传统分离培养结合DGGE技术研究新疆传统发酵酸驼乳中乳酸菌的多样性

目的:分析新疆传统发酵酸驼乳中乳酸菌多样性,为我国传统乳制品微生物资源的利用提供基础数据。方法:采用传统分离培养和基于16S r DNA的PCR-DGGE方法,对12份酸驼乳样品中分离出的87株可培养乳酸菌进行形态、生理生化结合16S r DNA分子法鉴定菌株;对DGGE图谱上的15条16S r DNA目标条带切胶回收测序。结果:传统培养法显示样品中乳酸菌总数在106~108CFU/m L之间,其中植物乳杆菌为优势菌群,次优势菌群为乳酸片球菌;通过DGGE目标条带序列分析与相似性比对,植物乳杆菌、瑞士乳杆菌丰度最高,是优势菌群。此外,鉴定出干酪乳杆菌、屎肠球菌、乳明串珠菌、芽孢杆菌。DGGE图谱显示:样品混合菌群中有5条条带无对应的纯菌株,而纯菌株在混合菌群的图谱上都有相应的条带。结论:传统分离培养与PCR-DGGE在分析优势细菌种群上结果一致,均为植物乳杆菌;用传统分离培养未鉴定到屎肠球菌和芽孢杆菌。DGGE图谱能更全面地反映样品中的弱势菌群,体现样品细菌多样性的真实水平。     

骆驼刺源产乳酸的地衣芽孢杆菌分离鉴定和菌株特性研究

为了探讨产乳酸的芽孢杆菌对青贮发酵的作用。以青贮三个月的豆科牧草疏叶骆驼刺为材料,进行MRS培养基分离、纯化细菌,革兰氏染色,芽孢染色,细胞形态学观察,生理生化特性鉴定和16S rDNA序列分析。结果显示,菌株杆状,G+,有芽孢,产乳酸;16S rDNA测序结果显示该菌株与模式菌株ATCC 14580的相似性为99.3%。结果表明,该菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。     

糙米发芽过程中优势细菌分离鉴定

研究糙米在发芽过程中细菌总数变化,分离、纯化、鉴定发芽糙米中优势细菌;以营养琼脂为培养基,采用十倍稀释法分离、纯化发芽糙米中优势细菌,并采用16S rDNA测序与基因比对方法鉴定发芽糙米优势细菌。发芽过程中,细菌总数先减少再增加,在发芽完成时,细菌总数达7.08×108 cfu/g;分离到1株优势细菌,该细菌菌株与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)16S rDNA序列相似性为99.5%;所以,发芽糙米存在食品安全隐患,必须控制糙米发芽过程中微生物。     

应用DGGE方法构建健康人粪便乳杆菌标准指纹图谱

从健康人的新鲜粪便样品中分离乳杆菌,鉴定属种后构建一种能够快速鉴定未知属种乳杆菌的标准指纹图谱.首先通过形态学观察及K2O2酶等生理生化试验对所分得菌株进行初步鉴定,然后利用16S rDNA序列同源性分析方法,对所分得菌株进行16S rDNA基因扩增与测序,测序结果与GenBank中该属内茵株的16S rDNA基因序列进行同源性分析,从而准确鉴定所分得菌株.最后,利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法构建标准指纹图谱.结果表明,从健康人新鲜粪便中分离得到8株乳杆茵,经鉴定,其中4株为植物乳杆菌,1株为卷曲乳杆菌,3株为发酵乳杆菌.所得标准指纹图谱中试验菌株大体被分成4类,与16S rDNA基因序列同源性分析结果相吻合.通过传统方法可以从健康成人的新鲜粪便中分离得到乳杆菌,传统方法与分子生物学方法相结合可以将其准确鉴定到种的水平.变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法可以在种的水平上作为快速鉴定乳杆菌的一种有效工具.     

浓香型白酒窖泥中一株产己酸功能菌的研究

以黄鹤楼酒业的优质窖泥为原材料,采用传统微生物分离方法即稀释涂布平板法和平板划线纯化法对窖泥微生物进行分离纯化,采用显微镜镜检手段对微生物做显色鉴定,通过对纯菌株进行16S rDNA测序进一步鉴定菌株的种属,通过气相色谱检测方法测定纯菌株发酵液中的己酸含量。试验结果为:筛选出1株高产己酸的功能菌并编号为Z-1,确定为硫胺素芽孢杆菌,单菌株发酵液中己酸总量达3.5 g/L。     

广谱拮抗菌株的筛选诱变及抗菌物质分离鉴定

分离和鉴定产生广谱抗菌活性物质的菌株,并对抗菌物质分离鉴定。通过形态学、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定菌株。采用紫外线-硫酸二乙酯化学复合诱变的方法,获得抗菌能力强、遗传稳定的高产菌株。分别用甲醇提取、凝胶过滤色谱（Sephadex G-10）和半制备高效液相色谱分离纯化抗菌物质,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）技术对抗菌物质鉴定。本研究从土壤中分离出67 株芽孢杆菌。其中8 株表现出较强的抗菌作用,菌株XF32表现出显著广谱抑制活性,并鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。菌株XF32对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌7 种病原菌具有抗菌活性,对酿酒酵母、黑曲霉、深绿木霉和尖孢镰刀菌有抗真菌活性。经诱变筛选得到突变菌株XF32-22,对金黄色葡萄球菌的抑菌活性比原始菌株显著提高,分离纯化抗菌物质,得到单一的抗菌成分。MALDI-TOF-MS分析表明抗菌物质为Fengycin系脂肽化合物。采用复合诱变技术,可以有效地提高地衣芽孢杆菌脂肽的产量。成功分离得到对多种病原细菌具有较强抑制作用的Fengycin类脂肽,同时该菌株在拮抗植物病原真菌方面也有明显效果。XF32-22菌株在食品保鲜和农业生物防治方面具有很好的应用前景。     

细菌型豆豉发酵菌株的鉴定

为了明确细菌型豆豉发酵菌株的身份,首先采用形态及生理生化方法进行鉴定,接着提取该菌株的基因组DNA,并根据芽孢杆菌属16S rDNA序列两端的保守性片段设计引物,然后用PCR方法扩增出16S rDNA部分序列,纯化、测序,最后经BLAST搜索进行序列比对和构建系统进化树.结果表明,菌株BBDC3为革兰氏阳性芽孢杆菌,生理生化特征与枯草芽孢杆菌相符;扩增出的16S rDNA部分序列长为1344bp,与序列号为EF488171的枯草芽孢杆菌16SrDNA序列的相似度最高,为99%;系统进化树中,菌株BBDC3与枯草芽孢杆菌AB018487在同一分支.因此,菌株BBI)C3属于枯草芽孢杆菌.     

东北膜荚黄芪内生细菌的分离及其活性代谢物分析

研究北芪内生细菌及其次生代谢产物,旨在深入开发新资源。采用平板分离法从北芪中分离内生细菌,利用滤纸片法测定北芪内生细菌的抑菌活性。以芒柄花素及北芪生药为对照,采用HPLC法分析北芪内生细菌活性代谢物。同时对筛选出的目的菌株结合形态特征观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析进行菌种鉴定。所得北芪内生细菌中,有31株内生细菌发酵液对11株试验菌表现出不同的抑菌活性,占总分离菌株的86.11%。HPLC分析表明,2株内生细菌发酵产物与北芪生药样品在相同保留时间内有相应的色谱峰出现,其中菌株HX8经鉴定为甲基营养型芽孢杆菌。北芪内生细菌具有较好的抑菌活性,其中内生细菌HX8发酵产生北芪活性成分或类似化合物,这为利用内生菌发酵生产北芪活性成分提供了新思路和途径。     

基于传统分离培养和高通量测序分析市售咸鳓鱼中微生物多样性

以6种浙东地区市售咸鳓鱼为对象,采用分离培养的方法结合16S rDNA V4可变区高通量测序较为全面地探究其中微生物多样性,并且分析分离菌株氨基酸脱羧酶基因及常见抗生素耐药基因携带情况。试验共分离获得151株可培养细菌,16S rDNA测序将其鉴定至14个属和23个种,其中芽孢杆菌数量最多(98株,64.90%);葡萄球菌其次(20株,13.25%);嗜冷杆菌次之(13株,8.61%)。132株分离菌株携带组氨酸脱羧酶基因,占比高达87.42%;鸟氨酸脱羧酶基因和赖氨酸脱羧酶基因的携带比例分别为46.36%和45.03%。耐药基因携带率处于较低水平。高通量测序研究结果表明,门水平上,厚壁菌门(Firmicutes)是市售咸鳓鱼中主要优势微生物。碱杆菌属(Alkalibacillus)、慢性芽孢杆菌属(Lentibacilus)、狭义梭菌属(Clostridium sensu stricto)、梭菌属(Clostridiaceae)等分别在不同样品中占据较高比例,不同来源样品中微生物多样性呈现出较大的差异。     

羽绒制品中亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的分离鉴定

介绍了从羽绒制品中分离主要污染微生物亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的过程,从形态、生理生化和16SrDNA同源性等方面对分离菌株进行鉴定。分离菌株为革兰氏阳性菌,产芽孢,触酶阴性;经API 20A系统鉴定为索氏梭菌,鉴定结果的可信度为99.7%。16S rDNA序列分析表明,分离菌株与索氏梭菌同源性最高,序列同源性高达100%。确定分离的亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌为索氏梭菌。     

醋醅中分离菌株W321种属鉴定的研究

试验以从醋醅中分离纯化到的菌株W321为研究对象,为进一步开发利用这一菌株,根据菌株W321的形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列,对其进行种属鉴定的研究.经形态与生理生化鉴定菌株W321属于芽孢杆菌属,16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的同源性达到了99％,表明与枯草芽孢杆菌极为相似,因而将菌株W.鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).     

一株葡聚糖酶产生菌的分离选育及鉴定

利用葡聚糖平板初筛,三角摇瓶复筛,从土壤样品中中分离得到一株葡聚糖酶高产菌株P5,发酵酶活力可以达到2.5U/mL。菌株呈长杆状、革兰氏染色阳性、产芽孢;生理生化实验结果表明该菌株与枯草芽孢杆菌最为相近;16S rDNA基因序列包含1510个碱基对,同源性分析显示该菌株与枯草芽孢杆菌菌株最为相近,最高相似性为99%,基于16S rDNA基因序列的系统发育分析显示,该菌株与枯草芽孢杆菌菌株CD-6及YPM8的亲缘关系最近,根据以上多相分类结果鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。     

豆豉中产甲基萘醌菌株分离、筛选及其鉴定

通过平板初筛,从江西产发酵型豆豉中分离得到29株芽孢杆菌。经过高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)初步定性定量检测,得16株产甲基萘醌菌株,其中DC-1为甲基萘醌(menaquinone,MK)产量较高菌株,确定为目标菌株。通过液质连用(liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)对DC-1菌株代谢产物分析,确定产物为MK-7。该菌株经形态学,生理生化试验,分子生物学试验和16S rDNA基因序列比对结果分析,鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis DC-1。通过该菌株初步发酵检测结果表明,发酵培时间为4 d时,Bacillus subtilis DC-1代谢物MK-7产量最高,可达到0.416 mg/L,为生物发酵生产MK-7提供了有利的微生物资源。     

利用16S rRNA序列鉴定分离自芽菜中的芽孢杆菌

从宜宾芽菜中分离优势菌群,选取4株芽孢杆菌,分别为B1、B2、B3、B4.对4株菌的16S rRNA基因经PCR扩增测序,将测序结果同该属内菌株的16S rRNA序列作多序列比较,并建立芽孢杆菌属的系统发育树.结合细菌形态学生理生化特性鉴定结果,结果表明菌株B1、B3为枯草芽孢杆菌,菌株B2为解淀粉芽孢杆菌,菌株B4为乙酰微小杆菌.     

一株源于果园Alicyclobacillus的分离、鉴定及其生物学特性

目的:为了解脂环酸芽孢杆菌在果园土壤中的分布情况,对陕西果园土壤进行研究。方法:以酸化的YSG培养基分离培养脂环酸芽孢杆菌,观察菌株形态,测定生理生化特性,应用API 50CHB及API ZYM系统测定糖酵解和酶反应,以气相色谱(GC)分析脂肪酸组成,并以16S rDNA序列分析法构建系统发育树。结果:分离菌株与标准菌株的形态基本一致,酶谱有很大的相似性但糖酵解反应差异较大;16S rDNA序列分析显示,分离菌株与标准菌株属于同一属的不同种,分离菌与Alicyclobacillus contaminans的同源性达到99%。结论:采用国际通用的脂环酸芽孢杆菌的分离方法,结合API系统、脂肪酸组成分析及16S rDNA序列分析,可以快速的将分离菌鉴定到种;脂环酸芽孢杆菌在果园土壤中确有分布,可能对果汁质量造成威胁。     

腐败醋中微生物的分离鉴定及乳酸链球菌素对其抑制作用

从腐败醋中分离出84 株不同微生物菌株,通过对其形态学观察、革兰氏染色、16S rDNA测序,并与GenBank中已知序列进行比对,以及进一步测定16S～23S ITS,发现其由20 株解淀粉芽孢杆菌、12 株地衣芽孢杆菌、6 株芽孢杆菌属1NLA3E、12 株蜡样芽孢杆菌、4 株巨大芽孢杆菌、3 株短短芽孢杆菌、2 株短小芽孢杆菌、11 株凝结芽孢杆菌、12 株类芽孢杆菌、1 株耐酸乳酸菌、1 株产气荚膜梭菌组成。除耐酸乳酸菌外,均为革兰氏阳性芽孢杆菌。通过管碟法和比浊法测定了乳酸链球菌素（Nisin）对以上菌株的抑菌效价,显示Nisin对腐败醋中分离得到的微生物菌株均具有明显的抑菌或杀菌活性。     

臭豆腐卤水微生物群落及其接种发酵

对样品臭豆腐卤水中微生物分离,应用传统微生物鉴定、细菌16S rRNA鉴定,探索不同微生物种属组成结构对臭豆腐品质作用以及风味的影响。分离鉴定了臭豆腐卤水中的主要细菌为漫游球菌（Vagococcus carniphilus）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter sp.）、沙克乳杆菌（Lactobacillus sakei）、地衣芽孢杆菌（Enterococcus avium）、鸟肠球菌（Enterococcus devriesei）,并在无菌条件下采用纯菌种以及混合菌种直接进行豆腐发酵。单一菌种发酵比混合菌种发酵的臭卤所制得的臭豆腐总体感官评价结果偏低。除空白发酵结果以外,菌株St2（嗜冷杆菌）发酵的臭豆腐样品总体评价最差。菌株St5（鸟肠球菌）发酵所得的臭豆腐样品色泽较好,香气成分也较浓郁。     

喀什帕米尔高原牦牛乳传统发酵生奶酪中微生物多样性及分子鉴定

目的:研究喀什帕米尔高原塔县地区传统牦牛乳发酵生奶酪中微生物的多样性和菌群结构。方法:从帕米尔高原区不同牧民家庭中采集6份生奶酪样品,采用高通量测序技术分析其微生物多样性。通过纯培养方法分离传统牦牛乳发酵生奶酪样品中的菌种,采用传统分类与16S rDNA序列测定和26S rDNA D1/D2间隔区序列测定方法对分离的细菌和酵母菌进行种属鉴定。结果:通过细菌的16S rDNA基因V3-V4区测序,共获优化序列945 432。通过真菌的ITS区域测序,共获优化序列1 302 962。在属水平上,优势细菌属为乳杆菌属和链球菌属,优势真菌属为克鲁维酵母属、有孢圆酵母属、伊萨酵母属和未分类的真菌类群。根据主坐标轴分析,6份样品的群落结构间既有相似性又有差异性。在MRS和MC培养基中共分离52株细菌,在YGC培养基上共分离46株酵母菌,通过细菌16S rDNA序列和真菌26S rDNA D1/D2隔间区序列分析,将52株细菌归为7个属11个种,分别是耐久肠球菌、粪肠球菌、热带芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、类副粘杆菌、希腊假单胞菌、副干酪乳杆菌、鸡乳杆菌、霍氏肠杆菌、细黄链霉菌、表皮葡萄球菌。将46株酵母菌归为8个属9个种,分别是解脂耶氏酵母、诞沫假丝酵母、发酵毕赤酵母、库德毕赤酵母、普兰久浩酵母、异常威克汉逊酵母、马克思克鲁维酵母、东方伊萨酵母、酿酒酵母。本研究首次对帕米尔高原地区传统发酵乳制品中微生物资源进行分析,其结果可为该地区发酵乳制品的研究提供参考。需要进一步更系统的的深入研究挖掘。     

贵州浓香型白酒窖池可培养细菌系统发育分析

从贵州某名酒厂浓香型白酒窖泥和酒醅中分离到477 株细菌,通过形态特征和生理特性检测等传统方法鉴定,发现绝大多数为芽孢杆菌(446 株),占总细菌株数的93.50 %,将形态和生理生化特征一致的芽孢杆菌归类为XJ-1～XJ-20二十大类群.并采用16S rDNA序列分析和测序,构建系统发育树.结果表明,芽孢杆菌属菌株中,以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为主,占总芽孢杆菌数的32.96 %;枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) 和栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)也占有相当的比例,还有一定数量的Bacillus niabensis和巴达维亚芽孢杆菌(Bacillus bataviensis)以及少量的球状芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)和不确定种芽孢杆菌(Bacillus sp.).除芽孢杆菌属菌株之外,还分离出极少量的短短芽孢杆菌属(Brevibacillus)的不确定种菌株,占已分离总芽孢杆菌数的1.57 %.表明贵州地区浓香型白酒窖池中微生物具有明显的多样性,且地衣芽孢杆菌为其明显的优势种群,这和四川境内酒厂中的微生物类群相似,但也有区别.     

婴幼儿配方奶粉中的菌相分析

从市场上随机抽取不同生产厂家的婴幼儿奶粉,通过菌落总数测定,单菌落的分离,利用细菌通用引物27f/1492r对不同菌株进行16S rDNA片段扩增、测序,建立菌株的系统发育树进行分析。结果表明,婴幼儿配方奶粉中主要有地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium),其中,地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)为优势菌种。说明婴幼儿配方奶粉中存在的微生物主要为芽孢杆菌。