阿魏蘑漆酶同工酶的异源表达及酶学性质研究

共培养是提高漆酶发酵水平的一种有效手段,实验室前期研究发现,较之单培养,在阿魏蘑与胶红酵母的共培养过程中,阿魏蘑漆酶基因lacc2和lacc6的转录水平发生了明显变化。通过克隆得到阿魏蘑漆酶基因lacc2和lacc6,异源表达后对2个重组漆酶LACC2和LACC6进行分离纯化和酶学性质分析。以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate), ABTS]为底物时,LACC2和LACC6的最适反应温度和pH相同,分别为50℃和3.0;低浓度的K⁺、Cu²⁺、Co²⁺和Mn²⁺对2个重组酶有不同程度的促进,但对LACC2的促进作用更为明显;与LACC6相比,LACC2对有机试剂和表面活性剂的耐受力更强,但更容易受到抑制剂的影响;动力学研究发现,LACC2和LACC6的最适底物均为ABTS,K_m值分别为0.13和0.24 mmol/L。研究结果为共培养过程中胶红酵母促进阿魏蘑产...     

谷氨酸棒杆菌硫酯酶基因NCgl1600的异源表达及酶学性质研究

硫酯酶在脂肪酸合成中具有解除脂酰CoA的抑制及提高脂肪酸产量的作用。因谷氨酸棒杆菌具有脂肪酸合成潜力,故文章以具有脂酰CoA硫酯酶活性的基因NCgl1600作为研究对象,通过异源表达基因NCgl1600获得其表达产物硫酯酶TesB并研究其酶学性质。通过测定底物特异性发现其对C8脂肪酰基CoA底物活性最高,最适温度为30℃,最适pH值为8.0,金属离子Fe²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺和K⁺对其酶活产生抑制作用,米氏常数K_m为56.81 mmol/L。     

氨基甲酸乙酯水解酶异源表达及酶学性质分析

将合成的来源于长孢洛德酵母菌（Lodderomyces elongisporus）属的氨基甲酸乙酯水解酶基因在大肠杆菌中实现异源表达,并进行纯化及其酶学性质研究。摇床培养后酶的比活力为4.52 U/mg,经过镍离子亲和层析柱纯化至显示单一条带后酶的比活力为9.86U/mg。酶学性质研究表明,氨基甲酸乙酯水解酶的最适反应温度为30℃;最适pH值为7.0;金属离子Mg2+对该水解酶的酶活有微弱的促进作用,而Cu2+以及Fe3+对酶的活性有强烈的抑制作用;对低含量的乙醇溶液与NaCl溶液有一定的耐受性;并且该水解酶可以对不同底物的酰胺类化合物进行有效降解,以氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate,EC）为底物进行反应时测得水解酶的动力学参数Km值为6.64 mmol/L,最大反应速率Vmax值为8.24 μmol/min。     

碱性果胶酯裂解酶的异源表达与性质研究

目的:异源表达、纯化特异性降解高甲酯化果胶的碱性果胶酯裂解酶,研究其酶学性质。方法:采用PCR方法从枯草芽孢杆菌7-3-3中扩增到编码碱性果胶酯裂解酶的结构基因pel B,将去信号肽基因序列连接甲醇诱导型质粒p PIC9K,得到重组质粒p PIC9K-pel B,并转入毕赤酵母GS115进行表达,对该表达产物进行酶学性质分析。结果:纯化得到Pel B及其糖基化蛋白,糖基化不影响Pel B的酶活力。该酶可降解甲酯化程度为85%的果胶,比酶活达2 746 U/mg。在最适反应温度60℃,最适反应p H 9.0,45~65℃和p H 8.5~9.5范围具较高的酶活力。在40℃以下,p H 7.0~10.6的碱性范围,酶具有较高的稳定性。结论:Pel B蛋白对高度甲酯化的果胶底物具有高解聚能力,在碱性条件下稳定,提示其具有良好的应用价值。     

长双歧杆菌蔗糖磷酸化酶的异源表达及其酶学性质

为挖掘来源于长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶（Bifidobacterium longum sucrose phosphorylase,BloSPase）合成2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸（2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid,AA-2G）的潜力,该研究将BloSPase基因在大肠杆菌中异源表达,以BloSPase的水解酶活力为指标,通过单因素试验和响应面法对其表达条件进行优化;并通过镍柱纯化后对其转糖基化活力进行研究。结果表明,BloSPase的最佳表达条件为诱导时间10 h、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG）浓度0.47 mmol/L、诱导温度23℃。在该条件下,水解酶活力可达到（730.35±0.58）U/mL,比酶活达到（95.22±2.45）U/mg。酶学性质研究显示,BloSPase转糖基化活力的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为5.2,在40、50℃时表现出较强的热稳定性。其动力学参数Km值为（266.80±23.76）mmol/L,Vmax值为（0.235 0...     

古生菌来源耐热肌氨酸氧化酶的异源表达及酶学性质

由于目前大部分肌氨酸氧化酶(sacrosine oxidase, SOX)热稳定性差、失活机理研究不深入,使其在医疗和食品工业等领域的实际应用中受限。该研究通过筛选与挖掘一种热稳定性优异的肌氨酸氧化酶,以达到拓宽其应用前景与应用潜力的目的。根据预测,将来源于古生菌Archaea HR32中肌氨酸氧化酶在Bacillus subtilis WB600中异源表达,并对其酶学性质进行考察。重组蛋白rSOX大小约为42 kDa,二级结构由35.0%α-螺旋、11.1%β-折叠、23.3%β-转角及31.6%无规则卷曲组成,T_m和ΔH为92.13℃和1 070 kJ/mol。以肌氨酸为底物时,最适pH为8.0,最适温度为70℃,80℃下半衰期为12 h,K_m、k_cat和k_cat/K_m分别为1.17 mmol/L、74.59 min^-1、63.78 L/(mmol·min)。常见有机溶剂对rSOX活性影响不大,金属离子则对rSOX有不同程度的促进或抑制作用。另外,rS...     

重组葡萄糖脱氢酶酶学性质研究

葡萄糖脱氢酶可用于高纯度低聚果糖和葡萄糖酸钙的生产，一种重组葡萄糖脱氢酶表达、纯化后，对该酶酶学性质进行了研究。最适反应pH值8．4，最适反应温度37℃，在温度低于45℃条件下，酶活力稳定性好。在最适温度和pH条件下，以葡萄糖为底物时葡萄糖脱氢酶的米氏常数Km=20．09mmol／L，以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）为底物时的米氏常数Km=0．10mmol／L。     

乳酸乳球菌谷氨酸脱羧酶B重组质粒的构建、异源表达及酶学性质的研究

目的：旨在研究乳酸菌谷氨酸脱羧酶B(Decarboxylation of glutamic acid,gadB)的异源表达及其酶学性质。方法：以Lactocus lactis subsp. lactis Il1403的gadB基因序列为目的基因,实现gadB在大肠杆菌中的异源表达,探究其酶学性质,实现高效催化合成γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA)。结果：重组菌经IPTG诱导gadB过量表达后,进一步采用Ni²⁺亲和层析纯化gadB,经SDS-PAGE分析,在54 ku处出现明显条带,经检测可溶性蛋白含量约占70%。对酶学性质进行研究,gadB的最适pH值为4.8,最适反应温度为40℃,Na⁺和Mn²⁺限制gadB的酶活力,而Mg²⁺和Zn²⁺明显刺激酶活。对酶底物浓度进行研究,谷氨酸脱羧酶B的K_m为123.83 mmol,V_max为0.79 mmol/min。结论：该研究探索了gadB的酶学性质,为基因工...     

Vibrio natriegens几丁质酶基因的异源表达及酶学性质研究

几丁质是自然界中除纤维素外第二多的多糖聚合物,在几丁质酶的作用下生成的几丁寡糖具有较好的生物活性及应用价值.通过分子生物学手段获得高活性重组几丁质酶,有利于实现虾壳等几丁质资源的高值化利用.对来源于Vibrio natriegens中的几丁质酶基因进行克隆及诱导表达,获得重组几丁质酶VnChit4,然后通过亲和层析对该...     

大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质

以大肠杆菌基因组DNA为模板,扩增得到苹果酸脱氢酶(mdh)编码基因mdh,构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了mdh,大小约36 000。选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶(mdh),纯化后比酶活达到112.5 U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适pH值为6.0,在pH值2.0~6.0范围内稳定;反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好。K+对酶有明显的激活作用,Cu2+对酶有抑制作用,Hg2+和Zn2+对酶有很强的抑制作用。醇类对酶的活力影响不大,丙三醇可显著提高酶的热稳定性。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L,Vmax为0.47μmol/(L.min)。     

白丝北里孢菌L-谷氨酸氧化酶的异源表达及酶学性质分析

为实现从L-谷氨酸到α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid,α-KG）的高效生物转化,将来源于白丝北里孢菌（Kitasatospora setae KM-6054）的L-谷氨酸氧化酶（L-glutamate oxidase,LGOX）在大肠杆菌（Escherichia coli）中实现异源表达,并研究其酶学特性。根据LGOX的氨基酸序列和大肠杆菌系统偏好性合成LGOX全基因序列,并通过pET28a（＋）/DE3系统在大肠杆菌中实现了功能表达。诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）终浓度为0.1?mmol/L,20?℃诱导18?h,重组大肠杆菌粗酶液酶活力可达49.10?U/mL。亲和层析获得酶比活力为45.98?U/mg纯酶,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳条带显示蛋白分子质量大小约为70?kDa。酶学性质研究表明：其最适反应温度和pH值分别为40?℃和6.0;Km值为1.23?mmol/L,Vmax值为76.24?μmol/（min·mg）,L-谷氨酸为该酶的最适底物。本研究确定了LGOX在E.?coli?BL21中的异源表达及酶学特性,为生物转化合成α-KG提供了新的参考途径。     

茶树单宁酶的原核表达及酶学性质表征

基于大肠杆菌的密码子偏好性,对茶树单宁酶基因CsTanA碱基进行优化,基因优化后GC含量为51.9%,密码子适应指数为0.8,优化前后基因序列的一致性为77.8%,以pET-30a为表达载体对优化基因进行重组表达及酶学性质分析。A600 nm约0.6的重组菌株以1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷在30 ℃诱导12 h,破碎上清液重组单宁酶rCsTanA比活力为0.35 U/mg,镍柱纯化后的rCsTanA比活力为1.53 U/mg,纯化倍数约为4.4。纯化重组单宁酶rCsTanA分子质量为39 kDa,其最适温度和最适pH值分别为40 ℃和7.0。不同金属离子浓度对酶活力的影响存在差异,在低浓度（1 mmol/L）条件下,K＋增强了rCsTanA 37.28%的酶活力,而Ag＋、Cu2＋和Fe3＋使该酶活力均丧失80%以上;而在高浓度（5 mmol/L）条件下,Cu2＋表现出完全抑制rCsTanA活性的特性。表面活性剂（十二烷基硫酸钠、吐温80和十六烷基三甲基溴化铵）和极性溶剂（甲醇、乙醇、丙三醇、异丙醇及丙酮）对rCsTanA活性具有较强抑制作用。本研究不仅实现了茶树单宁酶的表达和酶学性表征,同时也丰富了单宁酶资源,为植物单宁酶的进一步应用研究提供了必要的理论支撑。     

胃乙醇脱氢酶δδ-ADH的原核表达及酶学性质

为获得人胃乙醇脱氢酶δδ-ADH,根据GeneBank中δδ-ADH的基因序列合成目的基因ADH7,构建重组表达载体pET-32a(+)-ADH7,并转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。获得的阳性转化子经异丙基硫化-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,目的蛋白质以包涵体的形式得到大量表达。用1 mol/L尿素溶解包涵体获得有活性的粗酶液,经HisTrapTM excel亲和层析柱纯化获得目的蛋白质,检测δδ-ADH酶活并对其基本酶学性质进行研究。结果显示,δδ-ADH的活性为2.085 U/mg,Km为28.43 mmol/L,Vmax为316.46μmol/(L·min)。δδ-ADH的最适反应温度为40℃,在30～50℃范围内温浴60 min,相对酶活在47%以上;最适pH为9.0,将δδ-ADH在不同pH(pH 3.0～11.0)的广泛缓冲液中于25℃保温30 min,在pH 6.0～11.0范围内酶活较稳定。pH 5.0时,相对酶活剩余60%;在0、500、1 000、1 500 mmol/L乙醇中37℃温浴30 min,相对酶活分别为65.6%、51.1%、45.4%和44.4%。     

Bacillus sphaericus DS11蛋白酶基因osp在Bacillus subtilis的异源表达及酶学性质研究

将Bacillus sphaericus 2297蛋白酶基因osp在Bacillus subtilis WB800异源表达,并进行纯化和酶学性质研究。以Bacillus sphaericus DS11基因组DNA为模板,扩增osp基因,构建重组质粒pMA0911-His_6-osp,重组质粒转化Bacillus subtilis WB800获得重组表达菌株Bacillus subtilis WB800-pMA0911-His_6-osp。利用镍离子柱亲和层析纯化重组酶至电泳纯。重组酶最适催化温度和pH值分别为40℃和pH 8.0,在20℃～30℃下保温10 h保持80%以上酶活力,在pH 7.0～9.0处理24 h保持60%以上酶活力;Sr~(2+)、K~+、Mg~(2+)对酶活有促进作用,Fe~(3+)、Ba~(2+)、Ca~(2+)对酶活有抑制作用;重组蛋白酶在极性常数为0.8～3.1的有机溶剂中孵育6 d后保持53%以上的酶活力。     

耐热木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

将一种11家族极端耐热木聚糖酶的密码子优化基因Syxyn11克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPIC9K-Syxyn11,将其经SalⅠ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。经G418筛选得到重组工程菌GS115/Syxyn11,用甲醇诱导表达重组木聚糖酶SyXyn11,酶活可达到17.74 U/mL。SDS-PAGE显示,SyXyn11的相对分子质量为31 000。SyXyn11的最适反应温度为85℃,在80℃以下稳定。最适反应pH为6.5,在pH 5.0~7.5范围内稳定。EDTA和大多数金属离子对重组酶的活性影响不大。结果表明Syxyn11成功在P.pastoris GS115中实现表达,而且重组木聚糖酶的耐热性并未改变。     

Thermoanaerobacter sp. X514嗜热脂肪酶LipTX的异源表达与酶学性质研究

本文克隆表达了来源于嗜热细菌Thermoanaerobacter sp.X514的嗜热脂肪酶Lip TX基因(Teth514_0029),利用亲和层析纯化了脂肪酶Lip TX,并详细研究了该脂肪酶的酶学性质。采用PCR技术扩增脂肪酶Lip TX基因,克隆到载体p ET15b中,构建重组载体p ET15b-Lip TX;将重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中并利用IPTG诱导表达目的蛋白,经70℃热处理和Ni-NTA亲和层析两步纯化,得到纯化的重组酶。SDS-PAGE结果表明,脂肪酶Lip TX分子量为28 ku。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度和pH分别为70℃和7.5;通过水解底物特异性和动力学实验,发现LipTX可以水解不同长链酰基(C_8-C_(12))的对硝基苯酚酯底物,对硝基苯酚癸酸酯是该酶最适合底物;同时该酶能够水解链长在C_4到C_(16)范围的三甘油酯底物,其中以甘油三丁酸酯为底物的酶活力最高。该酶对非极性有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮、DMF、DMSO和正己烷和氯仿)和变性剂(SDS、Tween-20和Triton X-100)具有较强的抗性,因此在生物催化和有机化学合成中具有广阔的开发应用前景。     

海洋黄杆菌来源岩藻多糖酶Fcn1的异源表达及酶学性质

为了寻找和挖掘降解岩藻多糖的新型酶,以从海带中筛选获得的一株可以降解岩藻多糖的海洋黄杆菌Flavobacterium sp. RC2-3为研究对象,对其进行了全基因组测序。通过与已报道的岩藻多糖酶氨基酸序列比对,并进行转录组学分析及实时荧光定量PCR验证,挖掘了1个可能的岩藻多糖酶基因,并将其命名为Fcn1。Fcn1基因全长1221bp,编码406个氨基酸,蛋白分子质量约为46.8kDa。通过引物设计、PCR扩增,将Fcn1基因克隆,进一步构建了Fcn1基因异源表达载体Fcn1-pET-28a(+),并将其成功地在大肠杆菌BL21(DE3)表达宿主中进行了诱导表达。所得重组酶Fcn1通过带有His标签的镍柱进行分离纯化,采用铁氰化钾法测定纯化酶酶解岩藻多糖的比酶活(332U/mg),纯化倍数为2.25。酶学性质研究表明,重组酶Fcn1最适反应温度为50℃,最适反应pH值为8.0,在20~30℃和pH值为7.0~8.0时表现出较好的稳定性。结合酶学性质研究结果,确定酶的最适反应条件为30℃,pH值为8.0,并测定了岩藻多糖酶水解反应的动力学参数,K_m为1.17mg/mL,V_max为10.53g·L-1·min-1。该酶降解岩藻多糖的酶活力较高,在岩藻多糖资源的开发领域具有较大应用潜力。     

米根霉乳酸脱氢酶的特性研究

乳酸脱氢酶(LDH)是米根霉发酵生产L-乳酸中催化丙酮酸转化成L-乳酸过程的关键酶。本研究从米根霉As3.819中初步分离出乳酸脱氢酶,并结合发酵条件对其酶学特性进行了研究。结果表明,该乳酸脱氢酶的最适反应pH为7.4,最适催化温度为30～50℃。Mg2+、Ca2+对该酶有激活作用,K+、Zn2+对该酶有抑制作用。以NADH和丙酮酸为底物的米氏常数分别为7.22×10-4mol/L和1.24×10-3mol/L。     

嗜热玫瑰红球菌嗜热脂肪酶的重组表达与酶学性质研究

嗜热脂肪酶能克服常温酶生物学性质不稳定的缺陷,在工业应用中有较大的优势,因而成为最近研究的热点.通过合成嗜热玫瑰红球菌Thermomicrobium roseum DSM 5159中的预测脂肪酶基因,在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,并对该酶进行分离纯化和酶学性质表征.重组脂肪酶的熔融温度Tm和焓变ΔH分别为97...     

黄酒酵母β-苯乙醇合成途径醇脱氢酶I的异源表达及酶学特性

醇脱氢酶 I (Adh1p)是黄酒酵母艾利希途径最后合成β-苯乙醇的一个关键酶。为探究黄酒酵母Adh1p的差异及酶学特性,以工业生产菌株黄酒酵母HJ和模式菌株酿酒酵母S288C的基因组为模板,设计引物PCR扩增醇脱氢酶编码区基因ADH1,构建pET-28a(+)表达质粒,转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,IPTG诱导表达获得Adh1p。通过超声破碎菌体后获取粗酶液,亲和层析纯化后获取纯酶,进而探究酶学特性。以苯乙醛为底物,酶活性测定表明:来自黄酒酵母的Adh1pHJ纯酶的酶活(231.51 U/g) 比来自酿酒酵母的Adh1pS288C (203.48 U/g)高13.79%,且Adh1pHJ的Km值(0.524 μmol/L)小于Adh1pS288C的Km值(0.759 μmol/L),表现为Adh1pHJ与底物的亲和力更大。从kcat/Km值发现Adh1pHJ(0.406 L/(μmol·min))的催化效率更高。Adh1pHJ耐受β-苯乙醇和乙醇的能力较高于Adh1pS288C。本研究结果为Adh1p的结构以及酶学性质分析提供方法和理论依据,同时也对β-苯乙醇工业生产开发提供借鉴。