人乳头瘤病毒16型亚基因E6E7体外恶性转化细胞的分子生物及超微结构研究

在我组分子流行病学研究基础上,证明HPV—16的E6E7亚基因片段与宫颈癌的发生有密切关系,可能系HPV—16的致癌基因。为进一步证明此结论,本文使用磷酸钙/DNA共沉淀方法与基因工程重组逆转录病毒转染方法,将HPV—16全早期区基因及其E6E7亚基因分别重组于小鼠白血病逆转录病毒之中,人工构建了具有单嗜性(ecotropic,仅感染鼠细胞)及双嗜性(am-photropic,可感染鼠与人细胞)的含HPV—16亚基因的重组逆转录病毒,将HPV—16全基因,     

基因工程重组人乳头瘤病毒亚基因致癌的分子生物学及超微结构研究

我们用基因分子生物学结合超微结构的方法在318例人宫颈癌标本中证明人乳头瘤病毒16型(HPV-16)与中国妇女宫颈癌的发生关系密切。它的亚基因片段,E_6-E_7早期基因可能是HPV-16的致癌基因。本文采用近年来开始发展起来的基因工程方法,将HPV-16的全部早期区基因及E_6-E_7基因分别重组至逆转录病毒(小鼠白血病病毒)的基因组中,将比重组的逆转录病毒导入培养细胞,在细胞中大量牛成并释放病毒颗粒到培养液中(此细胞称为重组病毒生成细胞)。借助重组病毒感染方式介导基因转移进行体外转化研究。采用重组逆转录病毒感染方式研究属于DNA病毒的HPV-16的致癌潜能,国内外尚未见报道。我们证明它是目前体外研究转化功能效率最高,最稳定的方法。     

用电子显微镜对大菜粉蝶颗粒体病毒(pbGV)颗粒体蛋白基因的定位

为了尝试用电子显微镜技术对基因进行定位,我们将pbGV基因组DNA经限制性内切酶EcoRI酶解后得到的E—V及E—I片段分别与感染晚期mRNA(主要成份为颗粒体蛋白mRNA及16K蛋白mRNA)杂交,用R—环法制备电镜样品。电镜观察表明,E—I和16K蛋白mRNA形成的R—环长度约0.1μ;E—V和颗粒体蛋白mRNA形成的R—环长度约0.3μ;电镜结果与生化试验结果相符。同时统计结果表明,颗粒体蛋白基因位于E—V片段的2/7处,16K蛋白基因位于E—I片段1/4处。     

核酸杂交,改良PCR对宫颈湿疣,宫颈癌的人乳头瘤病毒基因检测与超微结构对比研究

为明确人乳头瘤病毒(HPV)与人宫颈癌的关系及致癌的分子机理,取自宫颈癌高发区新疆、华北;中发区湖北、黑龙江;低发区贵州的宫颈癌318例,慢性宫颈炎39例,湿疣86例,宫颈上皮内新生物(CIN)14例及正常宫颈上皮24例在用斑点、Southern blot。原位核酸杂交进行HPV—11,16及18基因检测的同时进行同一标本的电镜对比观察。为更精确检测HPV基因及探素早期基因诊断的新法又发展了改良PCR对106例宫颈癌(新疆73,华北33例),湿疣72例     

4K节目轻松剪Vegas Pro 12 Edit

2013年10月16日,索尼（中国）有限公司在上海发布7Handycam首款手持4K数码摄像机FDR—AX1E,为消除用户购买FDR—AX1E后如何剪辑4K的顾虑,索尼公司向购买FDR—AX1E便携式摄像机的用户免费提供可以剪辑4K的Vegas Pro 12Edit软件。可以说从前期拍摄到后期剪辑,索尼为影像创作者提供了一个完善的4K流程解决方案。     

光动力疗法联合液氮冷冻治疗复发性尖锐湿疣的临床疗效及对患者局部人乳头瘤病毒6/11型载量的影响

探讨5-氨基酮戊酸光动力疗法(ALA-PDT)联合液氮冷冻治疗复发性尖锐湿疣的临床疗效及对患者局部人乳头瘤病毒(HPV)6/11型载量的影响。对30例复发性尖锐湿疣患者进行ALA-PDT联合液氮冷冻治疗,每7～14 d重复一次,共4次。治疗结束后每2周复诊1次,在末次治疗后3个月进行临床疗效评估。采用实时荧光定量PCR技术检测联合治疗前及末次治疗结束后2周原病灶部位HPV6/11DNA,分析联合治疗后HPV6/11转阴率及未转阴患者病毒载量的变化情况。完成联合治疗的27例患者中,6例(22.22%)在末次治疗后3个月内疣体复发。该27例患者中有25例在联合治疗前HPV6/11DNA阳性,其中16例(64.00%)在末次治疗结束后2周HPV6/11DNA转阴;其余9例HPV6/11DNA未转阴者,对其联合治疗前后病毒载量的变化情况运用2^-ΔΔC_t相对定量法分析得出,经联合治疗后原病灶部位HPV6/11DNA载量明显低于联合治疗前,两者差异有显著统计学意义(S=-22.5,P<0.01)。可见,ALA-PDT联合液氮冷冻治疗能够有效地降低复...     

人DC-SIGN真核表达载体的构建及表达

目的构建含有FLAG标签的人DC—SIGN真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得含有FLAG标签的人DC—SIGN分子基因,将其插入到真核表达载体pIRES—neo中。构建的重组质粒pIRES—neO—FLAG—DC—SIGN转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及WesternBlot检测其表达情况。结果含FLAG标签的人DC—SIGN基因测序正确,PCR和酶切鉴定证明FLAG—DC—SIGN基因已成功连入真核表达载体pIRES—neo中;检测结果显示重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN,且在293T细胞中能有效表达,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础。     

尖锐湿疣的超微结构和乳头瘤病毒抗原的检测

1986年6月至1987年12月,我科共做尖锐湿疣活组织检查80例。诊断根据病史,大体表现和组织学检查。光镜下每例均查见凹空细胞。(Koilocyte)30例作了人乳头瘤病毒抗原(HPV—Ag)检测,采用PAP免疫酶染色法(DAKO kit)。12例检测出HPV—Ag,阳性率40％。阳性细胞主要见于表层和棘层上部的凹空细胞,表现为细胞核内呈棕褐色颗粒,细胞浆内未见棕褐色颗粒。各例阳性细胞数量差异较大,阳性率与取材大小和数量有较大系系。HPV—Ag阳性的凹空细胞与HPV—Ag阴性的凹空细胞,光镜下形态无明显差异。15例取新鲜组织按电镜常规处理,制片,电镜下5例找到病毒颗粒,阳性率33.3％。均见于表层和棘层最上部细胞的核内。病毒颗粒呈球形,直径50-55nm,有致密核心和衣壳,无包膜,典型者排列呈结晶状图1。凹空细胞较大,核增大,核膜欠规则,一些细     

人乳头状瘤病毒感染与外阴营养不良相关性的研究

目的：探讨人乳头状瘤病毒(HPV-16)感染与外阴营养不良的关系。材料和方法：28例外阴白斑和外阴营养不良石蜡包埋的组织，7例外阴营养不良的新鲜组织，来自哈尔滨医科大学附属第一医院病理科舜口黑龙江省医院病理科，采用免疫组化sABC法和电镜技术进行检测。结果：临床诊断为外阴营养不良，光镜下28例病理分型，11例为增生型营养不良型，HPV-16阳性表达100％；3例为萎缩硬化性苔癣和14例混合性营养不良型，HPV阳性表达减弱或无表达。免疫组化显示，HPV-16高表达于增生的棘细胞和基底细胞内，电镜下在棘细胞和基底细胞核内可见到清晰的病毒颗粒。结论：研究结果指出，外阴营养不良的增生型营养不良类型与HPV-16感染关系非常密切，外阴癌前病变在一定程度上和人HPV病毒感染有关。     

杆状病毒重组病毒对IPLB SF21—AE细胞株之细胞病毒研究

利用含有B型肝炎表面抗原S段基因之重组病毒感染IPLBSF 21—AE细胞株研究其细胞病变并与野生型病毒ACNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)之细胞病变作为比较。重组病毒对细胞较具毒性,于感染细胞中,野生型与重组病毒所产生之子病毒大小与纤维状物质并无差异。但于重组病毒感染的细胞中较易观察到具有二至三倍长的核蛋白质鞘。不同病毒感染的细胞以感染后期之差异较大。野生型病毒感染的细胞核内可见许多含有包埋体病毒的多角体(polyhedra),病毒形成团(virogenic stroma),以及累积之多角体被膜(图1)相反地,重组病毒感染的细胞内并无多角体,但核内可见核蛋白质鞘及已披上被膜之核蛋白质鞘团,并可见明显的膜状构造包围核四周(图2),以及嵌于膜上直径约22nm的电子致密颗粒(图3),此结果证明了重组病毒合成之S蛋白并非以游离方式存在,而是嵌在膜构造内。     

一株来自脑炎患者的类C型逆转录病毒形态学研究

在探讨神经系统疾病病毒病因的研究中,蓝祥英等从一例脑炎患者血细胞培养中获得一株可检出逆转录病毒样颗粒,称为CM_1的细胞株后,又将CM_1细胞株的无细胞滤液转化另一多发性硬化患者外周血淋巴细胞,而成CM_2细胞株。本文报告CM_2细胞株及其病毒的超微形态。材料和方法:培养传代的CM_2细胞以及加PHA和TPA激活的CM_2细胞分别离心成团,4％戊二醛固定,常规方法包埋,制备超薄切片,铀一铅双染色,JEM1200EX电镜观察。结果和讨论:培养传代的CM_2细胞以及经加PHA和TPA激活的细胞,大小约9—15微米,个别巨大细胞可达20微米以上。细胞核明显多形性,核内以常染色质为主,胞浆以丰富核蛋白体     

杂交瘤细胞株中电镜检出逆转录病毒

淋巴细胞杂交瘤技术在国内外已广泛应用于生产多种纯度高、专一性强的单克隆抗体。我们应用透射电镜检查不同实验室来源的10份融合前小鼠骨髓瘤细胞系(SP_2/0,SN—1)和4株杂交瘤细胞(T—17—3,A—9,B—10,C—8)发现上述细胞内均含病毒颗粒。在胞浆内,病毒颗粒聚集在粗面内质网池中。成熟病毒颗粒呈圆形或长圆形,偶见哑呤状或花瓣状,直径约100nm。病毒核衣壳中心透亮,外周致密,呈环状或不全环状(图1)。有处粗面内质网呈现局部增厚和病毒芽生图象。偶见核膜间隙内含病毒颗粒。此种病毒颗粒的形态结构特点类似逆转录病毒科(Retroviridae)中的A型肿瘤RNA病毒。在细胞外和细胞间隙中还可查见散在或成群的球形     

实时荧光定量PCR检测人肝癌组织皮层肌动蛋白基因

目的建立实时荧光定量PCR检测皮层肌动蛋白基因表达水平的方法。方法提取人肝癌组织总RNA,RT—PCR扩增CTTN和GAPDH基因片段并分别构建两片段阳性表达载体。采用SYBR Green I实时荧光定量PCR绘制两基因拷贝数标准曲线,实测人肝癌标本并进行方法学评价。结果成功构建pMD18-T（＋）／CTTN和pMD18-T（＋）／GAPDH重组质粒。CTTN和GAPDH基因模板拷贝数分别在1．6&#215;10^3-1．6&#215;10^7和1．6&#215;10^4-1．6&#215;10^7之间时标准曲线有良好线性关系,R^2分别为0．996和0．985。由Ct值统计两基因组内变异系数分别为0．11％～2．25％和0．75％-3．63％;组间变异系数分别为0．83％～1．48％和0．47％～1．36％。组间无统计学差异（P〉0．05）。结论成功建立实时荧光定量PCR检测人肝癌组织CTTN基因的方法,为研究人肝癌组织CTTN基因表达水平奠定了方法学基础。     

提高mdr1基因体外转染骨髓造血细胞效率的实验研究

目的：探讨mdrl基因体外转染兔骨髓造血细胞的条件及转染后在细胞中的功能性表达。方法：秋水仙碱（90ng／ml）筛选含人mdrlcDNA的产病毒包装细胞PA317-HaMDR1／A,制备浓缩病毒上清液并转染兔骨髓单个核细胞;分别用PCR法、免疫组织化学法和柔红霉素（daunorubicinDNR）排出试验检测mdr1基...     

中巴地球资源一号卫星红外多光谱扫描仪、交叉定标方法研究

建立CBERS—1上搭载的红外多光谱扫描仪(IRMSS)与FY—1C通道4及Landsat-7上ETM 波段6多星星载热红外遥感仪器交叉定标的算法模型，利用美国Landsat-7上搭载的ETM 红外通道6和FY—1C通道4分别对IRMSS热红外通道进行交叉定标，得到二组定标结果．相同地标点对比分析结果表明，二个定标结果得到的目标点亮度温度相对偏差为1．2K；IRMSS交叉定标结果与Landsat-7ETM 热红外通道在轨定标结果独立样本对比分析结果，均方根偏差为1．6K．     

中国妇女宫颈癌与人乳头瘤病毒关系的研究

人宫颈癌与人乳头瘤病毒(HPV)的关系是当前国际重视的研究课题之一。在我国有关研究鲜有报道。本文在国内五个地区(新疆、北京、湖北、黑龙江、贵州)共获得病理学确诊的人宫颈鳞状上皮癌318例,宫颈上皮内新生物(CIN)14例,宫颈及外阴湿疣48例,慢性宫颈炎34例及正常宫颈上皮组织24例。将上述组织提取DNA后,以~32P标记的HPV—11,16,18三型病毒DNA为探针与上述组织进行Dot Blot及Southern Blot核酸杂交。其中32例宫颈癌10例正常宫颈及27例宫颈及外阴湿疣还进行平行的电子显微镜对比研究。对于湿疣病例还进行了以酶标法代替H标记的原位核酸杂交的观察研究,结果表明:     

人PSCA真核表达载体的构建及表达

目的构建含有信号肽及FLAG标签的人前列腺干细胞抗原(PSCA)真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得SIG-FLAG基因片段及人PSCA基因片段,插入到真核表达载体pIRES-neo中。构建的重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及RT-PCR方法检测其表达情况。结果PCR扩增出的SIG-FLAG及PSCA基因测序正确,酶切鉴定证明重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA构建成功;检测结果显示重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA,且在293T细胞中能有效表达,为后续转人PSCA基因细胞系的构建工作奠定了基础。     

一株正常人外周血带EB病毒的B淋巴细胞(H—18)的超微结构研究

H—18细胞系由我国一例正常人外周血分离出的B淋巴细胞培养成株。经免疫荧光及免疫酶标光镜检查发现该细胞EB病毒壳抗原(VCA)阳性,如用正丁酸钠及巴豆油等病毒激活剂处理后,大量细胞(30—40％)显示VCA阳性。分离出的病毒可使体外培养细胞转化。用正常H—18细胞为对照,经正丁酸钠(4mM/ml)及巴豆油(500ng/ml)处理H—18后12,24,36,48,72小时的标本用国产DXB 2—12电镜观察。发现正常H—18细胞超微结构与正常人B淋巴细胞有很大差别。大小不一,核很不规则,核比例大,且几全部由常染色质组成。为分化很差或为转化的淋巴细胞。个别细胞内可见EB病毒之核壳体及其形态发生过程,证明该细胞带有EB病毒并进行病毒的复制。经正丁酸钠及巴豆油处理后12小时,部分细胞可见病毒大量复制。随时间的延长逐步增多,至72小     

人G250真核表达载体的构建及稳定转染B16细胞系的建立

目的构建人G250真核表达载体,建立稳定表达人G250的小鼠黑色素瘤细胞系。方法采用PCR方法扩增出人G250基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo-sig中,并加入酶切位点和FLAG标签,得到重组表达质粒pIRES-neo-sig-FLAG-G250。利用阳离子脂质体介导法将其稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出阳性克隆。RT-PCR及免疫荧光检测人G250在B16细胞中的表达。结果经限制性内切酶鉴定及序列分析,pIRES-neo-sig-FLAG-G250重组质粒构建正确,最终建立的表达人G250基因的B16细胞系阳性率接近100%。结论成功构建了真核表达载体pIRES-neo-sig-FLAG-G250,建立的稳定转染人G250小鼠黑色素瘤细胞系能够高效表达G250基因。该稳定转染细胞系的建立为G250在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。     

猴艾滋病病毒(SRV—1)形态发生学观察

本文报导了猴艾滋病D型逆转录病毒(SRV—1)接种实验猴前后,有相同形态学特征,描述了培养细胞内外,有五种形态的病毒颗粒;(1)偏心位置核心病毒颗粒;(2)锥形或棒形核心病毒颗粒;(3)等电子密度圆形病毒颗粒;(4)圆环形核心病毒颗粒;(5)带尾形病毒颗粒。同时描述了病毒出芽释放连续过程和细胞内A型颗粒形态。带尾形病毒颗粒,以前未见有报导。