的9.12g/L,提高了42.26%,达到15.89g/L。对筛选获得的变异株发酵条件优化结果显示,L-谷氨酸20g/L,甘油100g/L,Mg SO4·7H2O0.5g/L为变异株合适发酵培养基,在37℃,摇瓶转数230r/min,发酵培养72h,γ-聚谷氨酸的产量达22.56g/L,比优化前提高了29.56%。     

γ-聚谷氨酸高产菌株Bacillus natto S003-D16的选育和优化

以产γ-聚谷氨酸的纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto S003)为出发菌,经紫外(UV)-硫酸二乙酯(DES)复合诱变,分离筛选得到1株高产稳定突变株Bacillus natto S003-D16,经摇瓶实验验证γ-聚谷氨酸的含量达到20.58g/L,较出发菌株提高40.38%.通过正交试验优化的培养基组成为:味精废液120mL/L、豆粕50g/L、葡萄糖30g/L、FeCl3 0.4g/L、MgSO4 0.6g/L、MnSO4 0.01g/L、K2HPO4 0.2g/L,pH7.0;利用优化的培养基在500mL三角烧瓶装液量100mL,37℃、230r/min条件下培养72h,发酵液中的γ-PGA产量可达到31g/L.纯化后产物经红外光谱鉴定其结果与标准品的图谱基本一致.     

γ-聚谷氨酸的发酵条件优化及其初步表征分析

为提高微生物发酵生产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的产量,采用枯草芽孢杆菌发酵制备γ-聚谷氨酸,并通过单因子试验及正交试验分析,得到枯草芽孢杆菌发酵生产γ-聚谷氨酸的最佳营养条件为:40g/L葡萄糖、5g/L酵母膏、30g/L谷氨酸钠、3g/L NH4Cl、2g/L K2HPO4、0.25g/L MgSO4:最佳培养条件为:接种量2%,装液量40mL(250ml三角瓶),培养温度37℃,摇床转速200r/min,pH值7.0,发酵时间48h,此时γ-聚谷氨酸的产量最高,达到20.15g/L.纯化后产物经纸层析及红外光谱检测,初步确定为γ-聚谷氨酸.     

发酵生产γ-聚谷氨酸的补料策略

采用补料分批发酵方法对Bacillus subtilis GXA-28摇瓶发酵生产γ-聚谷氨酸的初始葡萄糖和谷氨酸钠浓度、补料时间、补料配方等进行了研究。确定最优补料时间为17 h,补料配方:葡萄糖20 g/L,谷氨酸5 g/L,KH2PO40.5 g/L、MgSO40.1 g/L。在优化的补料条件下,γ-聚谷氨酸产量由16.24 g/L提高至24.36 g/L,较分批发酵提高了50%;生产强度由0.74g/(L·h)提高至0.87 g/(L·h)。研究结果表明,采用分批补料发酵方法能提高γ-聚谷氨酸生产率,实验方法可给γ-聚谷氨酸中试研究提供参考。     

外源氧载体和前体L-谷氨酸添加策略提高Bacillus subtilis HB-1发酵产γ-聚谷氨酸

为了提高外源L-谷氨酸依赖性菌株枯草芽孢杆菌HB-1产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的能力,采用添加氧载体和前体L-谷氨酸的策略,研究其对菌体生长和γ-PGA产量的影响。摇瓶单因素结果表明,最佳氧载体为聚二甲氧基硅烷(PDMS),在原始培养基中添加体积分数为10%的PDMS,菌体OD600提高了3～5倍;前体L-谷氨酸的最适添加时间为18 h,最适添加质量浓度为10 g/L。在3 L发酵罐扩大培养后,γ-PGA产量提高到45 g/L;在发酵30 h流加碳源和前体L-谷氨酸,γ-PGA质量浓度达到52 g/L。发酵产物经红外,氨基酸分析仪等证实其为多肽类化合物,相对分子质量高达1 000万。     

紫外和He-Ne 激光复合诱变获得高产γ - 聚谷氨酸产生菌的研究

以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BCPG006为出发菌株,通过紫外线和He-Ne激光复合诱变处理,后将诱变菌悬液涂布到抗性平板,选育出一株高产γ-聚谷氨酸的突变株BCPG078,经过摇瓶发酵,培养温度37℃、初始pH7、摇床转速220r/min、培养周期72h,测得γ-聚谷氨酸的产量为16g/L,为出发菌γ-聚谷氨酸的产量(6g/L)的2.67倍。传代实验证明,该突变株遗传性能稳定。说明紫外线和He-Ne激光复合诱变是γ-聚谷氨酸产生菌地衣芽孢杆菌有效的选育方法。     

碳源对γ-聚谷氨酸发酵的影响

以γ-聚谷氨酸生产菌yt102为供试菌株,研究了碳源对γ-聚谷氨酸发酵的影响.首先通过摇瓶实验确定发酵的最佳碳源为葡萄糖和柠檬酸,二者按一定的比例混合更有利于聚谷氨酸的产生,进一步利用10L发酵罐补料分批发酵确定碳源的最佳用量为40g/L,继续优化培养条件,确定采用溶氧控制的脉冲补料方式可有效延续γ-聚谷氨酸的合成.在最优发酵条件下,通过10L发酵罐补料分批发酵50h,r-聚谷氨酸产量可达34.5g/L.     

一株非谷氨酸依赖型聚谷氨酸产生菌的筛选和鉴定

从土壤中分离到1株可不依赖谷氨酸发酵产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的菌株SK19.001,通过16S rDNA序列比对并结合菌株的形态、生理生化特征分析,鉴定此菌株为甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。在以甘油和蛋白胨F403为碳源和氮源的培养基中,37℃振荡培养24 h,γ-PGA产量可达到14.57 g/L。     

微生物发酵合成γ-聚谷氨酸的初步表征分析

以一株γ-聚谷氨酸高产菌——枯草芽孢杆菌B-115为实验菌株,通过单因素试验对其发酵条件进行优化,结果显示:最佳发酵条件为初始pH6.5、接种量2%、装液量50 mL/250 mL、转速150 r/min、37℃培养84 h;γ-聚谷氨酸的产率从57.85 g/L提高为68.3 g/L。且通过薄层层析、红外检测等方式对其发酵产物进行初步表征分析。     

枯草芽孢杆菌ZJS18发酵生产γ-聚谷氨酸培养条件的优化

通过响应面法对枯草芽孢杆菌ZJS18发酵生产γ-聚谷氨酸的培养条件进行优化。首先采用Plackett-Burman试验设计筛选出对γ-聚谷氨酸产量有显著影响的3?个关键因素,即蔗糖、酵母粉和谷氨酸钠;然后通过Box-Behnken试验设计和响应面法对这3?个关键因素的用量进行优化。响应面优化后的3?个关键因素的最佳质量浓度为蔗糖64.40?g/L、酵母粉7.10?g/L和谷氨酸钠57.96?g/L。枯草芽孢杆菌ZJS18发酵生产γ-聚谷氨酸的最佳培养条件为蔗糖用量64.40?g/L、酵母粉用量7.10?g/L、谷氨酸钠用量57.96?g/L,氯化钠用量30?g/L,MgSO4用量0.3?g/L、K2HPO4用量2?g/L,初始pH?7.5,接种量5%,装液量40?mL/250?mL,温度37?℃,摇床转速200?r/min,发酵时间36?h。在上述条件下,γ-聚谷氨酸产量为13.20?g/L。与未优化前相比,产量提高了1.88?倍。     

基于径向基神经网络和遗传算法的聚-γ-谷氨酸发酵培养基优化

为了提高聚-γ-谷氨酸（PGA）的产量,采用正交设计方案对发酵培养基组分中谷氨酸、葡萄糖、柠檬酸、甘油的配比进行试验设计,运用径向基神经网络建立PGA产量与培养基组分浓度之间的预测模型,采用遗传算法对此模型进行全局寻优,得到四种主要组份的最佳配比：谷氨酸21.2g/L、葡萄糖75.4g/L、柠檬酸7.2g/L、甘油10.8g/L,PGA产量达到12.8g/L,采用上述方法优化后的培养基使PGA的产量原始培养基提高了39.1%.     

各种氨基酸对枯草芽孢杆菌生产聚谷氨酸的促进作用

研究了各种氨基酸对枯草芽孢杆菌发酵生产聚谷氨酸的影响。在发酵初始添加3 g/L天冬氨酸、1.5 g/L苯丙氨酸和在对数生长期晚期添加7 g/L谷氨酸使聚谷氨酸产量分别提高12.6%,23.7%和31.7%。再用均匀设计法进一步优化。优化后的氨基酸添加量为:8 g/L谷氨酸、3.5 g/L天冬氨酸、1 g/L苯丙氨酸,γ-PGA产量达到37.92 g/L,与优化前得到的培养结果相比,提高了9.9%。     

响应面法优化发酵乳杆菌产γ-氨基丁酸的培养条件

γ-氨基丁酸（GABA）是一种广泛分布于自然界的非蛋白质氨基酸,其在生物体内主要由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶的作用下脱羟生成,是目前研究较深入的一种重要抑制性神经传递物质。为了提高发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）SD2112的GABA产量,该研究通过单因素及响应面法优化了菌株SD2112转化谷氨酸生成GABA的发酵条件。结果表明,菌株SD2112产GABA的最佳发酵条件为：底物谷氨酸添加量50 mmol/L、pH值5.0、接种量5%、37 ℃恒温培养72 h。在此优化条件下,GABA产量为2.97 g/L,相比于优化前提高了2.6倍。     

无外源脯氨酸发酵产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的构建及发酵优化

为实现无外源脯氨酸的条件下直接从葡萄糖转化生成反式-4-羟脯氨酸,本实验采用定点突变和基因共表达的方法构建重组大肠杆菌:首先对L-脯氨酸生物合成途径中的关键酶谷氨酸激酶进行定点突变E143A、K145A,以增强L-脯氨酸生物合成能力;然后引入脯氨酸4-羟化酶基因,通过两个基因的共表达可以实现从葡萄糖到反式-4-羟脯氨酸的连续转化,而不再需要添加外源L-脯氨酸。得到的L-脯氨酸生物合成能力增强的菌株在摇瓶阶段L-脯氨酸的产量可达到1.4 g/L;pro BA2与hyp双基因共表达菌株的反式-4-羟脯氨酸产量为98.9 mg/L,比原始菌株提高了一倍,经发酵优化后得到培养基为:葡萄糖10 g/L,胰蛋白胨15 g/L,硫酸亚铁3 mmol/L,硫酸镁1 g/L,磷酸氢二钾3 g/L,氯化钙0.015 g/L,在这个培养条件下反式-4-羟脯氨酸的产量为220.0 mg/L,比优化前提高1.2倍。      

产聚γ-谷氨酸菌株的筛选及鉴定

从高温处理过的豆瓣酱等样品中分离获得1株细菌菌株L536,其产物经纸层析分析及氨基酸组成分析鉴定,确定是聚谷氨酸。菌株L536通过形态特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析,初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylolique faciens)。该菌株在37℃,180 r/min振荡培养48h,产γ-PGA可达15 g/L。     

产γ-氨基丁酸乳酸菌的分离鉴定及发酵条件优化

从四川泡菜水中分离筛选出一株产γ-氨基丁酸(GABA)能力较强的乳酸菌W1-9,根据菌落和个体形态、生理生化指标及16S r DNA序列的系统鉴定,菌株W1-9为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。菌株W1-9在含10 g/L谷氨酸(Glu)的MRS培养基中培养3 d,可产生2.18 g/L GABA。通过对菌株发酵培养基及发酵条件优化,结果表明:以黄瓜汁为发酵培养基,初始p H 5.5,底物谷氨酸钠(MSG)添加量12 g/L,菌液接种量1.2%,在该条件下GABA产量达到7.62 g/L。     

枯草芽孢杆菌发酵生产聚-γ-谷氨酸的条件优化

为提高聚-γ-谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)产量,降低其生产成本,利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),采用单因素试验及正交试验优化法,探究培养基组分及发酵条件对γ-PGA发酵产量的影响。结果表明:最佳培养基组成和培养条件为:蔗糖5%,谷氨酸钠6%,氯化铵0.3%,磷酸氢二钾2%,磷酸二氢钾0.1%,硫酸锰0.003%,p H 7.0,接种量为3%,发酵温度33℃,发酵时间48 h。与未优化前γ-PGA产量(15.8 g/L)相比,经优化后的产量达20.8 g/L,提高了31.65%。     

细菌纤维素/γ-聚谷氨酸复合膜发酵条件的优化

在发酵培养基中添加γ-聚谷氨酸(γ-PGA),可以制备具有更优性能的细菌纤维素(BC)复合膜.采用响应面分析法优化细菌纤维素/γ-聚谷氨酸复合膜发酵生产工艺,首先通过Plackctt-Burman试验设计对影响复合膜发酵生产的8个因素进行筛选,得到3个关键影响因子:聚谷氨酸添加浓度,pH和γ-聚谷氨酸的添加时间;然后用最陡爬坡试验逼近响应值的最大区域;最后通过Box-Behnken设计及响应曲面分析确定了各考察因子的最佳取值:葡萄糖25g/L,柠檬酸6g/L,Na2HPO42g/L,γ-聚谷氨酸1.04g/L,γ-聚谷氨酸的添加时间4h,发酵初始pH5.0,温度30℃,发酵周期7d.在优化条件下复合膜的湿重达到61.07g/100mL培养基试验值与预测值误差为-3.05%,较初始培养基复合膜产量提高9 1.32%.     

克雷伯氏菌产1,3-丙二醇aldH基因缺失菌株的构建

该研究利用λRed重组技术对克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia）中的乙醛脱氢酶（aldH）基因进行敲除,成功构建缺失菌株K.pneumonia2-1ΔaldH,与原始菌株相比,缺失菌株K.pneumonia2-1ΔaldH发酵液中乙醇产量由原来的7.24 g/L降为0.47 g/L,降低了93.51%;1,3-丙二醇产量由原来的78.83 g/L增长至82.55 g/L,提高了4.72.%;甘油转化率由60.64%增长至63.50%,提高了2.86%。缺失菌株K.pneumonia2-1ΔaldH 50 L发酵罐小试试验中,1,3-丙二醇的产量为78.13 g/L,乙醇产量为0.50 g/L。     

紫外线与氯化锂复合诱变选育L-组氨酸产生菌

以一株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)S6为出发菌株,利用氯化锂、紫外线进行诱变,通过实验证明氯化锂诱变剂量在1.2%时致死率达到82.4%,紫外线在照射30 s时致死率达到81.8%.利用氯化锂诱变谷氨酸棒杆菌S6,所得菌株D3的L-组氨酸产量为243 mg/L,比出发菌株提高10.5%;以紫外线做诱变S6,所得高产菌株U1产量256 mg/L,比出发菌株提高8.5%;以紫外线、氯化锂复合诱变S6,所得菌株N1产量为251 mg/L,比出发菌株提高13.6%,结果显示,经紫外线与氯化锂复合诱变后的菌株N1产L-组氨酸的产量最高,比氯化锂诱变后的菌株产L-组氨酸量提高3.1%,比紫外线诱变后的菌株产L-组氨酸量提高5.1%.