抗微囊藻毒素单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定

利用RT-PCR方法从抗微囊藻毒素-LR(MC-LR)单克隆抗体的杂交瘤细胞中扩增出抗体的V_H和V_L基因,构建了抗MC-LR分子的单链抗体(scFv)基因。SDS-PAGE和Western blot分析结果显示,该单链抗体基因在大肠杆菌Origami 2中特异性表达出分子量约为30kD的融合蛋白。通过Ni-NTA金属亲和层析法对可溶性表达产物进行纯化,获得的目的蛋白浓度为0.115mg/mL。ELISA反应结果表明该单链抗体能与MC-LR特异性结合。此研究为制备多价高亲和力抗MC-LR抗体奠定了基础。     

大菱鲆免疫球蛋白M(IgM)单克隆抗体的制备与特性鉴定

应用细胞工程技术研制大菱鲆免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)的单克隆抗体并分析其免疫学特性。小鼠骨髓瘤细胞NS0与经IgM免疫的BALB/C小鼠脾细胞融合,经过反复有限稀释法克隆,筛选获得4株抗大菱鲆IgM的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别为B1D1、D5C2、E1B2和F4A1。经小鼠腹水扩大生产后,单抗效价为1∶1.024×106检测灵敏度为32 ng/mL。Western blot分析表明,获得的单抗与IgM重链区特异性结合。交叉结果显示,单抗与大菱鲆血清呈强阳性反应,与褐牙鲆、红鳍东方鲀、许氏平鲉、六线鱼、鲈鱼均呈微弱阳性反应,而与半滑舌鳎、鲤鱼、鲫鱼、草鱼、鳙鱼的血清无交叉反应。本研究制备的大菱鲆IgM单克隆抗体效价高、灵敏度高、特异性强,适合用于大菱鲆免疫学相关研究和生产实际应用。     

重金属汞单克隆抗体的制备及鉴定

通过双功能螯合剂(异硫氰基.苯甲基-乙二胺四乙酸,ITCBE)使汞离子与载体蛋白(匙孔血蓝蛋白,KLH)偶联,获得了免疫抗原KLH-ITCBE-Hg(Ⅱ).以该抗原免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞用EIJSA方法筛选及有限稀释法亚克隆化,获得了5株可稳定分泌抗汞单克隆抗体的杂交瘤细胞株(E/H9、E/B2、1/F11、1/H7和B/B11).杂交瘤细胞染色体数目在97-104之间,所分泌的抗体均为IgM、k型,其中杂交瘤细胞株E/H9、1/F11和B/B11细胞培养上清液效价分别达1:640、1:320、1:160,腹水效价分别达1:6400、1:3200、1:6400.B/B11的亲和常数为2.981×108L/mol,特异性试验表明:B/B11与其它金属离子的交叉反应率均小于2%,具有较高的特异性.高亲合力和高特异性的抗汞单克隆抗体在该研究中的成功制备,为建立农产品和环境中重金属汞的快速免疫检测方法奠定了基础.     

HIV-1核心蛋白的表达与纯化

将编码人I型免疫缺陷病毒(HIV1)核心蛋白p24gag的基因序列克隆到原核表达载体pET28(b)中,高效表达了N,C端融合His·Tagp24蛋白,所表达的重组p24蛋白占菌体总蛋白的46%。在变性条件下,使用NiNTA亲和层析法纯化了p24蛋白,纯度为94%。菌体中及纯化、复性后的目的蛋白均能与抗HIV1p24单克隆抗体发生特异性反应。用纯化的p24蛋白免疫小鼠,4周时小鼠血清抗p24抗体效价达1∶400。实验结果表明:大肠杆菌表达的HIV1p24蛋白纯化后可用作HIV1检测试剂的原料。     

铜绿微囊藻生物钟蛋白的表达纯化与抗体制备

为了获得融合表达的铜绿微囊藻(Microcystic aeruginosa)生物钟蛋白KaiA、KaiB、KaiC并制备其相应的多克隆抗体,将kaiA、kaiB、kaiC基因分别克隆到原核表达质粒pET-His中.重组质粒pET-His-KaiA,pET-His-KaiB和pET-His-KaiC经酶切和测序鉴定后,分别转化E.coli BL21(DE3)进行融合表达.经SDS-PAGE分析可知,融合表达的KaiA、KaiB和KaiC蛋白表达量可分别达到菌体总蛋白的25%、40%和20%.经亲和层析后融合蛋白KaiA和KaiB的纯度分别达95%和92%,而KaiC经胶回收纯化后纯度也可达93%.将纯化后的三种Kai蛋白作为抗原分别免疫小鼠制备多克隆抗体,经ELISA检测抗体滴度表明,制备的抗KaiA、抗KaiB和抗KaiC的多克隆抗体效价高,分别可达到1:50000、1:60000和1:100000.Western blotting结果表明:获得的多克隆抗体具有较高的效价,抗体能识别相应的Kai蛋白,具有较高的特异性,能用于铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiA、KaiB和KaiC的表达节律检测.     

苏丹红Ⅰ号多克隆抗体的制备与特异性鉴定

采用琥珀酸酐法,分别以BSA、OVA为载体蛋白合成了免疫抗原和包被抗原并通过SDS-PAGE凝胶电泳和紫外扫描法鉴定了合成的抗原为载体蛋白和苏丹红I号的复合物.将合成的免疫抗原用弗氏佐剂乳化后免疫新西兰大白兔,制备出多克隆抗体,经辛酸纯化,间接ELISA法测得有高效价血清抗体;进一步采用琼脂双扩散试验和免疫金试纸法鉴定出血清中含有苏丹红Ⅰ号特异性抗体.     

鲆鲽类主要病原菌抗血清的制备及应用

用甲醛灭活8种鲆鲽类主要病原菌,鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)、鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri),制备成灭活疫苗后肌肉注射大菱鲆获得各病原菌抗血清。结果显示,抗鳗弧菌血清、抗哈维弧菌血清、抗豚鼠气单胞菌血清、抗鮰爱德华菌效价为1:6 400,抗创伤弧菌血清、抗溶藻弧菌血清、抗嗜水气单胞菌血清效价为1:12 800,抗迟缓爱德华菌血清效价为1:102 400。应用ELISA分析各抗血清与8种病原菌及迟缓爱德华菌蛋白的免疫交叉反应,结果显示,各病原菌与其本身的抗血清反应最为强烈,而与其他抗血清间有程度不等的交叉反应;菌蛋白与其相应的菌抗血清反应最为强烈,与其他病原菌抗血清反应较弱。本研究所制备的病原菌抗血清效价较高,且具有特异性,可应用于鲆鲽类病原菌的检测。     

吸血蝙蝠纤溶酶原激活剂α2的原核表达及抗体制备

利用人工合成的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂α2(DSPAα2)基因,研究了其在细菌中的表达及表达产物的纯化和抗体制备.首先人工合成DSPAα2基因,并构建原核表达载体转化大肠杆菌.经IPTG诱导后,DSPAα2在细菌中得到了高效表达.SDS-PAGE结果显示,以包涵体的形式存在的DSPAα2重组蛋白占到细菌总蛋白的32%.包涵体裂解后经亲合层析柱纯化,100mL菌液中能得到2.2mg纯的重组蛋白.用纯化的DSPAα2分别免疫大鼠和小鼠,经ELISA检测,获得了效价达到1∶12800以上的高质量的抗血清.Western blot结果显示抗体能与DSPAα2特异性地结合.     

小鼠对HIV-2嵌合结构基因重组鸡痘病毒的免疫反应

将HIV-2嵌合结构基因gag-gp105插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游,构建出鸡痘病毒重组转移质粒pA-gg;经转染和BrdU加压筛选,以基因组PCR和Western blot法鉴定重组病毒;将获得的重组病毒大量制备并纯化后,肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清HIV-2抗体,流式细胞仪测定CD4 、CD8 T淋巴细胞亚类数量,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾特异性CTL杀伤活性.结果表明,成功筛选出一株可稳定表达HIV-2嵌合蛋白Gag-gp105的重组鸡痘病毒rFPV-gg;该重组病毒免疫组小鼠的血清出现HIV-2抗体,脾T细胞亚类数量增加,并产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性.本研究提示,HIV-2 gag-gp105重组病毒能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答.     

拟除虫菊酯类农药单克隆抗体的制备及鉴定

以间苯氧基苯甲酸(PBA)为半抗原,与牛血清白蛋白(BSA)偶联后作为抗原,免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,使用PBA与鸡卵清白蛋白(OVA)偶联物作为包被物,间接ELISA法筛选到4株特异性针对PBA的杂交瘤。其中两株细胞2F7和7B1制备腹水并用ProteinG柱纯化抗体,抗体效价均达到1:625000。单抗7B1用于间接竞争ELISA法,PBA检测下限为0.025μg·mL-1,IC50为0.57μg·mL-1,对溴氰菊酯、甲体氯氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯均有特异性识别,IC50分别为0.79μg·mL-1、0.74μg·mL-1、0.63μg·mL-1、0.8μg·mL-1,对联苯菊酯识别弱,IC50为99.7μg·mL-1。该单抗可用于多种菊酯类农药的检测。     

坛紫菜别藻蓝蛋白的纯化及多克隆抗体的制备

通过液氮研磨、超声波破碎、硫酸铵分级沉淀和DEAE-Sephadex-A-50柱层析等手段,建立了从坛紫菜叶状体体细胞中快速高效纯化别藻蓝蛋白的技术,并以该蛋白为抗原,通过动物免疫,制备了抗别藻蓝蛋白的多克隆抗体.电泳及Western印迹杂交分析的结果表明,纯化的别藻蓝蛋白已达到电泳纯,A650/A280达到3.5,计算蛋白回收率为70.5%.制备的多克隆抗体特异性强,效价高达1∶100 000.本研究的结果为进一步研究别藻蓝蛋白的功能和进行开发提供了基础材料和有用的工具.     

基于多重荧光编码技术对TORCH感染的高通量检测

TORCH感染的早期快速诊断在疾病管理中至关重要,有助于提高诊疗效果,降低医疗风险。利用多重荧光编码技术,建立了一种可同时检测弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒特异性抗体IgG的免疫分析法。通过对偶联缓冲液pH值及Goat anti-Human IgG-PE浓度的优化得到最佳检测条件,并对该实验方法的精密度、特异性、剂量-反应曲线及检出限进行性能验证。结果表明,各项目的相对标准偏差（RSD）均小于10%,与多种常见的病原体抗体均无交叉反应,在40 min内能同时完成5个项目的批量检测,且与CLIA方法测试的结果具有良好的相关性。此方法可缩短检验周期、节约检测成本,为临床上快速、灵敏、高通量的TORCH感染筛查提供一种新的途径。     

ELISA的应用现状

ELISA由于其高度的重现性、灵敏度和较短的分析时间所决定其应用的广泛性。ELISA原则上用于检测抗原、抗体及半抗原,在实际应用中可作疾病临床诊断与监察、食品中有害成分残留的测定、与基因工程合并使用等,ELISA的应用具有广阔的发展前景。     

植物抗体基因工程：I．分泌马铃薯Y病毒中和抗体杂交瘤细胞系的筛选

酶联免疫吸附试验证实，Ｄ７３、Ｄ９０和Ａ６９三个杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体均能够与马铃薯Ｙ病毒株系ＰＶＹ￣ｏ、ＰＶＹ￣Ｎ和ＰＶＹ￣ｃ发生反应，但以Ｄ７３的亲和性为最强。进而进行的侵染抑制试验也证实经Ｄ７３单克隆抗体处理后的病毒接种物，其在‘Ａ６’（ＳｏｌａｎｕｍｄｅｍｉｓｓｕｍｘＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）离休叶片引起枯斑的能力显著地受到抑制。因此，选用Ｄ７３杂交瘤细胞系作为分离马铃薯Ｙ病毒中和抗体基因的材料，对其分泌的抗体轻链和重链的亚类进行鉴定，结果发现组成该单克隆抗体分子的轻链和重链分别为Ｋ链（ｋａｐｐａ）和γ＿１链。     

应用间接ELISA技术快速检测花鲈病原菌-鳗弧菌

以花鲈（Lateolabrax japonicus)弧菌病的病原菌－鳗弧菌（Vibrio auguillarum)W-1为抗原,制备兔抗血清;利用辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清（HRP－IgG)为酶标二抗,建立了检测鳗弧菌的间接ELISA快速检测法。结果表明,应用间接ELISA技术检测鳗弧菌有较高的灵敏度,最低的检测量为10^5个／ml,即10^4个／孔。同时交叉反应表明其具有较高的特异性。对46份人工感染后的花鲈组织样品,包括肌肉、鳃、肠、肝、肾等组织的检测表明,阳性检测率为76．1％。     

鲤鱼(Cyprinus Carpio) 促性腺激素基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从鲤鱼脑垂体获得了两种GtH β亚基的cDNA, 克隆在pMD18-T载体.经测序确证后,将这两个基因克隆到原核表达载体pET -32(a)中,转化E.coli表达菌BL21(DE3),以IPTG诱导融合蛋白的高效表达.利用初步纯化后的抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.应用制备的兔抗血清与抽提的鲤鱼脑垂体的总蛋白分别进行Western-blot及ELISA分析,结果显示获得的多抗能特异识别各自的天然蛋白.该结果为纯化天然GtH蛋白提供了有效的检测手段,为进一步制备GtH单克隆抗体奠定了基础.     

三聚氰胺人工抗原及多克隆抗体的制备

采用戊二醛法将三聚氰胺(Melamine,MEL)偶联到牛血清白蛋白(BSA)上合成免疫原三聚氰胺-牛血清白蛋白(MEL-BSA).三聚氰胺甲醛树脂法对三聚氰胺衍生化,再偶联到鸡卵清蛋白(OVA)合成包被原三聚氰胺-鸡卵清蛋白(MEL-OVA).对纯化后的合成抗原进行紫外扫描、红外扫描和SDS-PAGE电泳鉴定.免疫新西兰大白兔,检测抗体的生成.结果表明,免疫兔血清的效价达到了1∶20 000,从而为进一步建立三聚氰胺的免疫检测方法奠定了基础.     

抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备

用本实验室分离纯化的淋巴囊肿病毒(Lymphosystis Disease Virus China,LCDVcn)作为抗原,感染BALB／c小鼠,取被免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2／0融合;ELISA法检测、筛选阳性克隆,经过3次克隆化,首次成功获得18株抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体。     

人工设计的HIV-1重组鸡痘病毒诱导恒河猴产生免疫应答的研究

将人工设计的HIV-1多表位-p24嵌合基因重组鸡痘病毒rFPV-MEGp24大量制备并纯化后,分别在0周、8周、18周肌肉注射至实验恒河猴中,在第2次免疫后2周和第3次免疫后2周采集血液,分离血清和外周血淋巴细胞(PBMC),ELISA法检测血清HIV-1抗体和PBMC培养上清Th1类细胞因子的含量,MTT法测定PBMC的增殖能力,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测PBMC特异性CTL杀伤活性.结果表明:HIV-1多表位-p24嵌合基因重组鸡痘病毒可刺激恒河猴产生HIV-1特异性抗体;免疫猴的PBMC在HIV-1抗原肽刺激下细胞增殖能力加强,针对HIV-1靶细胞的特异性CTL杀伤活性产生,分泌Th1类细胞因子IFN-γ、IL-2的水平升高.研究提示,HIV-1多表位-p24嵌合基因重组鸡痘病毒能诱导恒河猴产生特异性细胞和体液免疫应答.     

口蹄疫病毒二价DNA疫苗的构建及实验免疫研究

通过PCR方法从本室已构建的克隆载体pGEMT-P1-2A获得O型口蹄疫病毒主要保护性抗原VP1基因,以基因突变获得A型VP1基因。将这两种血清型的VP1基因串联后连接到真核表达载体PVAX1 PCMV启动子下游,构建成口蹄疫二价核酸疫苗pVAX1-OA。经Western blot和IFA检测,目的蛋白在HeLa细胞中获得正确表达。动物实验表明,免疫小鼠T淋巴细胞明显增殖,特异性CTL杀伤活性较对照组显著提高;血清抗体能分别与O型和A型抗原反应,抗体效价均高于空白对照组,但较灭活苗低。