利迪链霉菌转运蛋白基因片段的克隆

转运蛋白在调控基因的作用下,完成将包括大分子量蛋白在内的多种物质跨膜转运的过程,在细胞的生理过程中起到重要的作用。将获得的利迪链霉菌的转运蛋白基因与其他放线菌的转运蛋白基因进行了同源性分析,探讨了基因的进化关系。     

褐黄孢链霉菌双亲灭活原生质体融合的研究

考察了双亲灭活条件、聚乙二醇(PEG)相对分子质量、PEG浓度、融合时间、融合温度及无机离子浓度对褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)SG-2002-1和SG-2002-2原生质体融合率的影响.分别采用紫外灭活和热灭活法,灭活条件为紫外灭活2 min,热灭活为60℃水浴1 h.原生质体融合最佳条件为:50%的PEG6000,融合温度25℃,融合时间为8 min,CaCl2浓度为0.05 mol/L,MgCl2浓度为0.02 mol/L,在此条件下融合率可达5.0%.     

褐黄孢链霉菌纳他霉素发酵条件优化

采用Plackett-Burman设计(Plackett-Burman Design,P-B)对影响褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus) ATCC 13326纳他霉素发酵的相关因素进行了评价,所选取的15个因素为可溶性淀粉、葡萄糖、黄豆饼粉、酵母抽提物、蛋白胨、牛肉膏、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NaCl、CaCO3、种龄、接种量、装液量、初始pH值和发酵温度.在此基础上用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,再利用中心旋转组合设计及响应面分析对影响纳他霉素产量的关键因素初始pH、发酵温度、KH2PO4、CaCO3、酵母抽提物、蛋白胨和种龄的最佳水平范围作进一步的研究和探讨,通过拟合得到了响应曲面函数,但该函数的驻点是鞍点,因此不具有全局的最大、最小值.最后通过约束优化得到较佳的实验点,在该实验点条件下纳他霉素的产量比基本培养条件下提高了2倍,达到4.5g·L-1.     

脂蛋白相关磷脂酶A2的原核表达及多克隆抗体的制备

目的构建人脂蛋白相关磷脂酶A2(Lipoprotein-associated phospholipase A2,LP-PLA2)基因重组原核表达质粒,表达重组蛋白,制备人LP-PLA2多克隆抗体。方法从分化的THP-1细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增LP-PLA2全长编码基因,插入原核表达载体pCold TF中,构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG低温(15℃)诱导表达,表达的重组蛋白经Ni-Sepharose 6FF亲和层析及DEAE-Sephadex离子交换层析后,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,采用间接ELISA法测定抗血清效价,Western blot法检测多抗的反应原性。结果重组表达质粒pCold TF-LP-PLA2经双酶切及测序证实构建正确;TF-LP-PLA2获得可溶性表达,相对分子质量约为93 000;纯化的重组蛋白纯度可达90%,可与市售兔抗人LP-PLA2抗体反应;制备的抗血清效价达1∶5.12×106以上,反应原性良好。结论已成功原核表达了重组LP-PLA2蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体,为下一步制备单克隆抗体及建立LP-PLA2免疫检测方法奠定了基础。     

螺旋链霉菌的推理选育

以螺旋链霉菌25-1为出发菌株,分别采用紫外线(UV)、Co60射线、甲基磺酸乙酯(EMS)、氯化锂(LiCl)、UV+LiCl、亚硝基胍(NTG)+UV进行诱变筛选,比较各方法的致死率、正变率、最大提高幅度及对传代稳定性的影响,结果发现UV、Co60射线、UV+LiCl 3种方法对螺旋链霉茵的诱变效果较好,化学诱变剂...     

一株梅花鹿粪便链霉菌化学成分的分离与鉴定

对一株梅花鹿粪便链霉菌(Streptomyces sp.)的化学成分进行了分析鉴定。从链霉菌发酵液的95%乙醇提取物中分离得到6个已知化合物,分别鉴定为6-N,N-二甲基腺苷(Ⅰ)、5′-甲硫基腺苷(Ⅱ)、胸腺嘧啶脱氧核苷(Ⅲ)、环-(苯丙氨酸-羟脯氨酸)-二肽(Ⅳ)、吲哚-3-甲酸(Ⅴ)、对羟基苯乙醇(Ⅵ);6个化合物均为首次从该菌株中分离得到。     

秦岭链霉菌发酵产物的抗菌活性

离体试验结果表明:质量浓度为2 000 mg/L时,秦岭链霉菌发酵产物对玉米大斑病菌、小麦根腐病菌菌丝生长抑制率分别为100%、80.39%;对枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为24、23 mm.盆栽试验表明:在6000 mg/L下,对小麦白粉病菌、黄瓜霜霉病菌和番茄灰霉病菌的保护效果分别为76.1%、63.9%和61.1%.治疗效果分别为70.8%、59.7%和66.9%.田问试验结果表明:在10000 mg/L下,小麦白粉病菌、黄瓜霜霉病菌和番茄灰霉病菌防治效果分别为52.73%、64.98%和74.95%.     

链霉菌菌株4903抑菌除草活性的研究

从士样中分离筛选的链霉菌4903菌株的代谢产物同时具有抑菌、除草活性。链霉菌4903对荔枝炭疽病菌（Glomerella cingulata）和荔枝霜疫霉菌（Peronophythora litchii）的抑菌圈透明,抑菌圈直径达到和超过25mm。除草活性生测结果表明：在固体培养条件下,链霉菌4903菌株对小麦（Triticum aestivum）和油菜（Brassica campestris）有强烈的抑制作用,链霉菌4903菌株对小麦苗的抑制率为94%.对油菜根和苗的抑制率分别为97％和83％。     

磷脂酶D的紫外诱变选育及发酵条件的优化

磷脂酶D在催化磷脂酰基交换反应中具有重要的应用价值。本文对产磷脂酶D野生链霉菌株进行紫外诱变,筛选得到一株产酶活力提高42.5%的变异株。通过摇瓶培养,对发酵条件进行探究。确定的最佳培养基组成为：葡萄糖10.0 g/L,牛肉膏和蛋白胨各5.0 g/L,MgSO4?7H2O 1.0 g/L,CaCl2 3.0 g/L,NaCl 2.0 g/L;表面活性剂Tween80对产酶有促进作用,其适宜浓度为0.60 g/L。在上述条件下,摇瓶发酵产酶活力达3.23 U/mL。     

链霉菌FJS31-2 abxR2基因克隆表达及蛋白纯化

利用原核表达系统获得链霉菌FJS31-2 AbxR2重组蛋白,并进行纯化。通过PCR扩增abxR2基因,将扩增产物克隆至pET32a质粒上构建重组质粒pET32a-abxR2;将重组质粒转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)感受态细胞中进行IPTG诱导表达,并通过尿素洗涤方式对AbxR2重组蛋白进行纯化。酶切和测序结果均证实重组质粒pET32a-abxR2构建成功;在菌液OD₆₀₀值为0.6、28℃、110 r·min^-1、1.0 mmol·L^-1 IPTG诱导4 h时,AbxR2重组蛋白的表达效果较好;采用尿素洗涤方式纯化AbxR2重组蛋白,可得到单一特异蛋白条带,效果较好。为研究AbxR2蛋白的结构和功能及提高Zunyimycins产量奠定了基础。     

人CD271基因的克隆及原核表达

目的克隆人CD271基因,并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术从人REH细胞系中扩增CD271基因,将其克隆入pET22b表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行纯化及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET22b/CD271经双酶切鉴定,可见1197bp的目的基因条带。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约75000处可见表达条带。IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白表达量最高。纯化后蛋白纯度为82.5%。Western blot检测表明纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆了人CD271基因,并在大肠杆菌中获得表达。     

An aqueous suspension system for phospholipase D-mediated synthesis of PS without toxic organic solvent

Enzymatic synthesis of PS by phospholipase D (PLD)-mediated transphosphatidylation in an aqueous media was investigated. The purpose of this study was to establish a novel synthetic method where no toxic organic solvents were used. An attempt to react soybean lecithin (simply dispersed in an aqueous buffer) with an aqueous solution of l-serine and PLD was unsuccessful, giving only 20% of PS. By contrast, a suspension of lecithin adsorbed on fine powders such as silica was effectively converted into PS in an aqueous solution of l-serine and PLD. After screening various powders for use as the lecithin adsorbent, calcium sulfate was found to be the best with respect to lecithin conversion. In addition, calcium sulfate did not require prior adsorption of lecithin (i.e., the reaction proceeded effectively simply by adding the powder to an aqueous mixture of lecithin, l-serine, and PLD). With this “aqueous suspension system” of calcium sulfate, up to 180 mg/mL lecithin was completely converted, resulting in more than 80% PS in 24 h. The synthesized PS could easily be recovered from the powder by extracting with a mixture of n-hexane, ethanol, and diluted HCl.     

人Bik基因的克隆、表达与纯化

目的克隆人Bik基因,并进行表达及纯化。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增Bik基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物进行GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到483bp的DNA片段,重组质粒pGEX-6p-1-Bik经酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的重组蛋白占菌体总蛋白的38%,纯化后蛋白纯度达96%。结论已成功克隆并利用原核表达系统表达了人Bik基因,为进一步研究Bik蛋白结构和功能奠定了基础。     

圆红冬孢酵母中ARE基因的克隆与表达水平分析

克隆了圆红冬孢酵母R. toruloides中的ARE基因并对转录水平进行了初步分析. 结果表明,克隆得到的ARE基因的DNA序列共2624 bp,含6个内含子,开放阅读框2028 bp,编码675个氨基酸. 在限氮培养基中培养的R. toruloides酵母细胞中,ARE基因的转录表达水平随培养时间增加而提高,推测在酵母R. toruloides中ARE基因可能与油脂积累有关.     

RsrA-CFP融合蛋白的克隆表达及圆二色性分析

以天蓝色链霉菌M145基因组作模板,扩增σR(sigR)的anti-sigR因子基因rsrA,得到了333 bp基因;以质粒pECFP-N1作模板,扩增青色荧光蛋白基因cfp,得到了744 bp基因.将两个基因融合串联,构建rsrA/cf p/pET-28a(+)融合表达质粒.利用荧光检测技术,确定大肠杆菌BL21 (DE3)在OD600为0.5时,用1 mmol·L-1 IPTG进行诱导能大量表达融合蛋白RsrA-CFP.用镍柱亲和层析分离纯化RsrA-CFP蛋白,并用SDS-PAGE鉴定其分子量为40 kD左右.利用圆二色性初步测定RsrA-CFP蛋白的CD值,经CDNN软件分析得到:螺旋结构占32.2％、平行结构占8.0％、反向平行结构占9.3％、β折叠占16.7％、无规则卷曲占34.4％,为RsrA蛋白的功能研究奠定了基础.     

人血管生成抑制素基因的克隆、表达及纯化

目的 构建携带人血管生成抑制素基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的血管生成抑制素。方法 用PCR法从人纤溶酶原cDNA中扩增出Kringle 1-3基因,克隆入pET21a(+)载体中,在大肠杆菌BL 21中表达,表达产物经亲和层析纯化。结果 所构建的原核表达载体为高效表达系统,所表达的产物经层析纯化后可获得重组人血管生成抑制素。结论 可获得大量纯化人血管生成抑制素,为进一步临床应用奠定基础。     

扩展青霉碱性脂肪酶结构基因的克隆与原核表达

目的克隆并原核表达扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)结构基因。方法提取扩展青霉总RNA,经RT-PCR扩增PEL结构基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-28a-PEL,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式及表达量,包涵体蛋白经变性、复性后,采用NaOH滴定法测定其酶活性。结果经RT-PCR扩增获得约780bp的PEL结构基因;所构建的重组表达质粒pET-28a-PEL经酶切及PCR鉴定正确;目的蛋白的相对分子质量约为28000,以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的10%;发酵液及复性的包涵体蛋白酶活性可达12.44U/ml。结论已成功克隆并原核表达了PEL结构基因,为获得碱性脂肪酶高产基因工程菌株奠定了基础。     

人类博卡病毒结构蛋白基因VP2的克隆与表达

采用PCR方法扩增出人类博卡病毒结构蛋白基因VP2,通过双酶切、连接、转化等方法将VP2基因克隆到原核表达载体pMAL-c2x上,构建重组质粒pMAL-c2x-VP2,通过双酶切检测重组质粒构建成功;用0.8 mmol.L-1IPTG诱导融合蛋白表达,经SDS-PAGE检测、Western Blot分析,证明目的蛋白得到了表达。可为目的蛋白的纯化及结构和功能的研究、相应抗体的制备打下坚实的基础。