乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白基因在昆虫细胞中的表达及…

从乙肝阳性人血清中克隆ＨＢＶ含前ｓ区表面抗原基因，将基插入到杆状病毒转移质粒ＰＶＬ１３９３中，并与昆虫病毒ＡｃＮＰＶＤＮＡ共转染Ｓｆ９昆虫细胞，筛选出重组病毒。用乙肝放免（ＲＩＡ）试剂盒及ＥＩＡＰｒｅＳ２－Ａｇ检测试剂盒检测重组病毒感染的Ｓｒ９细胞，表明细胞中有ＨＢｓＡｇ及ＰｒｅＳ２－Ａｇ存在。将重组病毒感染的细胞免疫小鼠，在小鼠血清中能检测到ａｎｔｉ－ＨＢｓＡｇｅ及ａｎｔｉ－ＰｒｅＳ２抗体。     

利用细菌／杆状病毒系统昆虫细胞中表达HIV—1Gag蛋白

目的 在昆虫细胞中表达中国流行株B亚型HIV－1Gag蛋白，制备重组Gag蛋白。方法 将中国株B亚型HIV－1的Gag全基因序列，克隆到杆状病毒表达载体pfastbacI中，构建了重组质粒pfastGag。经转座及平板筛选，提取重组穿梭质粒Bacmid。经转染Sf9昆虫细胞后，获得了重组杆状病毒。用SDS－PAGE、Westem blot和间接免疫荧光实验分析的目的的蛋白。结果 重组病毒在昆虫细胞Sf9中高效表达了中国株B株型HIV－1Gag蛋白，表达的重组蛋白具有良好的抗原活性，可与HIV－1标准阳性血清及p24单克隆抗体发生较强的免疫反应。结论 重组表达产物可用于艾滋病的免疫诊断和疫苗研究。     

人M-CSF与SCF融合蛋白的构建及其在昆虫细胞中的表达

应用重组DNA技术构建M CSF与SCF的融合基因并将其克隆于昆虫杆状病毒转移载体 pVL13 92中 ,通过与野生型苜蓿夜蛾核型多角体病毒 (AcNPV)DNA共转染草地夜蛾细胞Sf9,融合基因插入AcNPV基因组。重组病毒感染单层Sf9细胞后 ,表达产物分泌到胞外培养液中 ,用MTT比色法和TF 1细胞株可检测到表达产物与IL 3的协同效应。上述研究为开发具有应用价值的新型细胞融合因子奠定了基础     

Sf9昆虫细胞宿主蛋白含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的建立Sf9昆虫细胞宿主蛋白(host cell protein,HCP)含量双抗体夹心ELISA检测方法。方法从Sf9昆虫细胞中提取总蛋白,免疫家兔,制备兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体,经辛酸-硫酸铵沉淀和CL-4B层析柱纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,间接ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性;用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,采用改良过碘酸钠法将HRP酶标记至纯化的抗体上作为酶标抗体,采用方阵滴定法确定双抗体夹心ELISA方法的最适工作条件。确定该方法的最佳线性范围及最低检测限,验证该方法的准确度及精密度。将表达戊型肝炎ORF2基因的重组杆状病毒感染Sf9细胞,收获病毒培养上清,制备3批纯化的重组蛋白,用建立的方法检测纯化过程中HCP含量的变化,验证其在纯化工艺中的适用性。与商品化试剂盒进行比较,检测两种方法的灵敏度及在制品中的适用性。结果纯化后的兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体纯度达90%以上,抗体效价为1∶10 000,可与Sf9细胞蛋白特异性结合。建立的双抗体夹心法ELSA方法最佳抗体包被浓度为20μg/ml,37℃孵育1 h;酶标抗体的工作浓度为1∶200,37℃孵育1 h;TMB室温显色30 min;测定各孔A450值。该方法的最佳线性范围为50~1 600 ng/ml,最低检测为50 ng/ml;不同浓度的Sf9细胞蛋白抗原回收率在87.8%~117%之间,变异系数均小于10%;制备的3批重组蛋白经超滤及层析纯化后,HCP含量均逐渐降低至小于50 ng/ml,纯化工艺可有效去除HCP;与商品化试剂盒比较,该方法更适用于检测戊肝类病毒颗粒样品。结论已成功建立Sf9昆虫细胞残余蛋白含量检测的双抗体夹心法ELSA方法,可用于检测Sf9昆虫细胞/杆状病毒表达系统纯化的重组蛋白中HCP含量。     

截短型人乳头瘤病毒58型L1蛋白在昆虫细胞中的表达

目的利用昆虫细胞杆状病毒表达系统构建含截短型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)58型主要衣壳蛋白L1基因的重组杆状病毒,并在Sf9细胞中表达。方法从NCBI中获得HPV 58 L1基因序列,应用Clustal X2软件进行序列比对后,确定相对保守的目的基因序列;人工合成HPV 58 L1基因片段,PCR法获得截短型HPV58 L1-1基因,克隆至p Fast Bac-1载体中,构建重组供体质粒p FB-HPV 58 L1-1,转化大肠埃希菌DH10Bac,构建重组Bacmid-HPV 58 L1-1,转染Sf9细胞,获得第1代(P1)重组杆状病毒BV-HPV 58 L1-1,扩增后采用快速滴定法测定病毒滴度;将重组杆状病毒感染Sf9细胞,表达HPV 58 L1-1蛋白,并进行Western blot分析和透射电镜观察。结果Bacmid-HPV 58 L1-1经PCR及测序鉴定构建正确;P2重组杆状病毒的滴度可达1.0×108 pfu/ml;HPV 58 L1-1在Sf9昆虫细胞中的表达产物经Western blot检测,可见相对分子质量约55 000的特异性反应条带,电镜观察可见L1蛋白自组装形成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)。结论成功在昆虫细胞中表达了HPV 58 L1-1蛋白,并自组装为VLPs,为预防型HPV疫苗的研究奠定了基础。     

发热伴血小板减少综合征病毒Gn蛋白的表达及其免疫原性

目的 通过9型腺相关病毒（adeno-associated virus 9,AAV9）系统表达发热伴血小板减少综合征病毒（severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV）Gn蛋白,并评价其免疫原性。方法 将SFTSV Gn基因重组至病毒载体pAAV-CMV-FH,将构建的重组质粒转染HEK293T细胞,获得重组病毒AAV9-Gn;免疫荧光和Western blot法鉴定Gn蛋白的表达情况。将18只雌性BALB/c小鼠随机分为Mock组（无血清DMEM）、AAV9-GFP组（1×1011vg）和AAV9-Gn组（1×1011vg）,各组均经小鼠右后肢肌内注射,100μL/只。连续21 d监测各组小鼠体质量、饮食、行为及精神状态,并计算体质量变化率;于免疫后2、4、8、16周,采用荧光灶减少中和试验（fluorescent reduction neutralization test,FRNT）检测各组小鼠血清中SFTSV中和抗体水平,ELISA法检测AAV9-Gn组小鼠血清中特异性IgG1和IgG2a抗体水平。结果 与特异性抗...     

重组人β-神经生长因子在昆虫细胞中的表达、纯化及其生物学活性

目的在昆虫细胞中表达重组人β-神经生长因子(Recombinant humanβnerve growth factor,rhβ-NGF),并对表达产物进行纯化和生物学活性鉴定。方法构建rhβ-NGF杆状病毒表达质粒Bacmid+[rhβ-NGF],利用脂质体cellfectionⅡ将质粒转染至昆虫细胞Sf9中,用转染细胞的上清反复感染Sf9细胞,大量收获含目的蛋白的培养上清,利用离子交换层析和分子筛层析纯化rhβ-NGF,纯化产物经SDS-PAGE和Western blot分析,并通过鸡胚背根神经节培养法检测rhβ-NGF的生物学活性。结果重组表达质粒Bacmid+[rhβ-NGF]经测序证实构建正确;重组病毒感染的Sf9细胞可表达rhβ-NGF;纯化的rhβ-NGF蛋白经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约14 200的单一条带,纯度大于98%,能与兔抗人NGF单克隆抗体特异性结合,并能刺激神经节突起生长,其比活性约为600 000 AU/mg。结论成功在昆虫细胞中表达了有生物学活性的rhβ-NGF,为其大量制备奠定了基础。     

HIV-2型gp105、gag核酸疫苗构建与免疫学研究

目的 构建含 HIV－2 gp 105和 gag基因的核酸疫苗，并评价其免疫效果。方法 将 HIV－2 gp 105型和gag 基因克隆到核酸疫苗载体 pcDNA3．l（＋）中，构建重组核酸疫苗质粒。通过间接免疫荧光试验在细胞水平上检测gp105和ggg基因的表达产物。重组核酸疫苗免疫小鼠后，用流式细胞仪测定CD4+、CD8+淋巴细胞亚类数，用HIV－2抗体ELISA检测试剂盒检测免疫鼠血清中抗HIV－2抗体。结果 构建了3种重组核酸疫苗质粒pcgag、pcgp105和pcgag-gp105-gp105，转染BHK细胞后都能表达外源蛋白，免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖，并诱导产生抗HIV-2特异性抗体，其中pcgag-gp105的免疫效果较pcgag和pcgp105显著。结论 构建的重组核酸疫苗质粒均能诱导机体产生免疫反应，含有融合基因的pcgag-gp105免疫效果最显著。     

人MCIR基因在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统进行人恶性黑色素瘤A375细胞MCIR基因在Sf9昆虫细胞中的表达。方法以pMD18-T-MCIR为模板，利用PCR方法扩增人MCIR基因，将MCIR基因连接到pfastBacl质粒上，与穿梭载体DH10Bac转座，获得Bacmid-MCIR质粒后，通过脂质体介导，转染Sf9细胞，使其表达重组杆状病毒，经SDS-PAGE检测表达产物，放射受体分析法检测目的蛋白MCIR活性。结果Bacmid-MCIR质粒转染Sf9细胞后的SDS-PAGE图谱，在相对分子质量为35000处有一条新生蛋白带。放射受体分析结果显示表达的蛋白与标记配体特异亲和，具有生物学活性。结论MCIR基因成功在真核细胞中得到表达。     

心肌钙蛋白I在杆状病毒表达系统中的表达

目的在杆状病毒表达系统中表达心肌钙蛋白(Icardiac troponin I,cTnI)。方法将带有6×His标签的cTnI基因亚克隆至杆状病毒转移载体pFastBac-dua(lpFBd)中,构建重组转移质粒pFBd-cTnI,转化大肠埃希菌DH10-Bac,筛选获得重组杆粒rbacmid-cTnI,转染昆虫细胞Sf9,SDS-PAGE和Western blot检测转染细胞中cTnI蛋白的表达。结果重组杆粒rbacmid-cTnI经PCR鉴定证明构建正确;重组杆粒rbacmid-cTnI转染的Sf9细胞(Invitrogen细胞株)可表达相对分子质量约25 000的cTnI蛋白条带,表达的cTnI蛋白可被鼠抗His标签单抗和兔抗cTnI多抗特异性识别。结论成功在Sf9细胞中表达了cTnI蛋白,为下一步大规模制备cTnI蛋白以及建立cTnI相关检测方法奠定了基础。     

含IL-2基因的乙型肝炎病毒DNA疫苗的构建及其免疫效果

目的构建含白细胞介素-2(IL-2)基因的乙型肝炎病毒DNA疫苗,并考察免疫效果。方法将微小病毒内部核糖体进入位点(Internal ribosomal entry site,IRES)基因克隆到质粒pVAX1载体多克隆位点处,再将乙肝病毒表面抗原(HB-sAg)基因和IL-2基因分别连接在IRES基因的两侧,构建出乙肝病毒DNA疫苗pHII。将pHII转染COS-7细胞,进行瞬时表达。大量提取质粒后,按0、2、4周程序免疫BALB/c小鼠,以pVAX1质粒为阴性对照,pVAX/HBsAg质粒为阳性对照。第1针免疫1周后开始眼眶采血,检测血清中HBsAg和HBsAb含量。第1针免疫13周后处死小鼠,用流式细胞仪检测其脾脏T细胞表面CD4+、CD8+分子数量。结果在转染pHII质粒的COS-7细胞上清液中检测到HBsAg和IL-2的表达。实验组和阳性对照组小鼠分别于第1针免疫2、4周后,在血清中检测出HBsAb,但阴性对照组未测出。以上3组均未检测出HBsAg。实验组与阳性对照组相比,产生抗体的时间提前2周,抗体阳转率提高2.5倍,产生抗体的量也提高了近3倍。实验组CD4+分子数量和CD4+/CD8+值均高于阳性对照组。结论乙肝病毒DNA疫苗pHII成功诱导出小鼠的免疫应答,其免疫效果明显优于不含分子佐剂的乙肝DNA疫苗。     

HBsAg缺失型乙型肝炎病毒复制细胞模型的建立及其对乙型肝炎病毒复制的影响

目的体外构建HBsAg缺失型乙型肝炎病毒(HBV)复制细胞模型,并探讨HBsAg对HBV复制的影响。方法定点突变pch9质粒上HBV 1.1倍体基因S蛋白表达区,构建HBV1.1倍体HBsAg突变质粒,并进行测序鉴定;将鉴定正确的突变质粒瞬时转染HepG2细胞,设未突变pch9质粒转染细胞作为对照,采用ELISA法检测转染72 h的细胞培养上清中HBsAg的表达;Southern blot及Real-time PCR法检测转染72 h的细胞内HBV DNA的复制水平。结果定点突变质粒经测序证实构建正确;突变质粒转染72 h的细胞培养上清中HBsAg A450值为(0.06±0.003),表达呈阴性,对照细胞A450值为(1.82±0.010),表达呈阳性,转染突变质粒72 h的细胞内HBV DNA条带浓度明显高于转染未突变质粒的细胞;转染突变质粒的细胞内HBV DNA绝对拷贝数分别为9.33×106、5.26×106,约为转染未突变质粒(6.91×105)的7.6～13.5倍。结论已成功构建了HBsAg缺失型HBV复制细胞模型,为HBV DNA复制及相关研究提供了实验依据;推测HBsAg是HBV DNA形成的自限性因素,能够负调控HBVDNA复制。     

应用载体介导的RNAi技术抑制HBsAg在重组CHO细胞中的表达

目的应用载体介导的RNA干扰技术,特异地干扰重组CHO细胞中乙型肝炎病毒s基因的表达。方法设计两段靶向HBV s基因的特异性siRNA,合成两对64nt寡核苷酸,插入载体H1启动子下游,构建表达干扰性发夹状RNA(Short hairpin RNA,shRNA)的载体pHs-9和pHs-170,转染重组CHO细胞(该CHO细胞整合了HBV s基因,可稳定表达s抗原),用ELISA法检测HBsAg的表达。结果pHs-9和pHs-170转染重组CHO细胞后24~120h,在细胞培养上清中检测到HBsAg表达降低,抑制率均达到70%左右。结论pHs-9和pHs-170已成功地表达了发夹状siRNA,并抑制了重组CHO细胞中HBsAg的表达。     

抗乙型肝炎病毒表面抗原的IgG全抗体表达载体的构建

目的构建抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的IgG全抗体杆状病毒表达载体。方法用PCR方法扩增抗HBsAg抗体Fab片段的轻链(L)及重链Fd段(VH+CH1)基因片段,将杆状病毒载体pAC-k-Fc与L基因连接,重组为过渡表达载体pAC-k-L-Fc,再与Fd基因连接,构建重组表达载体pAC-HBs-Fc,并进行酶切鉴定及DNA测序分析。确定正确后,转染昆虫细胞sf9,用免疫荧光检测IgG的表达。结果PCR扩增的片段约650bp,与预期值一致。载体pAC-k-L-Fc和pAC-HBs-Fc的酶切片段和DNA序列与预期结果一致。转染sf9细胞呈阳性荧光反应,未转染细胞呈阴性荧光反应。结论已成功构建表达载体pAC-HBs-Fc,为表达抗人HBsAg的IgG全抗体奠定了基础。     

表达乙肝病毒表面抗原人参细胞系统的建立

目的建立乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的人参细胞表达系统。方法构建含有HBsAg基因的植物细胞表达载体质粒pBIBSb。采用农杆菌感染人参细胞的方法,经农杆菌培养、农杆菌与受体细胞共培养、受体细胞的脱菌培养以及转化体细胞的选择培养后,筛选在G418抗生素培养基上正常生长的细胞株。应用ELISA方法检测抗性细胞株的HBsAg表达;提取基因组DNA进行PCR扩增反应。结果质粒pBIBSb的酶切结果正确。经G418抗生素筛选得到8株正常生长的细胞株,其中5株能够表达HBsAg,提取基因组DNA进行PCR扩增反应,得到大小约700 bp的扩增片段。结论获得了整合HBsAg基因,并能够稳定表达HBsAg的人参细胞表达系统。     

H5N1亚型禽流感病毒样颗粒的构建及鉴定

目的构建同时含有禽流感H5N1疫苗株NIBRG-14的血凝素(Hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(Neurami-nidase,NA)及基质蛋白(Matrix protein,M1)3种基因的重组杆状病毒,并研究其表达产物的生物学特性。方法利用RT-PCR法从禽流感H5N1疫苗株NIBRG-14中扩增HA、NA及M1基因片段,并同时亚克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBacDual中,构建重组杆状病毒穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒Bacmid-HA-NA-M1a。Westernblot法和血凝试验检测HA、NA及M1蛋白在Sf9细胞中的表达;表达的重组蛋白经超速离心浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化后,透射电镜观察病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)的形态结构,并通过单向免疫扩散(Single radialimmunodiffusion,SRID)试验检测HA的含量。结果已成功构建了重组杆状病毒,该病毒可同时表达HA、NA及M1蛋白,3种蛋白可自行组装成VLPs,并分泌至细胞培养上清中,血凝效价可达1∶64;重组杆状病毒表达的蛋白形成的VLPs与NIBRG-14标准抗血清形成沉淀环,浓缩及纯化后的重组蛋白HA含量分别为36和27μg/ml;透射电镜观察可见直径约100 nm的典型流感VLPs。结论构建的重组杆状病毒可表达VLPs,为禽流感新型疫苗的研制奠定了基础。     

绿色荧光蛋白融合表达HBsAg基因载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的　构建绿色荧光蛋白融合表达HBsAg基因的载体 ,并检测其在COS 7细胞中的表达。方法　采用PCR获得HBsAg基因 ;利用该基因片段和质粒pEGFP 3.1的HindⅢ /KpnⅠ限制性酶切位点构建融合表达载体pGHBs 3.1;通过脂质体介导的方法将该载体转染到COS 7细胞中 ,用PCR法检测基因转染 ,ELISA检测HBsAg的瞬时表达 ,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达。结果　融合表达载体pGHBs 3.1转染COS 7细胞后 ,在细胞中检测到HBsAg基因片段 ,转染细胞培养上清中检测到HBsAg表达 ,用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达。结论　表达载体pGHBs 3.1在COS 7细胞中获得了表达 ,表达的融合蛋白具有HBsAg和绿色荧光蛋白的双重活性 ,该载体可用绿色荧光蛋白作为报告基因观察HBsAg的表达及定位。     

丙型肝炎病毒中和抗原表位与乙型肝炎病毒S抗原嵌合基因重组真核表达质粒的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)中和抗原表位与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)S抗原嵌合基因真核表达质粒,并在293T细胞中进行表达。方法从含HBV全序列的质粒pHBV中扩增HBV S抗原基因,在HBV S疏水区127和128位氨基酸序列处引入AgeⅠ酶切位点,将HCV E1和E2区保守的线性中和抗原表位及HVR1的模拟表位基因分别插入该位点,获得嵌合HCV中和抗原表位的重组HBV S基因,将该基因克隆至真核表达载体pCI-neo中,构建重组真核表达质粒pCI-HBSE1～4。将4种重组真核表达质粒转染293T细胞,间接免疫荧光和Western blot检测嵌合基因的表达。结果 4种重组真核表达质粒经双酶切证实构建正确;4种重组质粒转染的293T细胞胞浆内可见较强的绿色荧光,Western blot显示,在相对分子质量约27 000处可见蛋白条带。结论成功构建了HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合基因真核表达质粒,其在293T细胞中可有效表达,为进一步制备嵌合HCV中和抗原表位的HBV S抗原VLP,研究中和抗体对HCV假病毒颗粒(HCVpp)和JFH-1 HCV体外培养系统(HCVcc)感染的抑制作用奠定了实验基础。     

利用细菌/杆状病毒系统在昆虫细胞中表达 HIV-1Gag蛋白

目的在昆虫细胞中表达中国流行株 Ｂ亚型 ＨＩＶ－１ Ｇａｇ蛋白,制备重组 Ｇａｇ蛋白。方法将中国 株 Ｂ亚型 ＨＩＶ－１的 Ｇａｇ全基因序列,克隆到杆状病毒表达载体 ｐｆａｓｔｂａｃＩ中,构建了重组质粒 ｐｆａｓｔＧａｇ。经转座及平板 筛选,提取重组穿梭质粒 Ｂａｃｍｉｄ。经转染Ｓｆ９昆虫细胞后,获得了重组杆状病毒。用 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和间接免疫荧光实验分析表达的目的蛋白。结果重组病毒在昆虫细胞 Ｓｆ９中高效表达了中国株 Ｂ亚型 ＨＩＶ－１ Ｇａｇ蛋 白,表达的重组蛋白具有良好的抗原活性,可与ＨＩＶ－１标准阳性血清及ｐ２４单克隆抗体发生较强的免疫反应。结论 重组表达产物可用于艾滋病的免疫诊断和疫苗研究。