多腺毛烟草K326品种基因编辑材料的创制与分析

烟草腺毛与烟株抗性和烟叶品质密切相关。为了定向改良烟草腺毛密度、创制多腺毛烟草材料,以烟草品种K326为材料,利用CRISPR-Cas9技术对腺毛发生负向调控基因NtCycB2进行敲除,创制了多腺毛K326定向改良材料HK326(Hairy K326),并分析了NtCycB2基因敲除对烤烟农艺性状和化学成分的影响。结果表明:NtCycB2基因敲除后烟株发育正常,生长旺盛,农艺性状与对照相比无明显变化;烟草叶面腺毛密度显著提高,分泌型腺毛发育完善,物质合成和分泌旺盛,西柏烷二萜化合物含量显著提高;烤后烟叶中性香气成分总量增加,其中,茄酮及新植二烯类成分增幅最为明显。因此,NtCycB2基因的敲除,不仅能够提高烟草的腺毛密度,而且对烟株生长发育和重要香气物质的积累也有促进作用,在烟草品种改良中具有较大的应用潜力。     

NtCycB2和NtJAZ1共敲除对烟草腺毛密度和烟碱含量的影响

为了提高烟草的腺毛密度、腺毛分泌物和烟碱含量,从而改善烟株抗性和烟叶品质,以NtCycB2突变的多腺毛K326突变株系（hairy K326）为材料,采用CRISPR/Cas9技术对NtJAZ1进行基因编辑,筛选出NtCycB2与NtJAZ1基因共敲除的纯合株系J-21,并以K326和hairy K326为对照,对J-21的农艺性状、腺毛发育、烟碱生物合成和烟叶化学成分进行了研究。结果表明,J-21植株生长发育正常,主要农艺性状与K326和hairy K326无显著差异,其叶片腺毛密度比hairy K326有所降低,但比K326显著提高,腺毛分泌物含量（质量分数）提高156.35%。J-21叶片烟碱含量在现蕾期比K326和hairy K326显著提高,在烟株打顶后提高幅度明显降低,成熟期叶片烟碱含量比K326和hairy K326分别提高37.14%和32.28%。J-21烤后烟叶化学成分协调,烟碱含量比K326和hairy K326分别提高39.81%和45.32%,西柏烷类降解产物茄酮含量比K326和hairy K326分别提高217.49%和48.45%。表明NtCycB2和Nt...     

NtCycB2基因表达对烟草腺毛发生的影响

烟草腺毛是烟草表皮细胞的特化结构,对烟株抗性及烟叶品质具有重要影响。为探索烟草腺毛密度的分子调控途径,本文对烟草B型细胞周期蛋白基因NtCycB2进行了同源克隆和生物信息学分析,并对其表达特性和生物学功能进行研究。结果表明该基因包含333bp的编码区,编码110个氨基酸,该序列在栽培烟草不同类型、不同品种间高度保守,但与SlCycB2和AtCycB2同源性分别为71.05%和52.38%。RT-PCR分析表明NtCycB2在叶面腺毛和花中的表达水平较高,并受到盐、温度、MeJA等逆境信号的诱导;分别利用基因过表达和基因编辑技术获得了NtCycB2过量表达和敲除株系;植株腺毛形态学观察发现NtCycB2过表达植株腺毛密度显著减少,基因敲除植株分泌型腺毛密度显著增加,而非分泌型腺毛变化不大,该研究表明NtCycB2对烟草分泌型腺毛发生具有明显的负调控作用,在烟草腺毛密度分子调控和叶面化学定向改良中具有较大潜力。      

NtMYB68基因对烟草苗期紫黄质和脱落酸生物合成及烟株耐旱性的影响研究

  目的  为探究烟草NtMYB68基因在类胡萝卜素和脱落酸合成生物合成中的作用及其对烟株抗旱性的影响。  方法  从烤烟品种K326中同源克隆NtMYB68基因,采用生物信息学分析NtMYB68基因序列特征,利用RT-PCR分析其在烟草不同组织的表达模式。利用基因编辑手段创制NtMYB68敲除材料,并分析NtMYB68基因敲除后对烟株类胡萝卜素合成及抗旱性的影响。  结果  NtMYB68基因有2个拷贝,NtMYB68-1和NtMYB68-2。NtMYB68在烟草根、茎、叶、花中均有表达,NtMYB68-2的表达水平显著高于NtMYB68-1。NtMYB68敲除材料与对照相比,紫黄质合成基因NtZEP显著上调,紫黄质含量显著增加,脱落酸（ABA）合成基因NtNCED5表达量达到对照植株的4倍。干旱胁迫下,敲除材料幼苗与对照相比,叶片萎蔫程度更轻,长势更优,复水处理后生长状态恢复的更好。干旱处理前后,敲除植株中ABA的含量均显著提高。  结论  NtMYB68转录因子能抑制NtZEP和NtNCED5基因表达,敲除该基因可以提高烟叶中紫黄质的积累,促进脱落酸的合成,从而提高烟株抗旱性。      

过表达TaGS1/TaGS2对烟草抗盐能力的影响及其机制

为了阐明提高谷氨酰胺合成酶（GS）活性是否可以提高烟草的耐盐能力，本试验以烟草栽培品种K326为对照，研究TaGS1/TaGS2转基因烟草抗盐能力及其机制。结果表明，盐胁迫条件下，过表达TaGS1/TaGS2烟草与对照相比，根系较发达，烟株生物量较高，TaGS2转基因烟草尤为显著；转基因烟草的叶绿素含量、气孔导度、净光合速率、GS活性、可溶蛋白含量等碳氮代谢功能均显著优于野生型K326；且转基因株系脯氨酸含量及含水量较高，MDA含量较低，叶片渗透调节能力和质膜保护能力比K326强。研究表明TaGS1/TaGS2的过表达提高了烟草的耐盐能力，其高GS活性是维持碳氮代谢抵抗盐胁迫的生理基础。      

烟草NtCycB2启动子的克隆和组织驱动特性分析

【背景和目的】烟草B型细胞周期蛋白CycB2可以负调控腺毛的发生，为分析烟草Nt CycB2启动子的组织驱动特性。【方法】通过实时定量PCR分析普通烟草NtCycB2-1和Nt CycB2-2两种序列的组织表达差异，克隆NtCycB2-1和NtCycB2-2启动子序列，对其进行进化分析、顺式元件预测和组织驱动特性分析。【结果】（1）烟草NtCycB2-1和NtCycB2-2均为腺毛优势表达基因，NtCycB2-1的表达量显著高于NtCycB2-2;(2)普通烟草中存在两种NtCycB2启动子序列类型（ProNtCycB2-1和ProNtCycB2-2），其中ProNtCycB2-1来自于林烟草，ProNtCycB2-2来自于绒毛烟草，这些CycB2启动子中普遍存在ABRE等激素应答元件，以及MYB-motif、MYC-motif和TC-rich repeats等逆境响应元件；（3）以GUS为报告基因，研究NtCycB2-1和NtCycB2-2两个启动子的组织驱动特性发现，NtCycB2-1和NtCycB2-2启动子均能驱动GUS基因在叶片和茎部腺毛中特异表达，其中NtCycB2-1启动...     

高分泌型K326近等基因系的创制和鉴定

烟草腺毛分泌物含量与烟叶品质和烟株抗性密切相关.本研究以K326为轮回亲本,以高分泌型烟草种质T.I.1068为供体亲本,通过对腺毛形态及腺毛分泌物含量的定向筛选,获得了高分泌型的K326近等基因系(High Secretory K326,HSK326).形态观察发现,HSK326植物学性状与K326基本一致,但叶面腺...     

烤烟Y2001多腺毛改良株系的创制及抗性分析

为进一步提高Y2001腺毛分泌物含量（质量分数），采用EMS诱变方法创制了Y2001腺毛发生负调控基因NtCycB2的突变体，并以Y2001为轮回亲本进行连续回交，获得了多腺毛定向改良株系HY2001。对腺毛观察发现，与中烟100相比HY2001表皮毛总密度增加117%，其中长柄和短柄腺毛密度显著提高，而非分泌型表皮毛密度显著降低；与Y2001相比HY2001表皮毛总密度增加77%，其中长柄和短柄腺毛密度显著提高，非分泌型表皮毛密度也有小幅度提高。叶面化学成分分析表明，HY2001与中烟100、Y2001腺毛分泌物组分相同，但分泌物含量显著提高，其中西柏烷二萜含量分别为中烟100和Y2001的3.03倍和1.98倍，蔗糖酯含量分别为中烟100和Y2001的3.43倍和2.63倍；HY2001中二萜合成相关基因NtCBTS、NtCYP71D16、NtABS及糖酯合成相关基因NtASAT1、NtASAT2表达量也有一定的上调。干旱胁迫试验发现，胁迫处理下HY2001植株及叶片萎蔫程度比Y2001减轻，植株抗氧化能力显著提高；黑胫病抗性试验发现，接种疫霉后，HY2001植株茎基部发病程度弱于...     

烟草腺毛生物反应器材料的创制与性状分析

为提高烟草腺毛分泌物含量（质量分数），以高分泌型种质资源T.I.1068为材料，采用基因编辑技术敲除其腺毛发育负调控基因NtCycB2，获得了纯合突变株系TTB-1(tobacco trichome bioreactor-1)。结果表明：TTB-1植株生长旺盛，发育正常。显微观察发现与烤烟K326不同，TTB-1与T.I.1068表皮毛由腺毛组成，无保护毛；TTB-1腺毛密度比T.I.1068提高53.41%，是K326的7倍；与K326相比，TTB-1腺头更加饱满，罗丹明着色更深。烟株现蕾期中部叶片叶面化学成分检测结果显示，TTB-1与T.I.1068分泌物组分一致，但分泌物含量显著高于T.I.1068，分泌物总量比T.I.1068提高63.11%;TTB-1与K326分泌物组分不同，除西柏烷类二萜和Ⅰ～Ⅱ型蔗糖酯外，还含有赖百当类二萜和Ⅲ～Ⅴ型蔗糖酯，总量是烤烟品种K326的7.95倍。对上中下部成熟叶片进行分批采收和叶面化学成分萃取，浸膏产率分别为烟叶鲜质量的0.61%、0.43%、0.30%，平均每株浸膏产量为8.90 g；在盛花期进行一次性采收，浸膏产率为烟叶鲜质量的0.45...     

低钾胁迫下过表达NtCaM10对烟草生长及钾素吸收的影响

为探究低钾胁迫下过表达NtCaM10基因对烟草生长及钾素吸收的生理与分子调控机制,以野生型烟草K326(WT)及过表达NtCaM10转基因K326为试验材料,设置两个钾水平,5 mmol/L（常钾）、0.15 mmol/L（低钾）,分析低钾胁迫下NtCaM10基因的表达模式及启动子活性,测定相关生理生化指标、钾离子吸收相关基因的相对表达量及各部位钾含量。结果表明,低钾胁迫后NtCaM10基因的相对表达量显著上升、启动子活性被激活。与常钾水平相比,低钾水平下WT和转基因株系的鲜质量及根系长度均显著降低。在低钾水平下,WT生长受抑制的效果更加明显,NtCaM10过表达3个转基因株系的平均鲜质量相比WT显著提高了57.44%,平均根系长度显著提高了35.77%,转基因系中丙二醛的积累显著低于WT,SOD、POD、CAT的活性均显著高于WT,NtCaM10过表达烟草中的NtHAK1、NtHAK5、NtKC1、NtNKT2的平均相对表达量显著上调,增幅分别为56.60%、81.84%、98.08%、638.89%,过表达NtCaM10烟草根部和地上部的平均钾素积累与WT相比显著提高了21.59%...     

低温胁迫下烟苗多酚代谢及其抗氧化能力分析

为了明确在低温胁迫条件下烟苗中多酚物质代谢与抗氧化能力的关系,本研究以烟草K326为材料,对比分析了低温胁迫处理（4℃）和对照处理（25℃）烟苗叶片中多酚物质含量及其代谢酶活性和基因表达水平变化与植物抗氧化酶活性的关系。结果表明,低温胁迫处理后,烟草叶片萎蔫、细胞膜损伤严重,相对电导率升高;总酚含量受低温胁迫影响较小,木质素含量显著增加（p<0.05）;低温处理后,SOD活性显著升高（p<0.05）,CAT活性和总抗氧化能力（T-AOC）均低于对照;PAL、HCT和POD酶活性均升高,PAL、HCT和POD基因表达水平均上调。以上结果表明,低温胁迫促进烟苗多酚代谢中木质素合成,通过提高木质素含量增强细胞壁的保护作用是植物抵御环境胁迫的重要机制。     

PEG模拟干旱胁迫对不同烤烟品种生理特性的影响

以抗旱性不同的烤烟品种中烟14和中烟100为材料,采用不同浓度的聚乙二醇（PEG-6000）模拟不同程度的干旱胁迫,研究不同干旱胁迫程度下不同品种烟叶内丙二醛和脯氨酸含量变化以及对烟叶内保护性酶活性的影响,探究烟草对干旱胁迫的响应机理,为烟草的抗旱筛选提供一定依据。研究结果表明,随着胁迫时间的延长,丙二醛呈现增加的趋势,且相同胁迫时间内,PEG浓度15%处理,叶片中丙二醛含量最高;脯氨酸含量随着胁迫时间的延长不断增加,在相同胁迫时间内,PEG浓度15%处理叶片中脯氨酸含量最高;随着胁迫时间的延长,超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）均呈现先升高后降低的趋势,且在处理1 d时达到最大值,PEG浓度15%处理酶活性最高。通过检测数据证实中烟14的抗旱性较强,各项检测指标用于烟草抗旱性研究具有可靠性。     

高烟碱K326定向改良材料的创制与分析

为了明确NtJAZ1基因对烟碱含量（质量分数）和烟株生长发育及品质的影响,以烤烟品种K326为材料,利用CRISPR/Cas9技术对NtJAZ1基因进行敲除,获得了纯合突变株系NK-9。测序结果表明,NtJAZ1-1在1 587~1 641 bp之间大片段缺失,NtJAZ1-2在1 547~1 548 bp之间缺失了2个碱基,导致翻译提前终止。RT-PCR检测结果表明,NK-9烟碱生物合成关键基因NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT和NtQPT的表达水平显著提高。田间调查发现,NK-9株系生长发育正常,株高、叶数和叶宽显著高于对照K326,但叶长显著低于K326。显微观察表明,NK-9叶面腺毛密度较对照有所降低。对现蕾期、打顶期和成熟期烟碱含量检测发现,NK-9株系中部叶的烟碱含量分别比对照提高33.26%、36.41%和39.28%。烤后烟叶化学成分分析表明,NK-9常规化学成分比例协调,烟碱含量较对照提高44.91%;中性香气成分中新植二烯、类胡萝卜素类降解产物含量明显增加,但棕色化反应产物、苯丙氨酸类降解产物和茄酮含量有所降低。说明敲除NtJAZ1基因能够有效提高烟叶烟碱含量,对腺毛发育和叶面化学成分的积累也有一定影响。      

烟草NtSAP5基因克隆及干旱胁迫下的功能鉴定

为研究烟草对干旱胁迫的响应机制,克隆了烟草中锌指蛋白基因NtSAP5并对其在干旱胁迫下的表达量进行了检测。结果表明,该基因全长CDS序列为474 bp,编码的蛋白中含有保守的锌指蛋白结构域,该基因NtSAP5的表达受干旱胁迫调控,在干旱胁迫下表达量先升高,后缓慢降低。将NtSAP5的CDS序列克隆到植物过表达载体pG2BW7中,并通过叶盘法转入烟草K326中进行干旱胁迫下的功能验证。选取两个独立的转基因株系及非转基因植株进行干旱胁迫处理,过表达NtSAP5的转基因植株比非转基因植株具有较强的抵御干旱胁迫能力。结果表明,烟草NtSPA5响应干旱胁迫,并在干旱胁迫应答中起到作用。      

干旱胁迫下嫁接对烟草抗氧化酶活性、膜脂过氧化及胁迫响应基因表达的影响

为了探讨嫁接烟草响应干旱胁迫的生理和分子机制,以耐旱品种龙江851为砧木,敏感品种金星6007为接穗,得到自嫁接组合JX6007/JX6007和嫁接组合JX6007/LJ851。采用盆栽试验研究了干旱对两种组合的烟草单株生物量、叶片抗氧化酶活性、活性氧以及膜脂过氧化的影响。结果表明:干旱胁迫条件下,JX6007/LJ851烟株的生物量、叶片叶绿素含量(质量分数)以及抗氧化酶活性均不同程度高于JX6007/JX6007,活性氧含量以及膜脂过氧化程度均低于JX6007/JX6007。荧光定量PCR分析显示,嫁接显著提高了胁迫响应基因LEA5、AREB、CDPK2和ERD10C的表达量。因此,以耐旱品种作砧木的嫁接烟株可以通过调节抗氧化酶活性和胁迫响应基因的表达来提高其抗旱性。     

烤烟品种K326和云烟87对镉胁迫的生理响应及抗性差异

水培条件下,研究镉(Cd)胁迫后2个常用烤烟品种(K326和云烟87)对Cd的吸收及Cd在细胞中的分布,比较Cd处理前后烟株的生物质积累、叶绿素含量、根系活力、叶表及根尖微结构的变化.结果表明,外源Cd处理使K326的生物量比对照降低37.7%,云烟87生物量降低76.2%;K326的总叶绿素含量比对照降低64%,云烟87的降低53%;K326根的活跃吸收面积比对照降低33.3%,云烟87的降低13.9%.不加Cd时,2种烟草气孔大小均一,密度相近,Cd处理后,两者的气孔均减小,密度增大.在Cd的影响下,K326品种的细胞直径下降了35%,云烟87的下降不显著.Cd处理使完整饱满的根尖变得皱缩平秃.Cd处理使K326叶表腺毛腺头变小、腺毛变细,尤其腺基部变细更明显;Cd处理使云烟87叶表腺毛发育相对延迟.Cd主要存在于K326和云烟87的根部,分别占总量的82%和89.4%,在叶细胞的5个组分中,以可溶性组分中最高,且K326中Cd的含量高于云烟87.从生物质积累量来看,Cd处理对K326的影响小于对云烟87的影响,两个烟草品种耐受Cd的能力差异较大.     

叶面喷施2,4-表油菜素内酯对烟草抗旱性的影响

为探讨外源2,4-表油菜素内酯（EBR）增强烟草幼苗抗旱能力的作用机理,以不同抗旱性烟草品种豫烟12号和豫烟10号为材料,采用水培法,研究干旱胁迫下叶面喷施外源EBR对烟草幼苗的影响。结果表明,干旱胁迫下,豫烟12号和豫烟10号幼苗生长受到抑制,叶片细胞活性氧和MDA含量增加,叶绿素遭到破坏,光合速率降低。喷施外源EBR能够显著促进干旱胁迫下烟草幼苗的生长和根系发育,叶片抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性提高,O₂^-产生速率和MDA含量降低,同时增加了叶绿素的含量,提高了光合速率。与豫烟12号相比,干旱对豫烟10号的影响较大,而喷施外源EBR均能降低干旱对两品种幼苗的伤害。喷施外源EBR能够促进根系形态发育,提高抗氧化酶活性,降低活性氧积累和膜质过氧化水平,提高光合能力,增强烟草的抗旱能力。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的克隆和功能分析

为进一步明确烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的功能,根据已公布的普通烟草(Nicotiana tabacum)GGPPS1基因编码区序列设计特异性引物,从普通烟草K326中克隆到NtGGPPS1基因。构建荧光表达载体PFF19-Nt GGPPS1-GFP,对NtGGPPS1基因进行亚细胞定位研究。通过荧光定量PCR分析了普通烟草K326在不同激素处理下NtGGPPS1基因的表达量变化。构建NtGGPPS1基因的RNAi载体pHellsgate2-Nt GGPPS1,通过农杆菌浸染烟草K326后获得NtGGPPS1基因显著下调的烟株,检测了烟株中质体色素含量的变化情况。结果表明:Nt GGPPS1融合蛋白基因的绿色荧光分布在烟草BY-2细胞的质体上,表明该基因定位于质体。用茉莉酸甲酯(MeJA)处理烟草后,NtGGPPS1基因的表达量显著升高,而用生长素(IAA)处理后,该基因的表达量下降。与对照相比,在NtGGPPS1基因下调的烟株中其质体色素含量均显著降低,预示NtGGPPS1参与了烟草β-胡萝卜素的生物合成。     

典型烤烟品种腺毛形态及分泌特性比较分析

为探讨烤烟叶面化学特征及其形成机制,本文以K326、红花大金元、中烟100、翠碧1号、豫烟11等代表性烤烟品种为试验材料,采用超景深显微技术、GC-MS分析检测技术和荧光定量PCR技术,对叶面腺毛形态、叶面化学成分以及腺毛分泌物合成关键基因表达进行了比较分析。结果发现:（1）烤烟腺毛由长柄分泌型腺毛、短柄分泌型腺毛和非分泌保护毛等不同类型组成,翠碧1号和豫烟11中分泌型腺毛含量较高,而中烟100中非分泌型腺毛相对丰富。（2）西柏烷类化合物是烤烟叶面的主要化学成分,以K326中的含量为最高;赖百当类化合物在烤烟中含量极少,但豫烟11中顺冷杉醇和赖百当二醇含量较高。（3）西柏烷类合成酶关键基因CYC和CYP71D16在K326中表达活跃,赖百当合成酶关键基因CPS2在豫烟11中的表达量明显高于其它品种。不同烤烟品种之间叶面腺毛形态、基因表达及分泌物含量所存在的明显差异,可能与品种特色密切相关。      

烟草腺毛优势表达基因NtMYB108b的克隆及分析

为揭示NtMYB108转录因子在烟草中的功能,从栽培烟草K326的叶片腺毛中克隆到1条MYB基因的全长cDNA序列,命名为NtMYB108b。NtMYB108b的开放阅读框为828 bp,编码275个氨基酸。生物信息学预测显示,NtMYB108b蛋白定位于细胞核,属于R2R3-MYB型转录因子S20亚组成员,与绒毛状烟草亲缘关系最近,序列相似性为100.00%。实时荧光定量PCR分析显示,NtMYB108b在烟草腺毛中优势表达;NtMYB108b在团棵期叶片中相对表达量最高,在现蕾期5个叶位中的表达无显著差异。经乙烯利（ET）和水杨酸（SA）处理后,NtMYB108b的表达量显著上调,而经茉莉酸甲酯（MeJA）、赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）处理后其表达量无显著变化;使用聚乙二醇（PEG）处理模拟干旱胁迫,处理2 d后NtMYB108b表达量上调,这说明NtMYB108b的功能可能涉及ET、SA信号转导和干旱胁迫。