重组大肠杆菌合成蛋氨酸的代谢途径优化

L-蛋氨酸(methionine)是一种具有重要生理学功能及应用价值的含硫氨基酸。为了提高蛋氨酸的生物合成,通过敲除蛋氨酸合成的阻遏蛋白基因metJ及苏氨酸合成途径中编码高丝氨酸激酶基因thrB,部分解除了蛋氨酸合成的反馈阻遏,使蛋氨酸积累达到了0.18 g×L~(-1)。根据已知的与蛋氨酸积累有关的功能基因,采用敲除及过表达的技术,从蛋氨酸代谢网络及转运等角度综合优化了蛋氨酸的合成代谢,考察了蛋氨酸合成关键反应、蛋氨酸转运,以及与蛋氨酸合成途径密切相关的苏氨酸合成途径、蛋氨酸循环途径等不同因素对蛋氨酸合成的影响。优化了大肠杆菌蛋氨酸代谢网络途径,强化蛋氨酸向胞外的转运,蛋氨酸产量达到了0.40 g×L~(-1),为进一步提高蛋氨酸合成效率奠定了基础。     

微生物合成2,3-丁二醇的代谢工程

2,3-丁二醇（2,3-BD）是一种重要的微生物代谢产物,广泛应用于食品、医药、化工等多个领域。微生物合成2,3-BD的效率不高一直制约着其生物制造工业化进程,应用代谢工程的理论和方法优化微生物的代谢途径有望解决这一问题。本文全面总结了近年来微生物合成2,3-BD研究过程中的菌株改造和构建技术,包括过表达合成途径中的关键酶编码基因、敲除旁路代谢途径关键酶编码基因、应用辅因子工程手段对天然菌株代谢网络进行重新设计和合理改造,以及利用合成生物学技术在模式菌株中构建全新的代谢途径,实现2,3-BD的高效生物合成。最后,本文对未来的研究方向进行了展望,提出了进一步利用先进的合成生物学方法构建高效细胞工厂的指导性建议。     

微生物合成2,3-丁二醇的代谢工程

2,3-丁二醇(2,3-BD)是一种重要的微生物代谢产物,广泛应用于食品、医药、化工等多个领域。微生物合成2,3-BD的效率不高一直制约着其生物制造工业化进程,应用代谢工程的理论和方法优化微生物的代谢途径有望解决这一问题。本文全面总结了近年来微生物合成2,3-BD研究过程中的菌株改造和构建技术,包括过表达合成途径中的关键酶编码基因、敲除旁路代谢途径关键酶编码基因、应用辅因子工程手段对天然菌株代谢网络进行重新设计和合理改造,以及利用合成生物学技术在模式菌株中构建全新的代谢途径,实现2,3-BD的高效生物合成。最后,本文对未来的研究方向进行了展望,提出了进一步利用先进的合成生物学方法构建高效细胞工厂的指导性建议。     

重组大肠杆菌HW2利用甘油高产1,2-丙二醇的研究

对一株能在厌氧条件下高效代谢甘油的大肠杆菌突变株HW2进行基因工程改造,使其能利用甘油合成1,2-丙二醇。首先,敲除HW2中与丙酮醛脱毒途径相关的三个基因ald A、glo A、hch A和乳酸合成基因ldh A,得到菌株HWAGHL,并在甘油培养基I中厌氧培养。结果显示菌株HWAGHL代谢甘油的能力并没有明显减弱,培养120 h后能产0.013 g?L?1的1,2-丙二醇。在HWAGHL中单独过表达mgs A后,经72 h厌氧培养可得0.04 g?L?1的1,2-丙二醇,在HWAGHL中共表达gld A、dha KL(来自弗氏柠檬杆菌)、mgs A和yqh D(HWAGHL/p TH)后,经72 h厌氧培养可得0.48g?L?1的1,2-丙二醇。在菌株HWAGHL/p TH中过表达gld A和fuc O,1,2-丙二醇产量可分别提高18%和16%。最后,菌株HWAGHL/p TH在甘油培养基II中厌氧培养,72 h可得1.58 g?L?1的1,2-丙二醇,得率为0.20 g?g?1甘油。     

重组大肠杆菌1,2,4-丁三醇合成途径的平衡优化

1,2,4-丁三醇(1,2,4-butantriol,BT)属于非天然化学品,是军工材料1,2,4-丁三醇三硝酸酯的前体。在重组大肠杆菌中,木糖经脱氢、脱水、脱羧和还原合成BT。但途径各反应不平衡使得中间代谢物积累限制菌体生长和产物合成。本研究首先通过CRISPR/Cas9敲除基因yjh G和yqh D构建无本底表达宿主菌,随后利用不同启动子组合调节BT合成途径中基因xdh、yjh G和yqh D的表达。结果发现,以P_inv表达醇脱氢酶基因yqh D使BT产量达到14.4g/L;以P_tac表达脱氢酶基因xdh和P_{rrn HP1}表达脱水酶基因yjh G的组合方式,BT产量达到15.6g/L,比对照菌株KXW3009分别增加5.9%和14.7%。本研究通过对中间代谢物木糖酸合成和代谢的组合优化,促进了BT的合成,为后续研究提供了借鉴。     

基因敲除弱化产1,3-丙二醇Klebsiella pneumoniae荚膜多糖的合成

1,3-丙二醇(1,3-PDO)是重要的平台化合物,在高性能纤维合成等领域具有广泛应用。Klebsiella pneumoniae是优良的1,3-PDO生物合成细胞工厂,但该菌代谢甘油合成1,3-PDO时积累大量荚膜多糖,影响底物与产物的高效转运,导致发酵液黏度增大,限制发酵法生产1,3-丙二醇的下游提取及产业化。本研究基于已报道的K.pneumoniae荚膜合成途径,利用Red重组技术对K.pneumoniae荚膜多糖合成途径中的起始糖基转移酶wec A基因及参与荚膜多糖后期组装的跨膜蛋白wzi基因进行敲除,并考察上述基因缺失对菌株荚膜含量、细胞形态、菌体生长、发酵液黏度及产物合成的影响。研究发现,同时缺失wec A和wzi基因对于弱化荚膜多糖效果显著,荚膜含量降低38.5%,细胞基本丧失菌毛合成及相互粘连能力,1,3-PDO产量提高23.0%,为菌株改造提供了一种新思路。     

酿酒酵母生物转化蛋氨酸生产S-腺苷-L-蛋氨酸

摇瓶考察筛选酿酒酵母（zjus1)培养1d后补加蛋氨酸和葡萄糖生产S－腺苷－L－蛋氨酸（SAM），并考察了酵母提取物，补加蛋氨酸浓度，葡萄糖浓度及转化pH对酵母细胞的生长和SAM产量的影响，15LB.Braun罐间歇培养及转化过程实验表明，溶氧提高利于碳源利用、细胞生长和SAM产量提高，SAM水平可达800mg/L，酵母密度DCW=15g/L，蛋氨酸转化率约30％。     

平衡磷酸烯醇式丙酮酸节点通量强化筑波链霉菌合成他克莫司

他克莫司(FK506)是最重要的免疫抑制剂之一,然而前体代谢供应不足制约着工业化生产。通过优化平衡磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)节点支路通量可提高FK506产量。本文首先在S.tsukubaensis D852中过表达基因fkb O(编码分支酸水合还原酶)和fkb L(编码赖氨酸环化酶)得到S.tsukubaensis-OL1,FK506的产量仅从158.7mg/L提高到163.9mg/L。随后调节PEP节点支路回补途径和莽草酸途径通量强化FK506的合成:先分别将不同菌株中编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)和3-脱氧-D-阿拉伯糖基-heptulosonate-7-磷酸合酶(DAHPS)的基因在S.tsukubaensis-OL1中过表达,FK506的产量分别提高40%(ppc,S.tsukubaensis)和47%(dah P,S.roseosporus);然后采用4个不同强度的组成型启动子(Perm E*,Psco4503,Psco3410 and Psco5768)平衡ppc和dah P的表达水平获得9株工程菌,最终使FK506的产量由163.9mg/L显著提高到350.3mg/L。这个结果说明优化平衡PEP节点竞争支路通量是提高FK506产量的有效策略。     

醛脱氢酶基因敲除对克氏肺炎杆菌合成1，3-丙二醇的影响

利用Klebsiella pneumoniae厌氧发酵甘油生产1,3-丙二醇时，一部分甘油通过氧化代谢途径大量合成副产物乙醇，降低了1,3-丙二醇的得率.醛脱氢酶ALDH是乙醇合成途径的关键酶之一，其催化作用不仅消耗了大量甘油，还将还原型辅酶NADH氧化为NAD⁺，降低了同为NADH依赖型的1,3-PD合成途径的效率.本文以醛脱氢酶ALDH为改造目标，以K.pneumoniae为宿主，通过同源重组技术在K.pneumoniae M5aL的ALDH基因中成功地插入了四环素抗性基因，经抗性筛选和基因水平鉴定，得到两株ALDH基因敲除的重组菌0623-1hb及0623-1hc.本文研究了这两株重组菌的生长代谢特性，结果表明两株重组菌的ALDH酶活基本检测不到，菌体生长受到明显抑制，乙醇合成浓度比出发菌株K.pneumoniae M5aL降低了43%～53%，1,3-PD合成浓度及摩尔得率分别提高了27%～42%和19%～24%.     

肺炎克雷伯氏菌生物合成1,3-丙二醇的副产物调控研究

以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 25955为原始菌株,利用代谢工程手段对K.pneumoniae生物合成1,3-丙二醇(1,3-PD)的副产物进行调控.通过敲除副产物合成途径关键酶编码基因,在分批补料发酵条件下,1,3-PD的产量达到83.8 g·L-1,生产强度提至2.79 g·L-1·h-1;进一步结合乙酸吸收途径强化,有效解除了乙酸溢流现象,在分批补料发酵条件下,1,3-PD的产量达到94.9g·L-1,生产强度提至3.16 g·L-1·h-1.研究表明,通过敲除副产物合成途径关键酶编码基因结合乙酸吸收途径强化能够促进1,3-PD的合成,减少副产物的产生,提高K.pneu-moniae 代谢甘油合成1,3-PD的产量和生产强度.     

Mg~(2+)和氨基酸对重组大肠杆菌BL21(DE3)生长及羧肽酶原B表达的影响

目的研究Mg2+和氨基酸对重组菌株生长及表达pCPB的影响。方法通过摇瓶和发酵罐培养,观察不同Mg2+浓度和氨基酸对重组菌的生长和羧肽酶原B表达的影响。结果添加1g/L Mg2+能提高质粒的稳定性;添加氨基酸能使羧肽酶原B表达量由18·7g/L提高到24g/L。结论添加适量的Mg2+和氨基酸能促进重组菌的生长和提高目的蛋白的表达量。     

人肌红蛋白基因的克隆、表达及其抗体制备

目的克隆、表达人肌红蛋白基因,并制备人肌红蛋白多克隆抗体。方法应用RT-PCR方法从人骨骼肌总RNA中扩增肌红蛋白基因(hMb)编码序列,克隆入原核表达载体pRSETc中,并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达。表达产物经亲和层析和凝胶层析纯化。纯化蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,并用Westernblot检测其特异性。结果测序表明RT-PCR所得的肌红蛋白基因hMb序列与GenBank(NM203377)中报道的序列一致。该基因在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化,获得电泳纯的蛋白。重组人肌红蛋白的表达水平达12.8%。每升发酵液中可获得纯化的目的蛋白6.438mg。Western blot分析表明该蛋白为融合有6个His的hMb蛋白。ELISA法测得抗体效价为1∶12800,Western blot证实其具有较好的特异性。结论已成功克隆人肌红蛋白基因,在大肠杆菌中获得了可溶性表达,并制备了抗人肌红蛋白的多克隆抗体。     

基因工程大肠杆菌合成g-聚谷氨酸

利用PCR方法,从自身不合成g-聚谷氨酸(g-PGA)的Bacillus subtilis 168菌的基因组DNA中扩增出g-PGA合成基因ywsC, ywtA和ywtB,测序并对该基因编码区进行序列分析,比对结果表明,扩增的ywsC, ywtA和ywtB与文献报道的相似度为100%. 将3个基因连接到pTrcHisA载体后转化至E. coli TOP10及E. coli BL21 (DE3)宿主菌表达,结果宿主菌细胞均具备了g-PGA生物合成能力,产量最高达到0.134 g/L.     

重组人白细胞介素-10融合表达载体的构建及其在BL21(DE3)pLysE细菌细胞中的表达

目的　构建重组人白细胞介素 10 (recombinanthumaninterleukin 10 ,rhIL 10 )融合蛋白的表达载体 ,并在大肠杆菌中表达。方法　应用RT PCR方法扩增IL 10基因 ,克隆PCR产物 ,构建PCRR○T7/NT TOPOR○ IL 10重组质粒 ,以AppiedBiosystems 370 0DNA分析仪进行分析。构建成功的重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysE细胞 ,经 12 %SDS PAGE鉴定融合表达蛋白。结果　PCRR○T7/NT TOPOR○ 质粒已载入rhIL 10基因 ,其序列与理论设计完全一致 ,表达质粒在BL2 1(DE3)pLysE中得到高效表达 ,产物主要以包涵体形式存在。结论　已成功构建重组PCRR○T7/NT TOPOR○ IL 10质粒载体 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysE细胞内高效表达     

大肠杆菌GBP的定点突变与制备方法研究

在mglB基因上进行了E149C、 A213S、 L238S三个定点突变,并利用大肠杆菌BL21(DE3)/pET28c系统,构建了表达突变型GBP的基因工程菌BL21(DE3)/pLE3.工程菌经诱导培养后收获细胞,利用渗透休克法提取周质空间蛋白,经Ni-NTA柱纯化,从1 L培养液中可得到约3.5 mg SDS-PAGE纯度的GBP.     

脱硫菌Rhodococcus sp.LY822专一性脱硫活性及相关基因的研究

以专一性脱硫菌Rhodococcus sp. LY822质粒DNA为模板,利用已知的脱硫基因序列设计引物,PCR扩增得到了3个脱硫基因片段dszA, dszB和dszC. 构建了相应的表达质粒pETA, pETB和pETC,在转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达,得到了dszA, dszB和dszC基因的融合表达产物. SDS-PAGE分析结果显示,蛋白带分子量分别为50, 40和45 kDa. 3种重组菌BL21(DE3)(pETA), BL21(DE3)(pETB)和BL21(DE3)(pETC)的无细胞粗提液(2 mL)的活性检测结果表明,DszC酶的粗提液反应30 min能够将0.02 mmol/L二苯并噻吩完全转化为二苯并噻吩砜,DszA酶的粗提液能够将0.01 mmol/L二苯并噻吩砜完全转化为羟基联苯亚磺酸盐,DszA和DszB酶的粗提液联合作用能够将0.01 mmol/L二苯并噻吩砜完全转化为2-羟基联苯,证明LY822对二苯并噻吩的降解符合专一性脱硫的"4S途径".     

组成型天冬氨酸转氨酶基因工程菌的构建与高效表达

天冬氨酸转氨酶AspAT是苯丙酮酸转氨制备L-苯丙氨酸的关键酶. 本研究将大肠杆菌中天冬氨酸转氨酶基因aspC克隆到3种不同质粒中,构建组成型表达质粒pUC/P-aspC, pSE/P-aspC, pET/P-aspC,并分别转化至6种常用的大肠杆菌宿主中. 通过对18种重组子的生长及产酶情况的分析,比较了各种重组子生长压力、质粒稳定性与表达酶活的关系,并经SDS-PAGE电泳分析AspAT的表达量,筛选出高产AspAT的重组子BL21(pET/P-aspC),以该工程菌发酵液直接作为酶液,以天冬氨酸和苯丙酮酸(20 g/L)为底物,发酵液与底物以1:3的体积比转化生成L-苯丙氨酸16.2 g/L,转化率高达80.1%. 该体系表达无需诱导,转化无需添加辅酶PLP,展现了良好的产业化前景.     

重叠PCR技术在构建sodAP基因表达载体中的应用

目的应用重叠PCR技术,构建节杆菌DMDC12的Mn-SOD基因sodAP的重组表达质粒,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法设计两对引物,分别扩增启动子P121和sodAP基因序列,利用重叠PCR技术,将启动子P121与sodAP基因相连接并测序,连接产物插入原核表达质粒pET-22b(+),构建重组质粒pET-PsodAP,转化E.coliBL21(DE3)进行表达。用SDS-PAGE检测表达产物,光密度定量分析法分析目的蛋白表达量。结果启动子P121和sodAP基因的连接产物经凝胶电泳检测,可见约800bp的目的条带,测序结果与预期相符;重组表达质粒pET-PsodAP经双酶切鉴定,表明构建正确;目的蛋白在E.coliBL21(DE3)中获得了表达,表达量占菌体总蛋白的19%。结论应用重叠PCR技术,成功构建了sodAP基因的重组表达质粒,并在E.coliBL21(DE3)中获得表达,为Mn-SOD的进一步工业化生产奠定了基础。     

内源性血管生成抑制因子Arresten基因原核表达条件的优化

目的 优化内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达条件。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,RT-PCR扩增Arresten基因,构建重组表达质粒pBV220-Arr,分别转化感受态E.coli JM109、DH5α、BL21、BL21(DE3),诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物,筛选出最优表达菌种,并对其菌体培养温度和时间、诱导温度和时间及溶解氧量进行优化。结果重组表达质粒pBV220-Arr经酶切及测序证明构建正确,重组表达质粒在E.coli JM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)4种菌中诱导2和4 h,均能表达出Arresten蛋白,诱导表达4 h,E.coli BL21(DE3)目的 蛋白表达量最高,湿菌重也明显大于其他菌种。E.coli BL21(DE3)/pBV220-Arr的最佳表达条件为:在500 ml培养瓶中加入100 ml LB氨苄阳性培养基,菌体于30℃培养4 h后,再42℃诱导表达4 h。结论优化了Arresten基因工程菌的表达条件,为重组Arresten蛋白的大量表达提供了参考。     

硫矿硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的克隆与表达

引言 海藻糖(α-D-葡糖基-[1,1]-α-D葡糖苷)是一种广泛存在于低等植物、藻类、细菌、真菌、酵母、昆虫等的非还原性二糖.在自然界中,海藻糖既是一种贮藏性糖类,又是应激代谢的重要产物,具有保护生物细胞和生物活性物质在脱水、干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境条件下活性免遭破坏的功能.