绵羊EST-SSR分子标记的鉴定及特异性分析

通过SSR Finder软件及MISA技术从NCBI系统中的绵羊表达序列标签(EST)数据库中筛查SSR位点,利用Primer 3.0设计绵羊EST-SSR荧光引物,对宁夏滩羊肉、新疆细毛羊肉和藏绵羊肉进行区分。以3种绵羊的肝脏DNA为模板,对设计的EST-SSR引物进行PCR扩增并使用毛细管电泳检测SSR分型。结果显示,通过EST-SSR标记设计的荧光引物p2105.1:248-559、p2025.1:896-1059和p2104.1:704-1015在宁夏滩羊肉、新疆细毛羊肉和藏绵羊肉中具有良好特异性,可实现3个绵羊品种的区分。通过EST-SSR标记技术可准确判断3个纯种绵羊肉的品种,这对绵羊遗传资源的开发利用、品种鉴别以及丰富分子标记类型具有重要的意义。     

基于高通量测序技术分析3种羊肉混合基因组序列的短片段重复序列

为研究易混淆绵羊品种的种内多态性与遗传多样性,甄别滩羊、小尾寒羊和滩寒杂交羊,采用宏基因组学的方法,以混合羊肉样品(滩羊、小尾寒羊、滩寒杂交羊)为试验对象,通过高通量测序技术对混合样本全基因组进行测序。利用MISA查找拼接序列SSR位点,分析SSR序列特征并使用PRIMER3 Input(version 2.3.7)设计荧光标记引物,以多态性SSR分子标记分析滩羊、小尾寒羊、滩寒杂交羊群体遗传多样性。结果显示,SSR位点分布结果广泛,多态率为46%,平均PIC值为0.358,表明多态性水平处于中等水平。绵羊属3种羊肉以及混合羊肉样本分别聚为一类,呈单系性,STR峰图分型清晰,表明可实现3种绵羊的区分。成功建立了3种绵羊的SSR分子身份证。通过SSR序列多态性可对3种绵羊及其混合样本进行鉴定,为混合绵羊肉的基源鉴定提供新思路和技术指导,对绵羊全基因组工程研究,绵羊种属间的分子标记开发和种质资源鉴定保护具有一定参考价值。     

基于单拷贝核基因的数字PCR定量检测肉制品中羊源性成分

GeneBank搜索牛、绵羊、山羊、猪、马、驴、鸡、鸭、鹅、火鸡、狗、猫、鼠、兔、貂等15种动物的单拷贝核基因组序列信息,应用生物信息学分析筛选15种动物共有的种间保守区域,设计一对可同时扩增15种动物源性DNA的内参基因引物和探针;同时分析筛选绵羊和山羊共有且和其余动物种内特异性区域,设计一对只能扩增羊源性DNA的特异性基因引物和探针。基于微滴数字PCR技术,引入内参基因校正羊种属特异性基因测定方法,建立科学准确的肉制品中羊源性成分量化判定方法。结果表明,所建立方法具有良好的特异性和通用性,内参基因和羊种属特异性基因的最低检出限分别为32和26 copies/μL,模拟添加样品的正确度偏差均值为8.66%,符合数字PCR方法制定指南要求不得大于25%,说明量化判定方法结果具有较高的准确性。     

DNA条形码COI序列在常见肉类鉴别中的应用研究

为了对常见的4种肉类及相关肉制品进行掺假鉴定,判别与产品标签是否相符,本研究以COI基因为靶基因,建立了4种动物源性食品DNA条形码鉴别技术。分别提取牛、羊、猪、鸭四大物种的基因组DNA为模板,以其COI基因的保守序列区设计6对通用引物,结合文献报道及数据库提供的7对通用引物进行PCR扩增,并将测序结果提交Gen Bank数据库Blast比对,评价不同DNA条形码的检测鉴别能力。筛选出COI-A为最优序列,在4个物种中扩增效率100%。对抽检的20个批次的肉加工品样品进行检测,鉴定结果约有90%的样品与产品标签标示的成分相符。其中1个批次的牛丸制品因肉类成分含量低未扩增成功,1个批次的牛丸制品检出鸭源成分,判定掺假。DNA条形码技术快速有效,本研究筛选的COI-A序列可直接用于牛、羊、猪、鸭及其肉制品的鉴定,并为其它常见动物源性食品的种类鉴定提供一定参考依据。     

苏尼特羊、巴美肉羊和乌拉特山羊的肉品质和挥发性风味物质比较

为了探究品种对羊肉品质和风味的影响,选取12月龄苏尼特羊、巴美肉羊和二狼山白绒山羊(乌拉特山羊)各12只,测定其屠宰性能,再分别取股二头肌测定肉品质和挥发性风味物质并进行比较。结果表明:巴美肉羊的胴体质量、背膘厚、a^*值均显著高于苏尼特羊和乌拉特山羊(P<0.05),说明其屠宰性能较好,肉色较红;苏尼特羊的pH显著高于乌拉特山羊(P<0.05),而巴美肉羊与二者之间无明显差别(P>0.05)。品种对挥发性成分的相对含量和构成影响很大,电子鼻测定结果表明苏尼特羊、巴美肉羊和乌拉特山羊的气味存在差异,进一步对比挥发性风味物质发现,苏尼特羊肉中醛、醇及酮类化合物的总相对含量较高。气相色谱-质谱联用检测出乌拉特山羊肉中风味物质较其他两种丰富,通过相对气味活度值(ROAV)筛选出庚醛、辛醛、壬醛、反-2-壬烯醛、1-辛烯-3-醇、反-2-癸烯醛和十二醛可作为三种羊肉共有的关键风味物质,其中壬醛对苏尼特羊肉风味贡献最大,而巴美肉羊和乌拉特山羊肉中贡献最大的风味物质为1-辛烯-3-醇。总体上,巴美肉羊的屠宰性能较优良且肉色略红,在风味方面,不同品种的羊肉其关键风味物质存在差异。     

鉴别绵羊肉中狐狸源性成分的环介导等温扩增检测方法的建立

目的建立一种能够快速区分出绵羊肉中掺入的狐狸源性成分的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。方法针对狐狸线粒体Cox I基因分别设计两条外引物和两条内引物,优化LAMP反应条件后并进行特异性和灵敏性试验,对绵羊肉中狐狸源性成分进行检测。结果在0.2μmol/L外引物(F3和B3)、1.6μmol/L内引物(FIP和BIP)、0.5 mol/L甜菜碱、0.4 mmol/L d NTP、4 mmol/L Mg SO_4等参数的优化条件下,可检测出掺假率为1.0%的羊肉制品,即最低检测浓度为2×10~(-4)ng/μl。结论本文所建立的LAMP法特异性强、灵敏度高,能有效地对绵羊肉中狐狸源性成分进行检测,可作为羊肉掺假的一种快速检测方法。     

内蒙古地区不同养殖草食动物背最长肌氨基酸组成及营养价值评价

以内蒙古地区集约化养殖草食动物牛、绵羊、山羊和驴背最长肌为研究对象,以鸡胸肉为参照,采用全自动氨基酸分析仪内标法检测氨基酸含量,评价肌肉氨基酸组成及营养价值。结果表明：各氨基酸在不同动物肌肉中的含量均呈显著差异（P＜0.05）;鸡胸肉、牛肉和山羊肉总必需氨基酸含量显著高于绵羊肉（P＜0.05）,驴肉与其他肉无显著差异;牛肉和驴肉总非必需氨基酸含量显著高于山羊肉（P＜0.05）,其他肉无显著差异。不同草食动物肌肉必需氨基酸指数（essential amino acid index,EAAI）均高于95,属于优质蛋白质来源,EAAI顺序为山羊肉＞鸡胸肉＞绵羊肉＞牛肉＞驴肉;驴肉甜味氨基酸含量显著高于其他肉（P＜0.05）,牛肉和绵羊肉鲜味氨基酸含量显著高于其他肉（P＜0.05）,鸡胸肉苦味氨基酸含量显著高于其他肉（P＜0.05）,牛肉和绵羊肉总呈味氨基酸含量显著高于其他肉（P＜0.05）;以氨基酸相对含量聚类,绵羊肉和牛肉在图谱中最接近,驴肉处于图谱最远端。     

基于致病基因靶点的PCR法特异性检测土壤青枯菌

利用分子生物学手段,以R.solanacearum染色体上的16S rDNA ITS以及毒性质粒携带的致病性相关基因fliC为靶点,分别设计5对序列特异性引物,筛选得到了特异性扩增16SrDNA ITS保守序列的引物对RaITS-1/2以及特异性扩增病菌fliC基因片段的引物对RalfliC-F/R.比较这两对引物的扩增灵敏度、稳定性和特异性可以发现,它们均能够稳定、快速、灵敏地检测青枯菌DNA,检测灵敏度可以达到10 fg DNA/μL.在此基础上成功构建了直接检测土壤青枯菌DNA的PCR检测技术体系.     

基于DNA条形码技术常见肉类掺假鉴别技术的研究

根据市场上常见的肉类掺假情况,本研究通过提取生鲜牛肉、羊肉、猪肉和鸭肉基因组DNA,按一定比例进行预混合,构建牛肉掺猪肉、羊肉掺猪肉、牛肉掺鸭肉和羊肉掺鸭肉4种掺假模型。通过引物COI-1和COI-2进行PCR扩增和测序比对,建立基于COI基因的动物源性食品的掺假判别方法。根据实验所得纯肉DNA提取率T实现DNA水平到肉水平掺假比例的换算。在肉的掺假水平上,引物COI-2检测效果较好,对牛-猪、羊-猪、牛-鸭和羊-鸭模型掺假物的检出限分别为5%、8%、1%和4%。对采集的28个批次的肉制品进行检测,结果表明:28个样品中89%的样品与产品标签标识的成分相符。建立的基于DNA条形码技术的检测方法可作为一种简单、快速、有效的分子鉴定技术,可以直接应用于研究物源性食品的种类和掺假鉴定。     

基于SSR标记技术对3种国产绵羊肉的品种鉴别分析

提取纯种宁夏滩羊、纯种新疆细毛羊和纯种藏绵羊的肝脏DNA,并进行文库构建、扩增、纯化和质控.检测序列中的简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)位点,设计合成并筛选50对引物进行聚合酶链式反应扩增并使用毛细管电泳检测SSR分型后,挑选多态性引物对宁夏滩羊、新疆细毛羊和藏绵羊样本进行遗传多态...     

一对同时鉴定8种动物源性成分的通用引物的制备及应用

肉类真假鉴定是食品检测工作的内容之一,目前已有多种基于PCR的肉类鉴定方法,但是鉴定种类和效率受限。本研究设计了一对基于普通PCR技术可同时鉴定8种动物源性成分的通用引物并建立了鉴定方法。该引物以线粒体DNA为靶标,利用扩增产物中不同物种间的插入缺失多态性片段大小即可鉴定山羊、绵羊、鹿、水牛、牛、牦牛、猪和骆驼8个物种,扩增后分别得到728 bp、704 bp、504 bp、453 bp、448 bp、431 bp、396 bp和326 bp的片段,每种PCR产物经SspI酶切后产生数量和大小不同的片段,可以进一步清晰鉴别8个物种。引物特异性测试表明和其他常见肉类动物DNA无交叉反应,DNA检测最低限度在0.01~0.05 ng。应用本方法对40份市场肉类及产品的检测表明,羊肉串、羊肉卷以及特色畜产品如驼肉、鹿肉和驴肉存在较多的掺假行为。与其他现有PCR检测方法相比,该方法具有简便易行和高通量的优点,可以作为肉类掺假筛选检测的常规方法。     

利用线粒体DNA Cyt b基因PCR-RFLP分析方法鉴别羊肉和鸭肉

建立了一种利用线粒体DNA（mtDNA） Cyt b基因PCR-RFLP分析来鉴别羊肉和鸭肉的方法。采用一对通用引物扩增绵羊、山羊和鸭的mtDNACytb基因,并对扩增产物用DNA限制性内切酶Bsu36I和SpeI进行酶切,电泳分析酶切产物的变化。结果表明通用引物可扩增羊和鸭472bp的PCR产物,经两种内切酶酶切后,绵羊、山羊和鸭的PCR产物分别被切为大小不同的片段,其中绵羊和山羊被SpeI切为213bp和259bp,而鸭则被Bsu36I切为95bp和377bp。利用PCR-RFLP分析mtDNA Cyt b基因的方法操作简单,是一种快速鉴别羊肉和鸭肉的可靠方法。      

DNA条形码在肉制品掺伪中非定向筛查技术的研究

目的对基于DNA条形码的肉制品掺伪中非定向筛选技术进行探索。方法以线粒体基因组中COI基因为靶标,设计猪、牛、羊、马、鸡、鸭、鹅、鼠8种动物源物种间的通用引物和特异性引物,建立禽畜肉的DNA条形码检测方法。同时应用该技术对50份市售的肉制品进行检测。结果本研究建立了DNA条形码筛选技术,电泳条带通过基因测序能正确识别猪、牛、羊、马、鸡、鸭、鹅、鼠8种动物源成分,结合分子克隆技术能实现对混合肉的检测。50份市售肉制品的DNA条形码结果显示,16份掺杂了除牛羊肉以外的其他禽畜肉。结论 DNA条形码技术能打破传统标准中PCR法检测目标唯一性的局限,具有良好的应用前景。     

用通用引物扩增细胞色素b基因进行牦牛肉的鉴定

本研究的目的是建立牦牛和黄牛肉的基因水平鉴定方法。从牦牛、黄牛和四川几个地方黑山羊品种的肉中提取基因组DNA,采用一对通用引物扩增细胞色素b基因中一段长度为421bp的序列,并进行了克隆测序。结果显示,通用引物能很好地扩增不同动物细胞色素b基因,扩增片段序列在牦牛与黄牛之间存在差异较大,能用于这两种肉的鉴定;而在金堂黑山羊、白玉黑山羊和美姑黑山羊之间差异非常小。本研究建立了PCR-RFLP方法鉴定牦牛和黄牛肉,这对于动物保护以及来源不明的肉类产品的区分具有实际应用价值。     

A PCR-Based Assay for the Detection and Differentiation of Potential Fumonisin-Producing Fusarium verticillioides Isolated from Indian Maize Kernels

One hundred and three Fusarium isolates from maize samples collected from different districts of Karnataka state, India, were analyzed with genus-specific, species-specific, and potential fumonisin specific oligonucleotide primers. One set of genus-specific primers ITS F and ITS R based on a highly conserved ITS region of the genus Fusarium were used to differentiate Fusarium species from closely related genera. All the Fusarium species tested scored positive with the ITS pair of primers. Detection and identification of Fusarium verticillioides species was done by using a newly designed reverse primer VERT-R (5′- CGA CTC ACG GCC AGG AAA CC ?3′) based on an intergenic spacer sequence (IGS) combined with an already designed forward primer VERTF-1 (5′-GCG GGA ATT CAA AAG TGG CC -3′) published previously. Out of 103 Fusarium species tested, 83 isolates of F. verticillioides scored positive for VERTF-1/ VERT-R species-specific pair of primers. Further to discriminate potential fumonisin-producing and nonproducing strains of F. verticillioides, the VERTF-1/VERTF-2 set of primers [VERTF-1 (5′-GCG GGA ATT CAA AAG TGG CC -3′) and VERTF-2 (5′-GAG GGC GCG AAA CGG ATC GG -3′)] were used. 64 isolates of F. verticillioides scored positive for VERTF-1/ VERTF-2 pair of primers. In total, three primers, one forward primer VERTF-1 and two reverse primers VERT-R and VERTF-2, were used for the confirmation of F. verticillioides up to the species level and the second pair of primers were used to confirm the potential for fumonisin production. The developed PCR assay should provide a powerful tool for the detection and differentiation of potential fumonisin-producing F. verticillioides strains in a population.     

基于实时荧光PCR对肉制品中羊肉的精确定量

该研究将实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescence quantitative PCR,r PCR)与微滴式数字PCR技术(micro-droplet digital PCR,dd PCR)相结合,利用dd PCR建立拷贝数和羊肉质量的函数关系,确立了基于r PCR定量检测羊肉含量的方法。特异性实验结果表明,除绵羊和山羊外,非目标物种DNA未出现特异性扩增;灵敏度实验结果表明,该方法的最低检出限为0. 01 ng/μL;通过对已知成分的混合样品和市售样品的检测表明,该方法能够对含量在5%以上的羊肉进行准确定量。因此,该方法在肉制品中羊肉含量检测和掺假鉴别方面具有较好应用潜力。     

Polymerase chain reaction assay for detection of sheep and goat meats

Polymerase Chain Reaction (PCR) was applied to a qualitative differentiation between sheep, goat and bovine meats. Oligonucleotide primers were designed for the amplification of sheep satellite I DNA sequence. The PCR amplified 374 bp fragments from sheep and goat DNA, but no fragment from bovine, water buffalo, sika deer, pig, horse, rabbit and chicken DNA. Sheep DNA (10 pg) was detected by 4% agarose gel electrophoresis following PCR amplification. Althoug cooking of the sample meats reduced the PCR products, sheep DNA was detected in the meat heated at 120°C. In order to differentiate between sheep and goat meats, nucleotide sequences of the PCR products were determined directly by cycle sequencing. The sequence of PCR products showed 92% of homology between sheep and goat. They were differentiated by ApaI digestion of the PCR products because sheep had one ApaI site and goat had no site in the PCR products.     

Application of quantitative real-time PCR in the detection of prion-protein gene species-specific DNA sequences in animal meals and feedstuffs

This study describes a method for quantitative and species-specific detection of animal DNA from different species (cattle, sheep, goat, swine, and chicken) in animal feed and feed ingredients, including fish meals. A quantitative real-time PCR approach was carried out to characterize species-specific sequences based on the amplification of prion-protein sequence. Prion-protein species-specific primers and TaqMan probes were designed, and amplification protocols were optimized in order to discriminate the different species with short PCR amplicons. The real-time quantitative PCR approach was also compared to conventional species-specific PCR assays. The real-time quantitative assay allowed the detection of 10 pg of ruminant, swine, and poultry DNA extracted from meat samples processed at 130 degrees C for 40 min, 200 kPa. The origin of analyzed animal meals was characterized by the quantitative estimation of ruminant, swine, and poultry DNA. The TaqMan assay was used to quantify ruminant DNA in feedstuffs with 0.1% of meat and bone meal. In conclusion, the proposed molecular approach allowed the detection of species-specific DNA in animal meals and feedstuffs.     

A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay

The polymerase chain reaction (PCR) was applied to identify six meats (cattle, pig, chicken, sheep, goat and horse) as raw materials for products. By mixing seven primers in appropriate ratios, species-specific DNA fragments could be identified by only one multiplex PCR. A forward primer was designed on a conserved DNA sequence in the mitochondrial cytochrome b gene, and reverse primers on species-specific DNA sequences for each species. PCR primers were designed to give different length fragments from the six meats. The products showed species-specific DNA fragments of 157, 227, 274, 331, 398 and 439 bp from goat, chicken, cattle, sheep, pig and horse meats, respectively. Identification is possible by electrophoresis of PCR products. Cattle, pig, chicken, sheep and goat fragments were amplified from cooked meat heated at 100 or 120°C for 30 min, but horse DNA fragments could not be detected from the 120°C sample. Detection limits of the DNA samples were 0.25 ng for all meats.